郭依依，蔡 俊*

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068）

甲殼素（C8H13O5N）n又稱幾丁質(zhì)，是存在于各類甲殼動(dòng)物的外殼及真菌細(xì)胞壁中的一種難溶的N-乙酰-D-葡萄糖胺聚合物，其高度延伸的氫鍵半晶結(jié)構(gòu)使其難以溶于一般的稀酸稀堿及有機(jī)溶劑，這極大限制了甲殼素的應(yīng)用[1-2]。當(dāng)脫乙酰度達(dá)到50%時(shí)，甲殼素的溶解性能大大增強(qiáng)，當(dāng)脫乙酰度達(dá)到55%及以上時(shí)，則為殼聚糖。殼聚糖分子易于進(jìn)行化學(xué)修飾且溶解性能好，廣泛應(yīng)用于輕工業(yè)、美容業(yè)、農(nóng)業(yè)及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1-3]。

目前殼聚糖的制備方法主要為化學(xué)法，物理法?；瘜W(xué)法是在高溫條件下、利用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿來脫去甲殼素的乙?；?，不僅能耗高，污染環(huán)境、且得到的產(chǎn)品不穩(wěn)定（乙酰度不均勻，分子量變化大，乙?；谖恢貌还潭ǎ?，已逐漸被摒棄；物理法是通過輻射作用使甲殼素分子內(nèi)的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂而降解，有微波輻射和超聲輻射等，產(chǎn)物是分子量較寬的復(fù)雜混合物[3-4]。而利用甲殼素脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）（E.C.3.5.1.41）處理甲殼素能夠獲得高品質(zhì)的殼聚糖，且反應(yīng)過程綠色環(huán)保，因此尋找到高質(zhì)量CDA或產(chǎn)CDA菌株迫在眉睫。本文對(duì)CDA研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為今后的研究提供參考。

1 甲殼素脫乙酰酶的概述

1.1 理化性質(zhì)

不同來源的CDA在分子質(zhì)量、細(xì)胞內(nèi)的存在位置、最適溫度及pH值等方面存在較大差異[5-12]。部分微生物來源的CDA相關(guān)的理化性質(zhì)見表1。目前自然界中發(fā)現(xiàn)的CDA均為糖蛋白，通常分布于細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)空間或分泌到細(xì)胞外中；分子質(zhì)量為50～150 kDa；最適pH值在4.5～9.0；等電點(diǎn)多在2.5～5.0；最適溫度多為50 ℃；該酶對(duì)甲殼素低聚糖有活性，對(duì)結(jié)晶態(tài)的甲殼素底物沒有活性；不同種類或不同濃度的金屬離子對(duì)CDA活性的影響不同，如低濃度的Ca2+、Mn2+、K+對(duì)來源于紅球菌的CDA的酶活起促進(jìn)作用，但隨著濃度的升高逐漸呈抑制作用；CDA催化脫乙酰過程中會(huì)釋放出乙酸或乙酸鹽，因此受乙酸抑制的CDA不適合應(yīng)用于工業(yè)化脫乙酰。

表1 部分微生物來源的甲殼素脫乙酰酶的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical property of chitin deacetylase from some microbial sources

