程媛，唐熠，譚億民，李涓

過敏性鼻炎又稱變態(tài)反應(yīng)性鼻炎，以陣發(fā)性反復(fù)發(fā)作性的鼻癢、鼻塞、噴嚏、流清水樣鼻涕為主癥[1]，屬中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇[2-3]。目前過敏性鼻炎的發(fā)病率不斷增高，在我國患病率為4%～38%[4]，兒童和青少年的發(fā)病率更高[5]，其易反復(fù)發(fā)作，影響患者正常的學(xué)習(xí)、工作和生活。目前，西藥治療過敏性鼻炎的藥物主要有抗組胺藥、減充血?jiǎng)?、肥大?xì)胞穩(wěn)定劑、白三烯受體拮抗劑、鼻內(nèi)糖皮質(zhì)激素等[6]，但存在療效有限或使用不當(dāng)不良反應(yīng)大的風(fēng)險(xiǎn)[6-7]，因此，開發(fā)治療過敏性鼻炎的制劑應(yīng)用前景廣闊。鼻敏顆粒是我院老中醫(yī)有效驗(yàn)方，組方為黃芪、地膚子、地龍、鵝不食草、細(xì)辛，臨床應(yīng)用數(shù)十年，已有多例臨床病例的收集[8]，療效確切，并已完成制劑工藝的研發(fā)[9]。鼻敏顆粒具有益氣固表、溫陽通竅、攝涕止嚏的功效，既可祛邪外出，又可消除局部癥狀，有進(jìn)一步研究開發(fā)制成院內(nèi)制劑，廣泛應(yīng)用于臨床的價(jià)值。本文通過鼻敏顆粒的臨床前藥效學(xué)和安全性評(píng)價(jià)等相關(guān)研究，對(duì)整個(gè)制劑安全性、有效性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)，為院內(nèi)制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為醫(yī)院制劑的發(fā)展提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，SPF級(jí)動(dòng)物，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(川)2014-11。豚鼠，體質(zhì)量220～260 g，普通級(jí)動(dòng)物，由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場提供，許可證號(hào)：SCXK(川)2013-14。滅菌全價(jià)鼠料由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，全價(jià)豚鼠料由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場提供。(2)試藥試劑：鼻敏顆粒浸膏，3.69 g生藥/g膏，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水稀釋至相應(yīng)濃度。吲哚美辛腸溶片由重慶科瑞制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)641002。二甲苯，批號(hào)2015060501；甲苯二異氰酸酯(TDI)，批號(hào)2016090603；橄欖油，批號(hào)2015080101，均由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。(3)儀器設(shè)備：打孔器、光鏡、Mias2000圖像分析系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鼻敏顆粒的急性毒性實(shí)驗(yàn)：KM小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為給藥組和對(duì)照組，每組20只，雌雄各10只。禁食16 h后，采用最大給藥量法，給藥組灌胃給予鼻敏顆粒藥液(2.15 g生藥/ml)0.4 ml/10 g，每天1次。對(duì)照組同法灌胃等體積蒸餾水。觀察給藥后14 d內(nèi)小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)與死亡情況，并于給藥后第7、14天稱取小鼠體質(zhì)量。給藥第14天，處死小鼠，解剖，肉眼觀察主要臟器。

1.2.2 鼻敏顆粒的抗炎作用：KM小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，雄性，隨機(jī)分為5組，分別為模型組、鼻敏顆粒高、中、低劑量組、吲哚美辛組。鼻敏顆粒高、中、低劑量組給藥劑量依次是20.2、10.1、5.05 g生藥/kg(分別相當(dāng)于臨床擬用劑量的28、14、7倍)。吲哚美辛組給藥劑量為10 mg/kg。各組小鼠每天以20 ml/kg灌胃給予相應(yīng)的藥物1次，連續(xù)給藥3 d。模型對(duì)照組同法給予等體積飲用水。第3天給藥30 min后，每只小鼠左耳廓內(nèi)外側(cè)滴涂20 μl二甲苯致炎，右耳不涂。20 min后處死小鼠，用直徑7 mm的打孔器分別于左、右耳相同部位打下耳片，十萬分之一電子分析天平稱重，以左、右耳片重量差值表示腫脹度。計(jì)算各組耳腫脹度和腫脹抑制率。腫脹抑制率(%)=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)÷模型組平均腫脹度×100%。

