劉雪婷，王子媛，劉繼明，劉忠軍，郭 壯，侯強川*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.湖北省石花釀酒股份有限公司，湖北 襄陽 441705）

中國白酒歷史悠久，根據(jù)香型的不同可以分為濃香型白酒、清香型白酒、醬香型白酒等[1]，由于釀造工藝不同，不同香型白酒的口感和風(fēng)味也存在較大差異[2]。長期以來，清香型白酒因其具有的獨特果香和花香風(fēng)味而受到消費者喜愛。清香型白酒以高粱等谷物為主要原料，以大曲為糖化發(fā)酵劑，采用清蒸清糟釀造工藝、固態(tài)地缸發(fā)酵、蒸餾、二渣發(fā)酵和勾兌而成。清香型白酒大曲微生物組成十分復(fù)雜，除含有產(chǎn)淀粉酶的霉菌、合成酒精的酵母菌外，還含有豐富的細菌，如芽孢桿菌和乳酸菌等，這些微生物對于產(chǎn)品最終的品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。目前，國內(nèi)的學(xué)者以酒醅為研究對象，對其中的微生物群系開展了一些研究，如李欣等[3]通過高通量測序技術(shù)對醬香型白酒酒醅進行分析發(fā)現(xiàn)，酒醅中的優(yōu)勢微生物是乳桿菌屬、醋酸桿菌屬、青霉菌屬等。楊磊等[4]通過對沉香型白酒的上下層酒醅進行分析發(fā)現(xiàn)上層酒醅中細菌的多樣性較下層酒醅更為豐富，而乳酸桿菌屬是上下層酒醅的優(yōu)勢細菌屬，然而目前針對清香型白酒酒醅中細菌群落結(jié)構(gòu)的研究尚少。

目前，研究者對環(huán)境中微生物菌株的分離主要基于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，而對于樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的解析則多采用基于測序技術(shù)的非培養(yǎng)方法[5]。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)對于獲取樣本中的細菌菌株必不可少，這是后續(xù)進一步篩選優(yōu)良發(fā)酵菌株的基礎(chǔ)。以測序技術(shù)為代表的非培養(yǎng)方法可以解析更多不可培養(yǎng)微生物，極大的提高了人們對樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)的認識。在眾多測序技術(shù)中，Illumina MiSeq高通量測序具有通量大、準確度高等優(yōu)點[6]，是目前使用最為廣泛的測序技術(shù)之一，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛的運用于白酒[7]和腐乳[8]等發(fā)酵食品領(lǐng)域。

本研究從湖北省襄陽市石花酒廠中采集了5份清香型白酒酒醅樣品，采用純培養(yǎng)技術(shù)，對酒醅中的乳酸菌和芽孢桿菌進行了分離鑒定，同時通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)解析清香型白酒酒醅細菌群落結(jié)構(gòu)，為適用于清香型白酒發(fā)酵的優(yōu)良菌株篩選奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅：采集自湖北省石花釀酒股份有限公司的5份清香型白酒的酒醅樣品，分別命名為SH1、SH2、SH3、SH4以及SH5；樣品采集后裝入采樣袋并迅速置于含有冰袋的采樣箱，冷鏈運送回實驗室于24 h內(nèi)完成所有樣品宏基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取。

1.1.2 試劑

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；MRS培養(yǎng)基、R2A瓊脂培養(yǎng)基、石蕊牛乳培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；引物27F/1495R和M13F（-47）/M13R（-48）：武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RE臺式冷凍離心機：日本HITACHI公司；Veriti梯度聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Life公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Thermo公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；R930機架式服務(wù)器：美國Dell公司；DG250厭氧工作站：英國Don Whitley公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌和芽孢桿菌的分離鑒定