1.2 分類

CDA是一種專一性的用于甲殼素脫去乙?；奶酋ッ?。它和乙酰木聚糖酯酶（EC 3.1.1.72）、殼寡糖脫乙酰酶（EC 3.5.1.-）、肽聚糖脫乙酰酶（EC 3.5.1.-）和β-1,6-葡聚糖脫乙酰酶（EC 3.5.1-）等同屬糖酯酶4家族（carbohydrate esterase family 4，CE4）[13]。CE4家族酶的特點(diǎn)是：它們均可攻擊糖鏈分子上的酰胺鍵（非肽鍵），但具有不同的底物偏好性；它們都具有結(jié)瘤因子脫乙酰酶蛋白（deacetylase protein of nodular factor，NodB）同源結(jié)構(gòu)域（特征為（β/α）8桶折疊，即核心是7個(gè)或8個(gè)平行的β鏈，外周圍被α螺旋包圍形成扭曲的β桶。β桶裝飾的一系列環(huán)構(gòu)成了大部分碳水化合物的結(jié)合口袋）[14-15]。該區(qū)域通常由五個(gè)保守的基序定義：基序1（TFDD），由兩個(gè)連續(xù)的天冬氨酸殘基組成，可結(jié)合金屬配體?；? H（S/T）xxH中的絲氨酸（serine，Ser）或蘇氨酸（threonine，Thr）殘基與第二個(gè)組氨酸（histidine，His）形成氫鍵以穩(wěn)定活性位點(diǎn)的局部構(gòu)象。此外，來自基序1的天冬氨酸（aspartic acid，Asp）和基序2中的兩個(gè)His殘基共同構(gòu)成了His-His-Asp金屬結(jié)合三聯(lián)體?；?（RxPY）和基序4（DxxD（W/Y））共同構(gòu)成活性位點(diǎn)凹槽?；?I（V/I）LxHD為底物結(jié)合口袋。圖1將不同來源的CE4酶進(jìn)行序列比對(duì)驗(yàn)證了這一點(diǎn)，此外這5個(gè)基序的空間位置通過圖2的蛋白晶體結(jié)構(gòu)模型表示；都為金屬依賴性水解酶，具有Zn2+和Co2+作為最常見的金屬配體[16-17]。

CDA也屬于甲殼素酶系，甲殼素酶系是作用于甲殼素及其相關(guān)衍生物的酶的總稱，主要成員有甲殼素脫乙酰酶和甲殼素酶，CDA與甲殼素相關(guān)酶系聯(lián)用，可得到一系列具有生理活性的多糖產(chǎn)品[18]。如圖3所示，從作用底物聚合度n來看，甲殼二糖酶作用范圍最窄，其次為N-乙酰-β-葡萄糖胺酶、甲殼素酶，殼聚糖酶和CDA范圍最廣，n≥2的底物均可作用；從作用化學(xué)鍵來看，只有CDA可專一性脫去底物的乙酰基，得到殼聚糖及其他具有生理活性的寡聚體，其他酶則作用于糖苷鍵，使分子鏈斷裂，此功能往往可被溶菌酶、纖維素酶、蛋白酶和脂肪酶等其他非專一性酶類代替。

圖1 甲殼素脫乙酰酶催化域的多重序列比對(duì)結(jié)果Fig.1 Alignment results of multiple sequence of chitin deacetylase catalytic domains

圖2 基序1～5的空間位置在蛋白晶體結(jié)構(gòu)模型中的體現(xiàn)Fig.2 Reflection of spatial position of motif 1-5 in the crystal structure model of protein

圖3 甲殼素酶系作用關(guān)系圖Fig.3 Relation diagram of action of chitin-related enzymes

1.3 來源及生理學(xué)作用

CDA在真菌（如魯氏毛霉（Mucor rouxii）、藍(lán)色犁頭霉（Absidia coerulea）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）、豆刺盤孢（Colletotrichumlindemuthianum）、米根霉（Rhizopusoryzae）、總狀毛霉（Mucor racemosus）、黑根霉（Rhizopus nigricans）、短柄梨孢帚霉（Scopulariopsis brevicaulis）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、單胞銹菌屬（Uromyces）及啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等），細(xì)菌（如腸炎弧菌（Vibrio alginolyticus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和紅球菌（Rhodococcus）等），某些節(jié)肢動(dòng)物（昆蟲綱和甲殼綱，如Locusta migratoria、Hyphantria cunea、Exopalaemon carinicauda和Penaeus monodon等）中均有發(fā)現(xiàn)[5-12，19-21]。不同來源或相同來源不同基因編碼的CDA在作用時(shí)間、空間和效果上差異很大。CDA通過催化產(chǎn)生組成某些生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)殼聚糖和與分子識(shí)別有關(guān)（如細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和形態(tài)發(fā)生，充當(dāng)免疫應(yīng)答誘導(dǎo)子和宿主-病原體介體）的小分子寡聚體來發(fā)揮其生理學(xué)作用。下面從不同的來源具體闡述。