1.2.3 鼻敏顆粒對(duì)過敏性鼻炎動(dòng)物模型的治療作用：豚鼠一批，體質(zhì)量220～260 g，隨機(jī)抽取10只作為空白組，剩余的豚鼠用10%TDI橄欖油溶液經(jīng)微量加樣器滴鼻進(jìn)行造模。方法如下：豚鼠每側(cè)鼻孔滴入10%TDI橄欖油溶液5 μl，每天1次，連續(xù)7 d激發(fā)。末次激發(fā)后即刻至30 min，通過行為學(xué)評(píng)分判斷模型是否成功。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：輕度搔鼻1～2次、噴嚏1～3個(gè)、流涕至鼻孔各記1分；搔鼻多次、噴嚏4～10個(gè)、流涕超出前鼻孔各記2分；劇烈搔鼻、噴嚏11個(gè)以上、涕流滿面各記3分。各癥狀記分疊加，總分超過5分為造模成功。選取造模成功的豚鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組、鼻敏顆粒高、中、低劑量組、氯雷他定組。鼻敏顆粒高、中、低劑量組給藥劑量依次是14.4、7.2、3.6 g生藥/kg(分別約相當(dāng)于臨床擬用劑量的20、10、5倍)。氯雷他定組給藥劑量是1 mg/kg；各給藥組豚鼠每天以10 ml/kg灌胃給予相應(yīng)的藥物1次，連續(xù)給藥7 d；模型組給予等體積蒸餾水。同時(shí)繼續(xù)滴鼻10%TDI橄欖油溶液10 μl/只，隔天1次，維持致敏狀態(tài)?？瞻捉M動(dòng)物同法滴鼻給予橄欖油。末次給藥后1 h后，給藥組和模型組用10%TDI橄欖油溶液滴鼻激發(fā)動(dòng)物，空白組用橄欖油滴鼻，記錄30 min內(nèi)行為學(xué)評(píng)分。處死動(dòng)物，剝離鼻周圍皮膚，沿鼻中線切開，剪下鼻中隔黏膜，用FAA液固定。石蠟包埋，切片4 μm，HE染色，光鏡下觀察鼻黏膜被覆上皮細(xì)胞表面炎性滲出物分級(jí)，其中，-：無炎性滲出物或每張切片炎性滲出物的總面積低于1/4視野，+：每張切片炎性滲出物的總面積高于1/4視野、但低于1/2視野，++：每張切片炎性滲出物的總面積高于1/2視野、但低于3/4視野，+++：每張切片炎性滲出物的總面積高于3/4視野。Mias2000圖像分析系統(tǒng)半定量計(jì)數(shù)炎細(xì)胞面積。

2 結(jié) 果

2.1 鼻敏顆粒的急性毒性實(shí)驗(yàn) 給藥后小鼠活動(dòng)減少，約1 h后動(dòng)物基本恢復(fù)正常。至給藥后14 d，動(dòng)物行為、活動(dòng)、飲水、排便均未見異常，無死亡。給藥組小鼠給藥后7 d和14 d的體質(zhì)量和體質(zhì)量增長值與對(duì)照組比較無顯著性差異(P>0.05)。給藥第14天，處死小鼠，解剖，肉眼觀察主要臟器，心、肝、脾、肺、腎等主要臟器未見異常。說明鼻敏顆粒灌胃給予小鼠的最大給藥量為86 g生藥/kg，約為臨床擬用劑量(0.72 g生藥/kg)的119倍，未見明顯毒性反應(yīng)。見表1。