取10 g酒醅樣品于90 mL石蕊牛乳培養(yǎng)基中，搖勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用倍比稀釋法將富集培養(yǎng)后的酒醅樣品用生理鹽水稀釋至10-3～10-6梯度，其中一份稀釋樣品涂布于含1%碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基用于乳酸菌的分離。另一份稀釋液在75 ℃條件下水浴15 min，然后涂布于R2A瓊脂培養(yǎng)基中用于芽孢桿菌的分離。將用于乳酸菌分離的固體培養(yǎng)基倒置于37 ℃的厭氧工作站中培養(yǎng)48 h（厭氧條件為85%N2，10%H2以及5%CO2），而將用于芽孢桿菌分離的固體培養(yǎng)基倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。隨后將固體培養(yǎng)基中菌落總數(shù)在30～300個的平板用于菌落挑選，盡量挑選顏色、形態(tài)和大小均不相同的單菌落，同時乳酸菌菌落需要有溶鈣圈。根據(jù)三區(qū)劃線法將乳酸菌和芽孢桿菌單菌落分別在MRS固體平板和R2A固體平板中連續(xù)劃線3次后，將過氧化氫酶陰性及革蘭氏陽性的疑似乳酸菌菌株和經(jīng)過芽孢染色鏡檢后的疑似芽孢菌株用30%的甘油進行保存處理。分別參照李娜等[9-10]的方法，提取疑似乳酸菌和芽孢桿菌菌株DNA，并進行PCR擴增。將經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳合格的PCR樣品進行純化后寄往武漢天一輝遠有限公司進行測序，將返回的測序序列通過美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站進行基本局部比對搜索工具（basic localalignment search tool，BLAST）同源比對分析，并根據(jù)MEGA7.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，判定目的菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.3.2 宏基因組DNA的提取及Illumina MiSeq測序

參照沈馨等[11]的方法，采用QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro Kit 基因組提取試劑盒對酒醅樣品進行宏基因組DNA的提取，以其為模板，使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對樣品16S rRNA V3-V4區(qū)域進行PCR擴增。擴增結(jié)束后，將檢測合格的PCR產(chǎn)物寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

將返回的序列根據(jù)核苷酸標簽（barcode）信息分配到各個樣品中，同時去除barcode和引物。參照王玉榮等[12]的方法進行質(zhì)控，去除嵌合體序列以及堿基錯配序列。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控后，使用QIIME（V1.9.1）平臺進行后續(xù)生物信息學(xué)分析。具體步驟如下：將高質(zhì)量的序列進行標準比對和對齊[13]，根據(jù)97%的相似度進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT）聚類，去除屬于嵌合體的OTU序列。使用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）classifier結(jié)合目前最常用的RDP Release 11.5[14]、Greengene（Version 13.8）[15]和Sliva（Version 132）[16]數(shù)據(jù)庫進行同源性比對確定各OTU的分類學(xué)地位，使用內(nèi)部腳本整合三個數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，確定各OTU的最終分類學(xué)地位。

1.3.4 統(tǒng)計分析

使用R繪制Upset圖和瀑布圖，使用BioEdit和MEGA7.0（http：//www.megasoftware.net/）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Origin（V8.6）軟件完成柱形圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

本研究共從5份酒醅樣品中分離得到13株疑似乳酸菌菌株。所有菌株均可形成溶鈣圈，經(jīng)革蘭氏染色呈陽性，過氧化氫酶試驗為陰性。在提取菌株DNA的基礎(chǔ)上，利用16S rRNA序列分析方法對其進行鑒定，分離株和標準菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

圖1 基于16S rRNA基因序列13株乳酸菌與標準菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 13 strains of lactic acid bacteria and standard strains based on 16S rRNA gene sequences

由圖1可知，13株乳酸菌分離株分別鑒定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）4 株、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）3 株、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）3 株、糞腸球菌（Enterococcus faecium）2 株、希爾氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）1 株，所有菌株與標準菌株的同源性均在99%以上。

