龍四紅，廖妍儼*，孫 棣，陳學(xué)航，黃家?guī)X，李紅洲，梁桂娟

（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院 國(guó)家酒類及加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，貴州 貴陽(yáng) 550016）

吡嗪是一種1,4位含氮類的六元雜環(huán)化合物，它的衍生物廣泛存在于天然和發(fā)酵食品中[1-2]。近年來(lái)對(duì)白酒中風(fēng)味物質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，雖然吡嗪類化合物在白酒中的含量甚微，但其具有風(fēng)味閾值低，香氣透散性好，并對(duì)其他香味物質(zhì)有明顯的烘托疊加作用等特點(diǎn)，對(duì)白酒的風(fēng)味起著重要的作用[3-4]。尤其是白酒中的四甲基吡嗪（川芎嗪）由美拉德反應(yīng)生成，在制曲和堆積發(fā)酵的過程中產(chǎn)生，經(jīng)蒸餾帶入酒中，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板集聚等作用，賦予中國(guó)白酒健康功能[5-6]。所以對(duì)白酒中吡嗪類化合物的分析檢測(cè)顯得尤為重要。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)吡嗪類化合物的分離方法主要有液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）、固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）[7-8]、頂空固相微萃?。╤eadspace solidphasemicroextraction，HS-SPME）[9-10]、離子交換（ionexchange，IEX）和超臨界萃取（supercritical fluid extraction，SFE）等[11]，檢測(cè)方法主要有氣相色譜（gas chromatography，GC）法[12]、氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[13-15]和氣相色譜氮磷檢測(cè)器（gas chromatography-nitrogen phosphorusdetector，GC-NPD）等[16-17]。王莉等[18]建立了一種利用氣相色譜-質(zhì)譜-選擇離子掃描（gas chromatography-mass spectrometry-selectiveionmonitoring，GC-MS-SIM）聯(lián)用技術(shù)，該方法只定量分析了白酒中4種重要化合物；張艷紅等[19]采用頂空固相微萃取與氣相色譜-火焰熱離子檢測(cè)器（solidphase microextraction-gas chromatography-flame thermionic detector，SPME-GC-FTD）相結(jié)合的方法，定量了8種吡嗪類化合物；孫棣等[20]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法快速測(cè)定醬香型白酒中的8種吡嗪類化合物。以上方法需要大量的有機(jī)試劑，樣品用量大，且步驟過于繁瑣，預(yù)處理過程中被分析物損失較大。白酒中吡嗪的高效液相色譜-熒光檢測(cè)法（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）尚鮮見報(bào)道。

本研究建立一種高效液相色譜（HPLC）快速測(cè)定白酒中8種吡嗪類化合物含量的方法，并對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)考察，并對(duì)高效液相色譜（HPLC）條件優(yōu)化、樣品前處理方法研究，采用高效液相色譜（HPLC）儀對(duì)白酒樣品中吡嗪類化合物進(jìn)行檢測(cè)，旨在得到檢測(cè)白酒中8種吡嗪類化合物的快速、有效方法，該方法建立對(duì)白酒中吡嗪類化合物的評(píng)價(jià)有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒樣品：某白酒生產(chǎn)企業(yè)提供。

2-甲基吡嗪（純度＞99%）、2,5-二甲基吡嗪（純度＞98%）、2,6-二甲基吡嗪（純度98%）、2,3-二甲基吡嗪（純度99%）、2-乙基-6-甲基吡嗪（純度95%）、2,3,5-三甲基吡嗪（純度＞99%）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（純度＞98%）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；2,3-二甲基-5-乙基吡嗪（純度＞98%）：山東省滕州市華東生物科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

Aglient-1260高效液相色譜儀（配有光電二極管陣列檢測(cè)器（diode-array detector，DAD）和熒光檢測(cè)器（FLD））：美國(guó)安捷倫公司；TurboVap LV氮吹儀：瑞典Biotage公司；EYELA NYC-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會(huì)社；Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)：密理博（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高效液相色譜分析條件

流動(dòng)相由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.1%磷酸水溶液（pH=2.1）；梯度洗脫流動(dòng)相設(shè)置見表1。Phenomenon Gemini 5μ C6-Phenyl 110A色譜柱（250 mm×4.6 mm）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；熒光檢測(cè)器條件：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)348 nm。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精確稱取2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪對(duì)照品各100 mg，用乙醇溶解定容，得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水分別稀釋至0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL，用于HPLC分析。

