宋蕙杉，白妍，王順

1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江哈爾濱150036

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是一種復雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理學特征是黑質(zhì)內(nèi)大量多巴胺能神經(jīng)元進行性缺失變性［1-2］。30%～40%的PD患者伴有以抑郁為主的非運動癥狀，同時抑郁可以影響運動癥狀，導致PD的病程加速［3］。PD伴發(fā)抑郁癥狀（Parkinson′s disease with depression，PDD），不僅影響患者生活質(zhì)量，也給治療增加了難度［4-5］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用的神經(jīng)因子，在皮層、海馬區(qū)高度表達，能夠防止神經(jīng)元受損凋亡，參與神經(jīng)細胞的生長分化，對神經(jīng)元維持正常生理功能發(fā)揮重要作用。研究顯示［6-8］，BDNF參與PDD的發(fā)病與病理進程，BDNF的表達下調(diào)能夠加速多巴胺能神經(jīng)元損傷及腦組織結(jié)構(gòu)改變，這是導致帕金森伴抑郁樣行為的基礎(chǔ)。目前對于針刺治療PDD作用機制的研究較少，本文從BDNF表達方面探討針刺對PDD的作用機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 動物健康清潔級SD大鼠75只，雄性，8周齡，體質(zhì)量200～250 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2018-0001，在黑龍江省中醫(yī)藥科學院動物實驗室的動物實驗房飼養(yǎng)，室內(nèi)光暗交替時間為14 h／10 h，溫度控制為22～25℃，相對濕度為50%～60%。整個實驗過程按照中華人民共和國科技部頒布的《關(guān)于善待動物的指導性意見》進行操作。

1.2 藥物與試劑阿撲嗎啡（apomorphine，APO）（美國西格瑪公司，批號：SLBB0077V）；6-羥基多巴胺（美國西格瑪公司，批號：MKBH3054）；水合氯醛（天津市科密歐化學試劑中心，批號：20170305）；鹽酸氟西汀膠囊（法國Patheon France，批號：J20170022），多巴絲肼片（上海羅氏制藥有限公司，批號：SH1001）。BNDF抗體（北京博奧森公司，貨號：bsm-33042M）；山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)公司，貨號：ZB-2301）；DAB顯色劑（北京博奧森公司，批號：6935688）；大鼠BDNF ELISA試劑盒（ZIKER子科生物公司，批號：ZK-R3397）。

1.3 儀器Motic Med6.0病理圖像分析系統(tǒng)；3000型顯微攝影成像系統(tǒng)（美國moticam公司）；腦立體定位儀（美國Stoelting公司）；微量進樣器（哈爾濱凱興醫(yī)用器械廠）；移液器（Eppendorf公司）；電熱恒溫箱（上海一恒公司）；醫(yī)用微波爐（廣東格蘭仕集團）；全自動多功能酶標儀（美國Bio-TEK公司）；高速冷凍離心機（美國BECKMAN公司）；電泳儀（上海天能科技公司）；RM2135型組織切片機（德國萊卡公司）；722型可見分光光度計（上海光學儀器廠）；0.25 mm×25 mm針灸針（安迪牌，貴州安迪藥械有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組與造模75只SD大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、對照組、針刺組，每組15只。采用單側(cè)紋狀體雙靶點注射法進行PD模型制備［9］。將大鼠麻醉后，將大鼠固定于腦立體定位儀，按照大鼠腦定位圖譜向大鼠紋狀體緩慢注射6-羥基多巴胺，于術(shù)后6周，對大鼠進行APO背部皮下注射，5 min后記錄大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，恒定轉(zhuǎn)向左側(cè)且平均轉(zhuǎn)速≥6 r·min-1為陽性，作為合格PD的模型。繼續(xù)采用慢性不可預見性溫和性應(yīng)激法制備PD伴發(fā)抑郁模型［10］，每天隨機安排1種應(yīng)激且同種應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn)，以免大鼠產(chǎn)生疲勞反應(yīng)，應(yīng)激包括：50℃高溫環(huán)境5 min；夾尾1 min；4℃冰水游泳5 min；電壓50 mV電擊10 s；束縛4 h；晝夜顛倒12 h；接觸陌生物體（如塑料杯、木勺等）；噪音（60 Hz）12 h，潮濕墊料；斷水24 h。連續(xù)21 d后進行行為學觀察。造模結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組有11只大鼠造模成功，針刺組有12只大鼠造模成功，對照組有12只大鼠造模成功。假手術(shù)組：與模型組相同的注射方法及部位，注入同樣劑量的含0.2%維生素C的生理鹽水。正常組：正常飼養(yǎng)，不造模。針刺組：參照《實驗動物針灸穴位圖譜》，選取“百會透太陽”“中脘”，常規(guī)消毒，其中“百會透太陽”是使用無菌毫針刺入“百會”，向單側(cè)“太陽”方向沿皮斜刺2～3 mm，兩側(cè)“太陽”交替使用；“中脘”采用直刺，穿透大鼠皮膚約3～5 mm，進針后平補平瀉，以每分鐘60次頻率進行捻轉(zhuǎn)，每間隔5 min捻轉(zhuǎn)30 s，留針20 min。對照組：按氟西?。? mg·kg-1）＋多巴絲肼片（6 mg·kg-1）的劑量給大鼠灌胃。每日上午9時給藥，每周稱體質(zhì)量調(diào)整藥量。正常組、模型組及假手術(shù)組每日相同時間與針刺組同樣的方法抓取、固定，并予2 mL生理鹽水灌胃。以上各組操作均每日1次，連續(xù)28 d。