2.2 芽孢桿菌的分離與鑒定

本研究共分離得到17株疑似芽孢桿菌（Bacillus）菌株，將各菌株提取DNA后，利用16S rRNA序列分析方法對其進行鑒定，分離菌株和標準菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 基于16S rRNA基因序列17株芽孢桿菌與標準菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 17 strains of Bacillus and standard strains based on 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，分離得到的17株菌株分別鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）9 株、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）2 株、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）2 株、澳洲芽孢桿菌（Bacillus australimaris）2 株、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）1株以及蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）1株，其同源性均達到99%以上。

2.3 基于門和屬水平的清香型白酒酒醅細菌群落結(jié)構(gòu)分析

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對酒醅樣品進行細菌群落結(jié)構(gòu)評價，共產(chǎn)生180 749條高質(zhì)量序列，平均每個酒醅樣品產(chǎn)生36 150條序列。在細菌門水平，平均相對含量大于0.5%的細菌門在各樣品中的分布如圖3所示。

圖3 優(yōu)勢細菌門相對含量分析Fig.3 Analysis of relative abundance of dominant bacteria phylum

由圖3可知，酒醅樣品中最為豐富的細菌門是厚壁菌門（Firmicutes），其相對含量為97.96%，其次分別為放線菌門（Actinobacteria）（1.24%）和變形菌門（Proteobacteria）（0.76%）。由此可見，酒醅中的厚壁菌門占絕對優(yōu)勢地位。進一步對優(yōu)勢細菌屬的分布進行分析，各優(yōu)勢細菌屬相對含量的柱形圖如圖4所示。

圖4 優(yōu)勢細菌屬相對含量分析Fig.4 Analysis of relative abundance of dominant bacteria genus

由圖4可知，酒醅樣品中的優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、嗜熱菌屬（Thermoleophilum）和假單胞菌屬（Pseudomonas），上述菌屬的平均相對含量分別為97.42%、1.22%和0.72%。

2.4 酒醅中細菌在OTU水平的特征

在97%的條件下劃分OTU并去除嵌合體后，共得到3 761個OTU。本研究將僅在某一樣品中出現(xiàn)的OTU定義為該樣品的特有OTU，將在所有樣品中均出現(xiàn)的OTU定義為酒醅的核心OTU。OTU水平的UpSet分析如圖5所示。

圖5 基于OTU的UpSet分析Fig.5 UpSet analysis based on OTU

由圖5可知，SH3中總的OTU數(shù)量和特有OTU數(shù)量最為豐富，其特有OTU數(shù)量為798個，其次為SH5、SH4、SH1和SH2，其數(shù)量分別為588個、557個、505個和418個。值得注意的是，酒醅中的核心OTU有280個，其中的257個核心OTU主要注釋結(jié)果為乳桿菌屬（Lactobacillus），另有少數(shù)OTU注釋為假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和嗜熱菌屬（Thermoleophilum），核心OTU中包含的序列占總測序序列數(shù)的96.60%。由此可見，雖然不同酒醅樣品中微生物的豐度存在一定的差異，但是核心OTU組成相似，且在樣品中占有較高的比例。本研究將平均相對含量大于0.5%的核心OTU定義為核心優(yōu)勢OTU，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有8個OTU滿足該閾值條件，這些OTU在樣品中的平均相對含量分析如圖6所示。

圖6 基于核心優(yōu)勢OTU的瀑布圖Fig.6 Waterfall chart based on core advantage OTU

由圖6可知，酒醅樣品中的核心優(yōu)勢OTU中的6個可以注釋為乳桿菌屬（Lactobacillus），另有兩個OTU分別注釋為嗜熱菌屬（Thermoleophilum）和假單胞菌屬（Pseudomonas），該結(jié)果表明乳酸桿菌在清香型白酒酒醅中占據(jù)核心地位，預(yù)示著其在酒醅的發(fā)酵過程中可能起著非常重要的作用。