2.2 鼻敏顆粒的抗炎作用 高劑量組、吲哚美辛組腫脹度與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)，高劑量組腫脹度抑制率為29.4%。見表2。

2.3 鼻敏顆粒對(duì)過敏性鼻炎動(dòng)物模型的治療作用 鼻敏顆粒各劑量組及氯雷他定組行為學(xué)評(píng)分與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)。見表3。病理切片光鏡下觀察鼻黏膜被覆上皮細(xì)胞表面炎性滲出物結(jié)果見表4。鼻敏顆粒各劑量組及氯雷他定組炎細(xì)胞浸潤面積與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)。見表5。

表1 鼻敏顆粒急性毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表2 鼻敏顆粒對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹度的影響

表3 治療前后動(dòng)物行為學(xué)評(píng)分分)

表4 鼻敏顆粒對(duì)豚鼠過敏性鼻炎模型鼻黏膜被覆上皮表面滲出物的比較

表5 鼻敏顆粒對(duì)豚鼠過敏性鼻炎模型鼻黏膜被覆上皮酸性白細(xì)胞的影響比較

3 討 論

本研究根據(jù)《四川省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑研究技術(shù)指南》[10](試行版)的要求，參照國家藥監(jiān)局頒布的《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》《中藥新藥研究指南(藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué))》，對(duì)鼻敏顆粒進(jìn)行臨床前安全性評(píng)價(jià)和主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。在急性毒性實(shí)驗(yàn)中，觀察小鼠在24 h內(nèi)一次性給予鼻敏顆粒后14 d內(nèi)產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況。在藥效學(xué)評(píng)價(jià)中，選用過敏性鼻炎及經(jīng)典的炎癥動(dòng)物模型，全面評(píng)價(jià)鼻敏顆粒的對(duì)過敏性鼻炎的治療作用，為臨床研究提供依據(jù)。研究表明，鼻敏顆粒毒性低，藥效顯著，有明顯的抗炎和治療過敏性鼻炎的作用，其緩解過敏性鼻炎癥狀的原因與降低鼻黏膜滲出物和減少炎性細(xì)胞產(chǎn)生有關(guān)。本研究中表4顯示，空白組豚鼠鼻黏膜被覆上皮表面無炎性滲出物、上皮細(xì)胞無變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤，基底膜清楚。模型組黏膜被覆上皮表面出現(xiàn)多少不等的炎性滲出物，多數(shù)動(dòng)物被覆上皮表面炎性滲出物數(shù)量多。滲出物由大量酸性粒細(xì)胞構(gòu)成，并有中性粒細(xì)胞及纖維素。被覆上皮細(xì)胞有不同程度的變性、壞死及酸性、中性粒細(xì)胞浸潤，基底膜完整，黏膜固有層可見充血、水腫、酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤。各給藥組豚鼠被覆上皮表面炎性滲出物不同程度減少，被覆上皮細(xì)胞變性、壞死及酸性、中性粒細(xì)胞浸潤不同程度減輕，黏膜固有膜內(nèi)充血、水腫、酸性、中性粒細(xì)胞浸潤也不同程度減輕。說明鼻敏顆粒緩解過敏性鼻炎的癥狀，治療過敏性鼻炎的原因與降低鼻黏膜滲出物和減少炎性細(xì)胞產(chǎn)生有關(guān)。但鼻敏顆粒通過何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮減少滲出物和炎細(xì)胞的產(chǎn)生尚不明確，因此在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步深入探索其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。

綜上所述，鼻敏顆粒開發(fā)成院內(nèi)制劑前景良好，本研究的臨床前安全性評(píng)價(jià)及藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)為今后鼻敏顆粒申請(qǐng)臨床試驗(yàn)及申報(bào)院內(nèi)制劑打下了基礎(chǔ)。