1.3.3 樣品前處理

取白酒樣品10 mL于具塞50 mL離心管中，用12 mol/L NaOH調(diào)pH為12，再用1 mol/L NaOH調(diào)pH為14，加適量NaCl使其飽和，15 mL乙醚振蕩萃取15 min，重復(fù)提取2次，收集乙醚層，70 ℃水浴蒸發(fā)至剩余約0.5 mL，再以純水定容至1 mL，過0.45 μm濾膜后用于HPLC進(jìn)樣分析。

1.3.4 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)

將2 μg/mL的混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣6次，按1.3.1色譜條件測(cè)定8種吡嗪類化合物峰面積，分別計(jì)算結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一份白酒樣品6份，按1.3.3的方法進(jìn)行前處理，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定8種吡嗪類化合物峰面積，計(jì)算結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

（3）加標(biāo)回收率試驗(yàn)

用無(wú)水乙醇配制體積分?jǐn)?shù)為53%的乙醇溶液，作為空白酒樣，加入不同質(zhì)量濃度的吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，根據(jù)白酒中8種吡嗪化合物含量的高低，其中2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪分別添加0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.5 mg/kg三個(gè)不同水平質(zhì)量濃度，另外5種吡嗪分別添加0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg三個(gè)不同水平質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

首先選擇了實(shí)驗(yàn)室液相色譜分析常用的Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C8色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），因?yàn)榉治龅?種吡嗪類化合物均為烷基取代化合物，其中2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪為同分異構(gòu)體，在C18、C8色譜柱上的保留時(shí)間非常接近。經(jīng)多次嘗試不同廠家不同型號(hào)的液相色譜柱后，發(fā)現(xiàn)菲羅門苯基色譜柱Gemini 5 μ C6-Phenyl 110A（250 mm×4.6 mm），使用了特殊的硅膠-有機(jī)層作為填料，具有增加堿性化合物保留和pH適應(yīng)范圍廣（pH 1～12）功能，與吡嗪為弱堿性化合物的特點(diǎn)相適應(yīng)，也滿足流動(dòng)相pH較低的條件。因此，選擇菲羅門苯基色譜柱Gemini 5 μ C6-Phenyl 110A（250 mm×4.6 mm）。

2.1.2 檢測(cè)器的選擇

由圖1可知，采用DAD檢測(cè)器，在波長(zhǎng)275 nm處測(cè)試8種吡嗪類化合物的對(duì)照品溶液均能得到較好的響應(yīng)和較低的檢出限，但在測(cè)試樣品過程中，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)很大的干擾峰，主要是由于二極管陣列檢測(cè)器選擇性較差，且白酒中含有大量的醇類、酯類、酚類等物質(zhì)，這些物質(zhì)大多都有紫外吸收，因此出現(xiàn)了干擾峰。

圖1 采用二極管陣列檢測(cè)器時(shí)樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of sample by diode array detection

由圖2可知，在改用FLD檢測(cè)器后該干擾峰變低且分離效果好。因此，最終確定采用FLD檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)348 nm。

圖2 采用熒光檢測(cè)器時(shí)樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample by fluoressence detector

2.1.3 流動(dòng)相的選擇

圖3 乙腈-水（5∶95）為流動(dòng)相時(shí)8種吡嗪類化合物標(biāo)液色譜圖Fig.3 Chromatogram of 8 pyrazine compounds standard solution using acetonitrile-water (5∶95) as mobile phase

為得到簡(jiǎn)單易得，分離度高，分析時(shí)間短的流動(dòng)相系統(tǒng)，分別對(duì)甲醇-水（10∶90，V/V）、甲醇-緩沖鹽（乙酸銨）（5∶95，V/V）、乙腈-水（5∶95，V/V）、乙腈-緩沖鹽（乙酸銨）（5∶95，V/V）、甲醇-手性添加劑（β-環(huán)糊精）（10∶90，V/V）、乙腈-手性添加劑（β-環(huán)糊精）（10∶90，V/V）等不同的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了多次摸索，結(jié)果見圖3。由圖3可知，8種吡嗪類化合物在乙腈-水（5∶95，V/V）系統(tǒng)中分離效果良好。因此，采用乙腈-水（5∶95，V/V）系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