2.2 觀察指標與檢測方法

2.2.1 體質(zhì)量增長率變化分別測量各組大鼠體質(zhì)量，計算大鼠體質(zhì)量變化率。

體質(zhì)量變化率＝（給藥后體質(zhì)量-初始體質(zhì)量）／初始體質(zhì)量×100%

2.2.2 APO誘導的行為學變化于造模后6周，對大鼠進行APO背部皮下注射，5 min后大鼠開始出現(xiàn)以左后肢為支點向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，身體側(cè)屈成環(huán)，記錄大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。

2.2.3 蔗糖溶液偏好實驗將飼養(yǎng)籠兩側(cè)放置容量為500 mL的飲水瓶，兩個飲水瓶在實驗前24 h都裝滿1%蔗糖溶液。大鼠適應(yīng)蔗糖溶液24 h后進行實驗，兩個飲水瓶分別裝滿1%蔗糖溶液和自來水，進行稱重后隨機放入飼養(yǎng)籠兩側(cè)。1 h后稱量瓶中自來水和蔗糖溶液剩余量，每個瓶子的質(zhì)量差為大鼠的攝入量。蔗糖溶液偏好率為消耗的蔗糖溶液相對于總液體消耗的百分比［11］。

蔗糖溶液偏好率＝［蔗糖溶液攝入量／（蔗糖溶液攝入量＋自來水攝入量）］×100%

攝入量＝初始量-剩余量

2.2.4 曠場實驗曠場反應(yīng)箱為80 cm×80 cm×40 cm的木質(zhì)敞箱，底面均勻劃分為16個小正方形，保持測試環(huán)境安靜、黑暗，把每只大鼠輕輕放置于網(wǎng)格的中央位置，允許其在箱內(nèi)自由探索活動，觀察并記錄大鼠5 min內(nèi)的活動情況，包括水平爬行格數(shù)、垂直站立次數(shù)。水平爬行格數(shù)是計算大鼠身體的一半以上從一個正方形移動到另一個正方形的格數(shù)，垂直站立次數(shù)為大鼠站立姿勢的次數(shù)［12］。

2.2.5 ELISA法檢測血清中BDNF的水平腹主動脈采血5 mL，將血液標本置于4℃冰箱靜置2～3 h，離心半徑8 cm，3000 r·min-1，離心15 min，取上清液存于-20℃冰箱，采用ELISA法進行血清BDNF水平的測定。將樣品進行稀釋，樣品加于酶標板孔，混勻，封板后置37℃溫育30 min，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 min后棄去，重復5次；每孔加入酶標試劑，溫育30 min，洗滌，顯色，加終止液終止反應(yīng)后進行測定。