真菌：某些接合菌中，CDA與甲殼素合酶結(jié)合緊密。CDA攻擊后者產(chǎn)生的尚未形成晶態(tài)結(jié)構(gòu)的新生甲殼素，得到合成細(xì)胞壁、孢子壁和某些營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)中的殼聚糖[22]；某些分泌到胞外的CDA則在真菌自溶過程中發(fā)揮作用。它們協(xié)同甲殼素內(nèi)切酶（endochintinase）E.C.3.2.1.14水解細(xì)胞壁中的甲殼素，瓦解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[5]；真菌病原體的植物防御逃脫機(jī)制也與CDA的功能密切相關(guān)，真菌病原體在入侵植物后，其細(xì)胞壁上的甲殼素會(huì)被宿主識(shí)別作為入侵信號(hào)，并迅速觸發(fā)抗性反應(yīng)產(chǎn)生特異性抗體，而此時(shí)真菌會(huì)分泌一種內(nèi)源性CDA，通過改變細(xì)胞壁甲殼素的脫乙酰度（degree of deacetylation，DD）使之無法被特異性受體進(jìn)一步識(shí)別從而逃避植物的防御機(jī)制；類似的，一些昆蟲病原真菌的CDA具有修飾昆蟲表皮甲殼素使其易于滲透以及改變自身細(xì)胞壁以抵御昆蟲甲殼素酶的侵襲的雙重作用[14，23-24]。

細(xì)菌：細(xì)菌中，CDA存在于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，分泌到胞外的CDA通常參與環(huán)境中甲殼素的降解，如某些海洋細(xì)菌[25]。某些可使昆蟲致病的細(xì)菌也會(huì)分泌出CDA作用于昆蟲外殼或營(yíng)養(yǎng)器官，使其理化性質(zhì)發(fā)生改變從而實(shí)現(xiàn)侵染[26]；存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的CDA通常與分子識(shí)別有關(guān)，如根瘤菌和豆科植物的識(shí)別及結(jié)瘤過程中，根瘤菌吸附到寄主根毛上，然后由侵染線侵入寄主后誘發(fā)根瘤。在這個(gè)過程中，CDA與N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶以及酰基轉(zhuǎn)移酶等共同參與了結(jié)瘤因子（nodular factor，NF）的合成，這類因子可誘導(dǎo)宿主植物根毛卷曲和膨脹以便于根瘤菌的入侵[27]。

節(jié)肢動(dòng)物：CDA在昆蟲的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中都起著重要作用，如器官的形成、表皮甲殼素的修飾、正確蛻皮、誘導(dǎo)幼蟲轉(zhuǎn)化成蛹等，機(jī)體通過編碼CDA來軟化組織，實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)昆蟲針對(duì)不同的組織細(xì)胞（表皮細(xì)胞、胸肌細(xì)胞、腸內(nèi)壁細(xì)胞等），可以編碼不同類群的CDA蛋白，從而調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)[11-12，28]；同時(shí)CDA還參與某些甲殼類動(dòng)物的免疫機(jī)制，推測(cè)其機(jī)理是甲殼類動(dòng)物遭到侵染時(shí)，體內(nèi)CDA大量合成的殼聚糖（多陽(yáng)離子聚合物）可與病原菌細(xì)胞表面的生物大分子帶負(fù)電的側(cè)鏈相互作用，形成聚合物或直接進(jìn)入其細(xì)胞核，與DNA結(jié)合，影響mRNA和蛋白質(zhì)的合成來抑制病原菌的生長(zhǎng)[20-21]。

1.4 作用機(jī)理

CDA為典型的金屬依賴性水解酶，其催化機(jī)制為金屬輔助的酸/堿催化[17，29]。下面以VCC CDA催化甲殼二糖為例，探討CDA催化脫乙酰的一般過程。如圖4所示，催化過程中Zn2+、Asp40的羧基和His97和His101的咪唑基是催化作用所必需的。首先，活化水分子的親核氧原子攻擊底物羰基碳原子，同時(shí)D39作為廣義堿，從Zn2+-結(jié)合水吸取一個(gè)質(zhì)子，形成一個(gè)帶負(fù)電荷四面體過渡態(tài)中間物，通過Zn2+和His97、His101帶正電荷的側(cè)鏈的靜電相互作用給以穩(wěn)定。然后His295的咪唑基作為通用酸提供一個(gè)質(zhì)子給底物的-NH基，C-N鍵隨之?dāng)嗔训玫接坞x胺，并釋放出乙酸鹽[30]。