3 討論

酒醅是正在發(fā)酵或已發(fā)酵好的固體物料，酒醅的質(zhì)量直接決定了清香型白酒的質(zhì)量。酒醅在堆積的過程中，除了利用大曲中的微生物外，還能夠吸附空氣以及生產(chǎn)環(huán)境中的微生物，這些微生物共同決定了成品酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)。因此，全面解析清香型白酒酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)對于后期改善清香型白酒風(fēng)味和品質(zhì)有重要作用。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對清香型白酒酒醅中的微生物群落結(jié)構(gòu)進行解析發(fā)現(xiàn)，酒醅樣品中的優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、嗜熱菌屬（Thermoleophilum）和假單胞菌屬（Pseudomonas），上述菌屬累計相對含量占細菌總數(shù)99%以上，表明乳酸菌是清香型白酒的發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢細菌。王雪山等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、Kroppenstedtia和單胞菌屬（Pseudomonas）是清香型白酒酒醅中的優(yōu)勢菌屬，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）是發(fā)酵后期酒醅中的主要菌屬；賈麗艷等[18]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）在山西省杏花村某酒企清香型白酒酒醅中占據(jù)優(yōu)勢地位，上述研究結(jié)果與本研究接近。乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的細菌的統(tǒng)稱[19]，不僅在人體中發(fā)揮著重要的生理功能，在白酒的發(fā)酵過程中也是不可缺少的。乳酸菌在白酒發(fā)酵過程中對雜菌生長有一定的抑制作用，此外乳酸能夠和乙醇生成乳酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)，這是清香型白酒的主體風(fēng)味之一[20]。酒醅中含有豐富的嗜熱菌，這可能與釀酒發(fā)酵過程產(chǎn)生的高溫環(huán)境有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白水解酶，為美拉德反應(yīng)提供所需的氨基酸，生成香味以及香味的前體物質(zhì)[21]，從而在一定程度上影響發(fā)酵白酒的風(fēng)味。值得注意的是，假單胞菌屬（Pseudomonas）是很多清香型白酒酒醅樣品中的優(yōu)勢菌屬，該菌屬多數(shù)情況是條件致病菌，但其在清香型白酒釀造中的作用尚不清楚。

本研究通過傳統(tǒng)的分離技術(shù)從清香型酒醅樣品中分離鑒定出17株芽孢桿菌。然而Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)的結(jié)果顯示，芽孢桿菌在酒醅樣品中的相對含量較低，這與王雪山等[17-18]的研究結(jié)果一致。這種情況的出現(xiàn)可能與本研究芽孢桿菌分離過程中的水浴處理有很大關(guān)系，由于芽孢桿菌較為耐熱，水浴處理后大部分芽孢桿菌可以存活，而其他細菌被殺滅，提高了芽孢桿菌分離效率。芽孢桿菌是一類廣泛存在于環(huán)境中的微生物，由于其所具有的各種生理功能，已經(jīng)廣泛的運用于食品加工[22]和農(nóng)藥降解[23]等領(lǐng)域?，F(xiàn)在，越來越多的研究顯示，芽孢桿菌在白酒的釀造過程中占有重要的作用。芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中含有十幾種風(fēng)味物質(zhì)以及許多重要的酯類物質(zhì)[24]，楊帆等[25]通過對茅臺大曲中的3種芽孢桿菌進行研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌發(fā)酵后生成了乙偶姻、三甲基吡嗪等風(fēng)味成分，具有促進大曲風(fēng)味物質(zhì)形成的作用。此外，芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶和淀粉酶，在固態(tài)白酒的發(fā)酵過程中，能夠有效的降解蛋白和纖維等物質(zhì)，從而提高原料的利用率[26]。

4 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)以及傳統(tǒng)純培養(yǎng)的方法對清香型白酒酒醅的細菌群落進行全面解析，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、嗜熱菌屬（Thermoleophilum）和單胞菌屬（Pseudomonas），豐富了人們對清香型白酒酒醅細菌群落結(jié)構(gòu)的認識。所有酒醅樣品共分離得到13株乳酸菌以及17株芽孢桿菌，這為后續(xù)篩選適用于清香型白酒發(fā)酵的優(yōu)良菌株奠定了一定基礎(chǔ)。