2.2.6 腦組織HE染色大鼠以10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)左心室依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛的溶液，至大鼠全身變硬后，斷頭取腦放入4%多聚甲醛液中，置于4℃冰箱內(nèi)固定24 h后，進行脫水，石蠟包埋，制備組織切片。將切片放入烤箱溶蠟0.5 h后再放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中各10 min，放入100%、95%、80%、70%梯度乙醇，流水沖洗10 min 2次；蘇木素染色5 min，流水沖洗10 min；鹽酸酒精分化1次，流水沖洗15 min；伊紅染色2 min，流水沖洗10 min；95%乙醇、100%乙醇Ⅲ各10 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液各10 min；中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.2.7 免疫組織化學法檢測大鼠腦組織BDNF的表達切片常規(guī)脫蠟，于過氧化氫液中孵育10 min，PBS沖洗3次，每次2 min。將切片泡入枸椽酸鹽緩沖液中，放置在微波爐中烘烤2次，每次5 min，自然冷卻至室溫。滴加一抗，于4℃冰箱內(nèi)24 h，PBS沖洗3次，每次2 min；滴加二抗，于37℃恒溫箱中孵育30 min，PBS沖洗3次，每次2 min；DAB顯色10 min后充分沖洗干凈，蘇木素復染1 min；常規(guī)脫水封片后，于顯微鏡下觀察。采用Motic Med 6.0病理圖像分析系統(tǒng)，在100倍視野下，隨機觀察每組圖像并進行計數(shù)。進入圖像分析系統(tǒng)，選擇免疫組織化學法分析模塊，通過灰度調(diào)節(jié)來區(qū)分視野內(nèi)陽性信號面積，進行分析后計算陽性細胞總數(shù)，取其平均值。

2.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，采用LSD檢驗進行組間兩兩比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量增長率變化與正常組比較，假手術(shù)組大鼠體質(zhì)量增長率變化不明顯（P＞0.05），模型組大鼠體質(zhì)量增長率顯著減慢（P＜0.01）；與模型組大鼠相比，針刺組、對照組大鼠體質(zhì)量增長率均顯著加快（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量增加百分率比較 （±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量增加百分率比較 （±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01

／%正常組組別n體質(zhì)量增長率15 98.92±10.13假手術(shù)組15 92.15±9.65模型組11 43.76±8.12**對照組12 83.50±7.65＃＃針刺組12 79.81±8.35＃＃

3.2 各組大鼠APO誘導的行為學變化造模后，有35只PDD模型大鼠出現(xiàn)恒定轉(zhuǎn)向左側(cè)且平均轉(zhuǎn)速≥6 r·min-1，正常組和假手術(shù)組以相同方式注射APO后未出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為；與模型組比較，對照組和針刺組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠APO誘導行為學比較 （±s）

表2 各組大鼠APO誘導行為學比較 （±s）

注：與模型組比較，＃P＜0.05

-1組別n旋轉(zhuǎn)圈數(shù)／r·min 15 0假手術(shù)組15 0模型組11 10.76±3.12對照組12 6.02±2.35＃針刺組12 6.31±3.43正常組＃

3.3 各組大鼠蔗糖溶液偏好率與正常組相比，模型組大鼠蔗糖溶液偏好率明顯降低（P＜0.05），假手術(shù)組大鼠蔗糖深液偏好率無明顯變化；與模型組相比，對照組和針刺組大鼠蔗糖溶液偏好率均明顯增加（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠蔗糖溶液偏好率比較（±s）

表3 各組大鼠蔗糖溶液偏好率比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05

／%正常組組別n蔗糖溶液偏好率15 70.25±3.18假手術(shù)組15 69.30±8.65模型組11 49.76±7.12**對照組12 59.50±5.65＃針刺組12 60.31±6.35＃

3.4 各組大鼠曠場實驗與正常組相比，假手術(shù)組的水平距離、垂直運動次數(shù)均無明顯差異，模型組大鼠水平距離、垂直運動次數(shù)均顯著減少（P＜0.01）；與模型組相比，對照組和針刺組大鼠的水平距離有顯著增加（P＜0.01），對照組和針刺組的垂直得分明顯增加（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠曠場實驗比較（±s）