圖4 VcCDA·DP2絡(luò)合物中活性位點(diǎn)殘基的X射線結(jié)構(gòu)圖（A）及CE4脫乙酰酶的金屬輔助通用酸堿機(jī)制作用過程（B）Fig.4 X-ray structure diagram of active site residues in VcCDA·DP2 complex (A) and metal-assisted general acid-base mechanism process of CE4 deacetylase (B)

不同來源的CDA在催化過程中表現(xiàn)出不同的脫乙酰模式（deacetylation pattern，PA），即多重攻擊、多鏈和單鏈機(jī)制[31]。多重攻擊在毛霉中最為常見，CDA的作用過程大致如下：首先，酶隨機(jī)結(jié)合到底物分子鏈的任一序列上，然后以結(jié)合部位的非還原端為起點(diǎn)，沿著該鏈脫去乙?；?，水解完畢后，與底物解離，然后結(jié)合到另一條底物分子鏈上，開始新一輪的水解[7]。多鏈機(jī)制和多重攻擊類似，CDA隨機(jī)攻擊某一序列的任意位點(diǎn)，但是每次只能脫去一個(gè)乙?；闩c底物解離。單鏈機(jī)制是CDA酶識(shí)別底物的某一固定位點(diǎn)，然后與底物結(jié)合進(jìn)行連續(xù)的脫乙?；^程?？偟膩碚f，多重攻擊和多鏈機(jī)制為多位點(diǎn)作用，多重攻擊和單鏈機(jī)制可連續(xù)進(jìn)行乙酰化。這三種不同的脫乙酰模式往往會(huì)得到兩類產(chǎn)物，無擇優(yōu)攻擊的多鏈機(jī)制會(huì)產(chǎn)生單元隨機(jī)分布的二元雜多糖，即N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）和氨基葡萄糖（Glucosamine，GlcNH2）單元交替分布，而可連續(xù)脫乙酰的的多重攻擊機(jī)制和單鏈機(jī)制會(huì)產(chǎn)生嵌段共聚物，即以GlcNAc和GlcNH2為單元的聚合物鏈段交替分布[32]。

CDA對(duì)不同的底物其催化效果與速率有所差異。以甲殼素為例，天然甲殼素分子結(jié)構(gòu)致密，由一根長(zhǎng)鏈上的氨基與相鄰長(zhǎng)鏈上的羰基之間形成氫鍵而聚合。其分子聚合度（degree of polymerization，DA）、脫乙酰度和結(jié)晶度都會(huì)影響CDA脫乙酰效果。通常CDA對(duì)于分子質(zhì)量較小，脫乙酰度高，結(jié)晶度低的可溶性底物酶活更高[33]。

2 甲殼素脫乙酰酶菌的生產(chǎn)

2.1 產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶菌株的選育

CDA菌株的選育主要有三種途徑：自然篩選、誘變育種和構(gòu)建基因工程菌。CDA的自然來源很豐富，但天然獲得的CDA酶存在很多問題：野生型微生物產(chǎn)酶量低，粗酶液雜質(zhì)多，且多為胞內(nèi)酶，不易分離純化。并且某些物種能夠編碼的不同的CDA，其在功能和作用機(jī)制上都存在差異（如作用位點(diǎn)、攻擊方式、所得產(chǎn)物等），難以應(yīng)用于高端酶市場(chǎng)[5-10，19]。通過誘變選育產(chǎn)CDA菌株，雖然可以提高酶的產(chǎn)量，但誘變菌株通常情況下是不穩(wěn)定的[34]。目前這些不足均可以通過基因工程技術(shù)解決，首先通過基因工程手段可以將各種來源，從細(xì)菌到真核生物的CDA基因進(jìn)行表達(dá)研究，通過一系列的基因改造獲得酶學(xué)特性和產(chǎn)量穩(wěn)定的CDA，融合組氨酸標(biāo)簽（histidine-tag，His-Tag）以及谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽（glutathione S-transferase-tag，GST-tag）便于CDA的純化，甚至將CDA與殼聚糖酶融合表達(dá)，提高其應(yīng)用性能。