2.1.4 流動(dòng)相中pH值的確定

在用液相色譜柱進(jìn)行吡嗪類化合物的分離時(shí)，發(fā)現(xiàn)吡嗪類化合物對(duì)流動(dòng)相的pH值很敏感。在乙腈-水（5∶95，V/V）的流動(dòng)相系統(tǒng)中，加入0.1%的磷酸溶液調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，在pH值為1.9時(shí)，吡嗪類物質(zhì)出峰時(shí)間較早，峰形較好，但2,3-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪不能完全分離；pH上升到2.1時(shí)，8種吡嗪能得到良好的分離效果（見圖4）；當(dāng)pH上升至2.2時(shí)，2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪出現(xiàn)包裹現(xiàn)象且與2,3-二甲基吡嗪不能完全分離。因此，選擇流動(dòng)相pH值為2.1。

圖4 乙腈-水（5∶95）為流動(dòng)相在pH值為2.1時(shí)8種吡嗪類化合物標(biāo)液色譜圖Fig.4 Chromatogram of 8 pyrazine compounds standard solution using acetonitrile-water (5∶95) as mobile phase at pH 2.1

2.1.5 流動(dòng)相流速的選擇

圖5 流速為1.0 mL/min時(shí)8種吡嗪化合物色譜圖Fig.5 Chromatogram of 8 pyrazine compounds at a flow rate of 1.0 ml/min

設(shè)置柱溫30 ℃，以乙腈-水（pH 2.1）溶液為流動(dòng)相，考察流速分別為0.5 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min、1.5mL/min時(shí)的分離情況，發(fā)現(xiàn)流速為1.0mL/min的分析效果良好（見圖5）。流速越低，分析時(shí)間延長(zhǎng)，峰形變差；隨著流速的升高，分析時(shí)間明顯縮短，但影響分離度，綜合分離度和分析時(shí)間。因此，選擇流速為1.0 mL/min。

2.1.6 柱溫的選擇

在流速為1.0 mL/min時(shí)，分別設(shè)置柱溫為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，發(fā)現(xiàn)8種吡嗪類物質(zhì)的分離效果沒有明顯區(qū)別。因此，設(shè)置柱溫為常用的30 ℃。

綜上，優(yōu)化的HPLC色譜條件為：檢測(cè)器為FLD，色譜柱為Phenomenon Gemini 5 μ C6-Phenyl 110A（250 mm×4.6 mm）；柱溫30 ℃，流動(dòng)相A為乙腈，B為%0.1磷酸水溶液（pH=2.1），梯度洗脫；流速為1 mL/min。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的HPLC分析色譜圖分別見圖6。由圖6可知，在此優(yōu)化色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品吡嗪類物質(zhì)分離良好。

圖6 8種吡嗪類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（a）及白酒樣品（b）的HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of 8 pyrazine compounds of standards (a) and Baijiu samples (b)

2.2 樣品前處理方法研究

為建立回收率高，成本低，操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好的前處理方法，進(jìn)行了3種方式前處理方法研究，結(jié)果見表2。

表2 樣品不同前處理方法優(yōu)缺點(diǎn)的比較Table 2 Comparison of advantages and disadvantages by different sample pretreatment methods

由表2可知，方法一采用直接蒸發(fā)濃縮的方法，前處理雖然簡(jiǎn)單，但不能有效去除白酒中的酸、酯、醇等物質(zhì)的干擾，且不能對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行有效富集，回收率較低。方法二采用的是將樣品先酸化，濃縮后進(jìn)行液-液萃取，再堿化的步驟，目的是先使樣品中的目標(biāo)化合物呈離子化，再用有機(jī)溶劑萃取掉樣品中的酸、酯、醇等干擾物質(zhì)，但此方法耗時(shí)長(zhǎng)，有機(jī)溶劑消耗大，操作復(fù)雜，回收率不高。方法三是在堿性條件使樣品中的吡嗪類物質(zhì)更好的溶解在乙醇中，再用乙醚將樣品中的吡嗪萃取出來(lái)，經(jīng)過無(wú)水硫酸鈉干燥后，不經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（減少旋蒸過程的損失），直接用離心管在70 ℃的水浴條件下將樣品揮發(fā)至約0.5 mL，再用純水定容至1 mL。