表4 各組大鼠曠場實驗比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01，＃P＜0.05

組別n水平運動／格垂直運動／次15 62.06±5.43 18.53±4.72假手術(shù)組15 60.73±7.23 16.67±4.05模型組11 31.90±4.92**5.45±1.51**對照組12 58.50±4.29＃＃10.42±2.75＃針刺組12 56.33±4.71＃＃9.33±2.23正常組＃

3.5 各組大鼠血清BDNF水平與正常組相比，模型組血清BDNF水平明顯降低（P＜0.05），假手術(shù)組無明顯變化；與模型組相比，針刺組和對照組BDNF水平明顯升高（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血清中BDNF水平的比較（±s）

表5 各組大鼠血清中BDNF水平的比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別n血清BDNF水平（ρ／ng·L-1）5正常組143.53±29.42假手術(shù)組5 138.42±25.05模型組5 93.34±15.33*對照組5 128.12±18.24＃針刺組5 130.92±20.45＃

3.6 各組大鼠腦組織HE染色正常組和假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)形態(tài)及大小正常，核仁明顯，結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，排列紊亂，形態(tài)不完整，染色較淺，部分結(jié)構(gòu)溶解消失；針刺組和對照組細胞形態(tài)完整，排列較整齊，結(jié)構(gòu)較清晰。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色的比較（×100）

3.7 各組大鼠腦組織BDNF表達正常組大鼠的BDNF陽性細胞表達較強，其細胞數(shù)量多，排列相對緊密，胞漿染色較深。與正常組相比，假手術(shù)組無明顯差別，模型組的陽性細胞總數(shù)明顯減少（P＜0.05），排列相對稀疏，胞漿著色明顯變淺；與模型組相比，對照組和針刺組的陽性細胞數(shù)均有明顯增加（P＜0.05）。見圖2，表6。

圖2 各組大鼠腦組織BNDF陽性神經(jīng)元的比較（×100）

表6 各組大鼠腦組織區(qū)BDNF陽性細胞數(shù)比較（±s）

表6 各組大鼠腦組織區(qū)BDNF陽性細胞數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別n BDNF陽性細胞數(shù)／個35.60±2.50假手術(shù)組5 34.90±1.14模型組5 14.60±3.20*對照組5 32.20±0.83＃針刺組5 31.40±1.14正常組5＃

4 討論

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的高度表達的蛋白質(zhì)，在神經(jīng)細胞再生、分化和可塑性中起著重要的作用［13-14］。BNDF通過與肌球蛋白相關(guān)激酶B（TrkB）受體結(jié)合導致TrkB的磷酸化，從而激活神經(jīng)細胞的下游細胞內(nèi)信號，維持多巴胺能神經(jīng)元的完整性，避免細胞受損和凋亡［15-17］。臨床研究顯示，BDNF在前額皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)高度表達，成為帕金森病、阿爾茨海默病、抑郁癥和情感障礙等神經(jīng)和精神疾病病理生理的關(guān)鍵因素［18］。BDNF能調(diào)節(jié)多巴胺能通路，發(fā)揮對多巴胺神經(jīng)元抗凋亡、抗氧化的作用，促進多巴胺的釋放，改善帕金森病導致的認知功能、自主神經(jīng)功能障礙，對抑郁等伴隨的非運動癥狀有良好的調(diào)節(jié)作用［19-22］。研究表明，PDD患者的血清BDNF水平顯著減少，通過治療后血清BDNF水平明顯提升［13］。此外，提高血清及腦組織BDNF的水平，可以調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡和神經(jīng)興奮性，從而改善帕金森的伴隨癥狀［23-25］。