工程菌成功構(gòu)建例子較多，目前已在多種宿主中進(jìn)行表達(dá)，但多為大腸桿菌，而且用大腸桿菌表達(dá)時(shí)，常常會(huì)陷入包涵體表達(dá)的問題，所以需要挑選合適的載體，例如融合GST和麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）等，利于蛋白折疊；或使用分泌性表達(dá)載體[14，22，26]。同時(shí)由于CDA的來源廣，所以在跨種族進(jìn)行表達(dá)時(shí)，需要注意密碼子通用性的問題。如某些生物中的編碼氨基酸的密碼子，可能在大腸桿菌中為終止密碼子，如蜜蜂螺原體Spiroplasma melliferumCH-1的CDA基因中編碼色氨基酸的密碼子在大腸桿菌中為終止子[35]，所以必要時(shí)需要通過定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造，同時(shí)在遇到密碼子偏好性的問題導(dǎo)致蛋白表達(dá)量低時(shí)，針對(duì)大腸桿菌的密碼子優(yōu)化時(shí)必不可少。酵母菌也是常用的表達(dá)宿主之一，酵母菌擁有完整的分泌表達(dá)體系，能夠促使異源蛋白正確折疊，并分泌至胞外，其酵母表達(dá)系統(tǒng)具有糖基化的作用，不僅能提高異源蛋白的穩(wěn)定性，同時(shí)對(duì)其酶活提升也會(huì)有所幫助可能提高（有研究表明CDA為糖蛋白）。昆蟲表達(dá)系統(tǒng)是目前新興的表達(dá)系統(tǒng)，具有對(duì)外源蛋白折疊修飾的功能，且能表達(dá)具有內(nèi)含子的外源基因，其在表達(dá)昆蟲來源的CDA時(shí)具有天然的優(yōu)勢(shì)，孫曉彤等先后利用畢赤酵母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)甜菜夜蛾的CDA1（spodoptera exigua CDA1，SeCDA1）并在昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中獲得較好的表達(dá)效果，相比畢赤酵母提升了0.39倍[35]，同樣的，研究人員在表達(dá)家蠶CDA1（Bombyx moriCDA1、BmCDA1）、美國(guó)白蛾CDA1（Hyphantria cuneaCDA1，HcCDA1）、HcCDA2等昆蟲的CDA基因時(shí)也發(fā)現(xiàn)了昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)異性能[11-12]。而由于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)條件嚴(yán)苛，成本昂貴，并不適用于當(dāng)下大規(guī)模生產(chǎn)，但卻是今后表達(dá)CDA最具潛力的表達(dá)系統(tǒng)。

2.2 甲殼素脫乙酰酶的分離純化

CDA的分離純化方法根據(jù)酶蛋白存在的位置和生產(chǎn)菌株是否為基因工程菌而有所不同。分泌到胞外的CDA酶可直接從發(fā)酵上清液中提取。若發(fā)酵上清液中無酶活，且用表面活性劑清洗菌體后仍然不顯活性，則可初步斷定該CDA為胞內(nèi)酶（可采用免疫熒光技術(shù)和免疫膠體金標(biāo)記法進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞定位）[5，7，36]。由于野生型微生物中的CDA往往分布在細(xì)胞內(nèi)（細(xì)胞壁、細(xì)胞周質(zhì)空間等），導(dǎo)致CDA在純化上的困難，尋找到合理的破碎細(xì)胞方法極為關(guān)鍵，一般有機(jī)械法（搗碎、研磨、勻漿）、物理法（溫差、壓差、超聲）和生物化學(xué)法（化學(xué)試劑滲透、自溶、酶解）以及復(fù)合處理法。前處理之后，采用硫酸銨沉淀法和超濾法將粗酶液濃縮和粗分離，以除去核酸、多糖等雜質(zhì)。細(xì)分級(jí)過程中，天然甲殼素脫乙酰酶蛋白多采用層析法，常用的有離子交換層析與親和層析[5-8]。而重組甲殼素脫乙酰酶蛋白，通常人為加上了融合標(biāo)簽，因此分離純化步驟比天然的簡(jiǎn)化很多。如融合了His-tag的重組酶，能夠利用鎳柱親和層析快速純化[37]。