圖7 按方法三前處理白酒樣品中8種吡嗪類物質(zhì)色譜圖Fig.7 Chromatogram of 8 pyrazine compounds in Baijiu samples according to pretreatment method 3

由圖7可知，方法三前處理過程得到分析樣品具有干擾物質(zhì)少，回收率高的特點(diǎn)，平均回收率可達(dá)到86%以上。因此，選擇方法三作為酒樣前處理方法。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液按最佳色譜條件進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到8種吡嗪物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 8種吡嗪化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 3 Linear equation,linear range,correlation coefficient and limit of detection of 8 pyrazine compounds

由表3可知，在0.5～5.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上，可滿足準(zhǔn)確定量的要求。以S/N=3確定檢出限（limit of detection，LOD），其中2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪的LOD均為0.10 μg/mL、2-甲基吡嗪的LOD為0.05 μg/mL、2,3-二甲基吡嗪LOD為0.15 μg/mL、2,5-二甲基吡嗪的LOD為0.24 μg/mL、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪的LOD為0.13 μg/mL。

2.4 精密度試驗(yàn)

將2 μg/mL的混標(biāo)按2.1確定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD，結(jié)果見表4。

由表4可知，2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪的精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD范圍均在1.04%～2.49%之間，表明該方法的精密度良好。

表4 8種吡嗪化合物分析的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the precision experiments of 8 pyrazine compounds analysis

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一份白酒樣品6份，按2.2確定的前處理方法處理樣品后，取10 μL進(jìn)樣，根據(jù)HPLC的分析所得峰面積分別計(jì)算RSD，結(jié)果見表5。

表5 8種吡嗪化合物的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of the reproducibility experiments of 8 pyrazine compounds

由表5可知，得到2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、和2-乙基-6甲基吡嗪的RSD分別為3.06%、2.78%、2.49%、2.62%、1.82%、2.71%、3.83%、1.98%。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

加標(biāo)回收率及RSD結(jié)果見表6。由表6可知，8種吡嗪類物質(zhì)的平均回收率在86.7%～99.0%之間，表明該方法的準(zhǔn)確度高，因而使用本研究?jī)?yōu)化的色譜條件測(cè)定白酒中8種吡嗪時(shí)可以滿足試驗(yàn)要求。

表6 8種吡嗪化合物的加標(biāo)回收率結(jié)果Table 6 Results of the standard recovery of 8 pyrazine compounds

2.7 部分白酒樣品中吡嗪類物質(zhì)的含量測(cè)定

用所建立的方法對(duì)31個(gè)具有代表性的酒樣中吡嗪化合物含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表7。

由表7可知，四甲基吡嗪在21個(gè)酒樣中含量排在第一位，在7個(gè)酒樣中含量排在第二位，在3個(gè)酒樣中含量排在第三位；三甲基吡嗪在18個(gè)酒樣中含量排在第二位，在7個(gè)酒樣中含量排在第一位，在6個(gè)酒樣中含量排在第三位；2,6-二甲基吡嗪在31個(gè)酒樣中排在前三位的占30個(gè)。結(jié)果表明，該方法可以用于白酒中8中吡嗪物質(zhì)的檢測(cè)。

表7 白酒樣品中吡嗪化合物的含量測(cè)定結(jié)果Table 7 Results of pyrazine compounds contents in Baijiu samples

續(xù)表

3 結(jié)論

通過高效液相色譜試驗(yàn)條件優(yōu)化、樣品前處理方法研究，建立了高效液相色譜-熒光檢測(cè)測(cè)定白酒中8種吡嗪類化合物含量的方法，最佳色譜條件為Phenomenon Gemini 5 μ C6-Phenyl 110A色譜柱（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液（pH=2.1），梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；熒光檢測(cè)器條件：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)348 nm。該方法對(duì)8種吡嗪類化合物的精密度、重復(fù)性及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.04%～2.49%及1.82%～3.83%，樣品加標(biāo)回收率為86.7%～99.0%，檢出限為0.05～0.24 μg/mL。該方法準(zhǔn)確度高、精密度好，操作簡(jiǎn)便，成本低，可用于白酒中吡嗪類化合物的日常檢測(cè)。