帕金森抑郁屬中醫(yī)“顫證”合并“郁證”范疇。“顫證”由肝腎陰虛，筋脈失養(yǎng)所致，病位在腦，腦為神明所聚，是意識思維的基礎(chǔ)［26］?；颊呔貌〔挥?，氣機不暢，肝氣郁結(jié)，而引發(fā)“郁證”［27］。針刺選取“百會透太陽”“中脘”，具有醒腦開竅，調(diào)神暢情之效?！肚Ы鹨健酚涊d：“頭者，人神所注……皆上歸頭?！卑贂儆诙矫}，聯(lián)系腦絡(luò)，與腦關(guān)系密切，可治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。百會透太陽區(qū)域連接正營、懸厘，橫貫督脈、膀胱經(jīng)、膽經(jīng)三經(jīng)，穿越頂、額、顳三葉區(qū)，一穴透多穴、多經(jīng)、多區(qū)，具開竅熄風、調(diào)暢氣機之功效，對帕金森病導致的抑郁癥狀具有良好的調(diào)節(jié)作用［28］。研究發(fā)現(xiàn)，針刺百會能夠提高抑郁大鼠腦內(nèi)的內(nèi)啡肽含量，通過參與體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)來調(diào)節(jié)大鼠的抑郁樣行為［29-30］。中脘屬于任脈，為胃之募穴，主治消化系統(tǒng)疾病，針刺中脘可以促進胃腸道的消化吸收，使脾胃運化功能恢復正常。實驗發(fā)現(xiàn)，中脘穴可以對大腦皮層網(wǎng)絡(luò)起到調(diào)控作用，刺激內(nèi)啡肽的釋放［31］，其機制可能是針刺中脘穴作用于胃腸道，通過腦腸軸進行信息傳遞達到作用目的，對帕金森抑郁的治療具有重要意義。

本實驗中PDD模型是在PD模型成功的基礎(chǔ)上采用慢性不可預見性溫和性應(yīng)激法制備。PD模型的制備目前主要有6-羥基多巴胺雙靶點注射法、MPTP注射法以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，其中6-羥基多巴胺很容易被大腦認為是神經(jīng)遞質(zhì)進入神經(jīng)元，從而破壞神經(jīng)細胞，使PD模型大鼠的病理表現(xiàn)、發(fā)病進程以及行為學表現(xiàn)與人類相似，且操作相對簡單，易成功?？刹捎肁PO誘導行為學來評估模型成功率，因此，本實驗選用6-羥基多巴胺雙靶點注射法制備PD模型［32］。采用慢性不可預見性溫和性應(yīng)激法制備伴發(fā)抑郁模型，大鼠出現(xiàn)精神萎靡，體質(zhì)量增長明顯減緩，曠場實驗中的水平爬行距離和垂直運動次數(shù)較正常組明顯減少，蔗糖溶液偏好率明顯低于正常組，提示大鼠出現(xiàn)探究行為減弱，快感缺失等行為，且造模后的大鼠BDNF表達顯著降低，這與臨床中帕金森伴發(fā)抑郁的行為及病理表現(xiàn)一致。假手術(shù)組與正常組大鼠的行為學表現(xiàn)及BDNF表達無明顯差異，說明手術(shù)操作對實驗結(jié)果無影響，模型組的改變是由于6-羥基多巴胺破壞多巴胺能神經(jīng)元所致。

多巴絲肼片能夠?qū)苟喟桶纺苌窠?jīng)元凋亡、保護神經(jīng)細胞，可有效改善PD患者的運動及非運動癥狀，且多巴絲肼片作為左旋多巴與芐絲肼的合成制劑，可減輕單一用藥的不良反應(yīng)。氟西汀屬于選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，可阻斷5-羥色胺受體通路，恢復多巴胺水平，是抗抑郁治療的一線用藥，且具有成分安全，不良反應(yīng)小，起效快，方便給藥以及很少干擾其他藥物作用的優(yōu)勢。因此，選取美多芭和氟西汀作為陽性對照藥物。

本實驗結(jié)果顯示，與模型組相比，針刺干預后大鼠的體質(zhì)量變化率、APO誘導的大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、水平運動距離、垂直站立次數(shù)及蔗糖溶液偏好率均有明顯改善，免疫組化法及ELISA法檢測顯示腦組織及血清中BDNF表達明顯升高，表明針刺能夠改善PDD大鼠的行為學表現(xiàn)，同時提高其腦組織及血清中BDNF表達。進一步證實，針刺可能是通過提高BDNF表達水平，調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的興奮性，從而改善帕金森伴發(fā)抑郁的癥狀，為針刺治療PDD的機制研究提供了新依據(jù)，同時為臨床治療PDD提供了新的思路和方法。