3 展望

CDA有著豐富的生物來源和獨(dú)特的生理學(xué)作用，圍繞著CDA酶可以開發(fā)出多種功能。目前用CDA取代NaOH熱堿法生產(chǎn)殼聚糖已是大勢(shì)所趨，某些CDA還可以生產(chǎn)特定的寡糖產(chǎn)品。如來源于Mucor rouxii的CDA可生產(chǎn)還原端具有一個(gè)乙?；募讱す烟荹7]；Colletotrichum lindemuthianum中的CDA可催化脫乙酰反應(yīng)的逆反應(yīng)，在殼聚二糖的非還原端加上一個(gè)乙酰基得到β-D-GlcNAc-（1-4）-GlcN或得到具有3個(gè)乙?；臍ぞ鬯奶荹6]。此外，CDA參與合成構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)殼聚糖，且在昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，是理想的抗真菌藥物和昆蟲防治的作用靶點(diǎn)，但是CDA的工業(yè)化應(yīng)用在短期內(nèi)仍難以實(shí)現(xiàn)。自然選育的野生CDA菌株所產(chǎn)酶多為胞內(nèi)酶，不易分離純化，基因工程手段得到的菌株則多產(chǎn)沒有活性的包涵體，而且目前最為迫切的一個(gè)問題就是，無論是天然CDA還是重組CDA都難以降解具有致密晶體結(jié)構(gòu)的天然甲殼素。嘗試從菌株的選育、酶蛋白的修飾和底物的改造三方面著手來解決問題：①考慮到海洋中大量含天然甲殼素的蝦蟹殼等物質(zhì)被微生物降解，海洋生物具備產(chǎn)催化難溶底物CDA的潛力；②選用昆蟲細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，獲得酶活力高且直接分泌到胞外的CDA酶，并對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)分子的修飾與改造；③在用CDA催化底物之前，對(duì)天然甲殼素進(jìn)行預(yù)處理破壞其晶態(tài)結(jié)構(gòu)，對(duì)后續(xù)降解至關(guān)重要，酶法預(yù)處理將會(huì)是一個(gè)大的趨勢(shì)。如預(yù)先用多糖裂解單加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenase，LPMO）氧化裂解甲殼素原纖維表面上的糖鏈，暴露出晶體內(nèi)部的乙?；?，能大大加快CDA后續(xù)的脫乙酰進(jìn)程[38]。此外，由于CDA和一些相關(guān)的CE4酶均對(duì)殼寡糖（chitosan oligosaccharide，COS）表現(xiàn)出催化活性，且作用機(jī)理相似，現(xiàn)有的以乙酰苯胺和殼寡糖等為底物的酶活測(cè)定方法可能無法區(qū)別這些酶。因此，某種新發(fā)現(xiàn)的具有催化脫乙?；盍Φ拿甘欠駷镃DA還需加以甄別，可從三方面進(jìn)行：①?gòu)膩碓磁c生理學(xué)作用初步推測(cè)，如存在于細(xì)菌周質(zhì)空間中與細(xì)菌細(xì)胞壁（含肽聚糖）合成相關(guān)，很可能為肽聚糖脫乙酰酶[39]。分泌到細(xì)胞外用于分解代謝植物細(xì)胞壁（含木聚糖）的極有可能為乙酰木聚糖酯酶[40]。②根據(jù)其底物偏好性，檢測(cè)其對(duì)不同底物的催化活力加以證實(shí)。③將該酶的基因序列與已報(bào)道的多種CDA基因進(jìn)行序列比對(duì)，甚至結(jié)晶得到蛋白質(zhì)晶體與已上傳的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（protein database，PDB）結(jié)構(gòu)比較進(jìn)一步驗(yàn)證。CDA的應(yīng)用潛能無可替代，但需要做的還有很多，如規(guī)范CDA的酶活測(cè)定方式，深入了解更多的CDA蛋白分子結(jié)構(gòu)等。