高祖鵬，唐照磊，郭井菲，何康來(lái)，王振營(yíng)*

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究所，長(zhǎng)春 130118；3. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，南寧 530007）

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda(J. E. Smith)隸屬于鱗翅目夜蛾科，又被稱(chēng)為“秋黏蟲(chóng)”，是原生于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)的一種多食性、遷飛性重大農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)[1]。該蟲(chóng)取食范圍廣，不僅可取食玉米，還可以取食小麥、棉花、甘蔗等80余種植物[2,3]。自2019年1月首次入侵云南，隨著季風(fēng)逐漸由南向北遷飛，截止至2019年9月，已蔓延至全國(guó)26個(gè)省份，對(duì)我國(guó)玉米等農(nóng)作物安全生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[4]。

草地貪夜蛾的防治方法主要有農(nóng)業(yè)防治、生物防治、理化誘控、化學(xué)防治和監(jiān)測(cè)技術(shù)[5]?；瘜W(xué)防治具有見(jiàn)效快的特點(diǎn)，是防止草地貪夜蛾擴(kuò)散的主要方法，但任何化學(xué)農(nóng)藥的施用，都會(huì)導(dǎo)致害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性[6]。根據(jù)國(guó)外的報(bào)道，草地貪夜蛾已經(jīng)對(duì)擬除蟲(chóng)酯類(lèi)、雙酰胺類(lèi)、新煙堿類(lèi)等多種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了較高的抗藥性[7,8]。生物防治作為IPM的重要組成部分，通過(guò)自然天敵資源的保護(hù)利用或人工擴(kuò)繁釋放，以經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方式將害蟲(chóng)控制在經(jīng)濟(jì)損失允許水平之內(nèi)[9]。草地貪夜蛾作為新入侵我國(guó)的重大農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，開(kāi)展本土天敵昆蟲(chóng)資源的調(diào)查，對(duì)于合理保護(hù)利用和人工擴(kuò)繁釋放，有效地利用當(dāng)?shù)靥鞌迟Y源控制草地貪夜蛾的為害具有重要意義，且可達(dá)到綠色可持續(xù)性防控。

開(kāi)展天敵昆蟲(chóng)資源的調(diào)查，首先要進(jìn)行種類(lèi)的鑒定。除了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定外，隨著分子技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，Hebert等[10]于2003年首次提出了利用線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（Mitochondrial cytochrome coxidase subunit Ⅰ，COI）基因中特定的一段序列對(duì)生物物種進(jìn)行分子鑒定。近年來(lái)該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于大多數(shù)動(dòng)植物類(lèi)群的系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)研究，并且其有效性得到了很好的驗(yàn)證[11,12]。基于DNA條碼技術(shù)，湯印等[13]對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)寄生蜂進(jìn)行鑒定，明確了3種草地貪夜蛾幼蟲(chóng)寄生蜂分別為斯氏側(cè)溝繭蜂Microplitis similis、半閉彎尾姬蜂Diadegma semiclausum(Hellen)和斜紋夜蛾長(zhǎng)距姬小蜂Euplectrus laphygmae(Ferrière)；李志剛等[14]通過(guò)采集于粵港地區(qū)被寄生的草地貪夜蛾卵塊，鑒定出兩種草地貪夜蛾卵寄生蜂夜蛾黑卵蜂Telenomus remus(Nixon)和螟黃赤眼蜂Trichogramma chilonis(Ishii)。因此，DNA條形碼技術(shù)對(duì)草地貪夜蛾天敵的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用提供了技術(shù)支持。

本研究通過(guò)對(duì)采自田間的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)進(jìn)行室內(nèi)飼養(yǎng)，而后統(tǒng)計(jì)寄生該幼蟲(chóng)的天敵數(shù)量，并結(jié)合形態(tài)鑒定來(lái)明確寄生草地貪夜蛾的寄蠅種類(lèi)。同時(shí)，運(yùn)用DNA條碼技術(shù)對(duì)其進(jìn)行二次鑒定，為開(kāi)展草地貪夜蛾天敵的保護(hù)利用提供重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 形態(tài)鑒定

草地貪夜蛾大齡幼蟲(chóng)（5～6齡）于2020年6月4日采自廣西崇左市扶綏縣廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院扶綏基地玉米田（22°51′80′ N，107°78′16′ E），單頭放置在 5 mL 的離心管中飼養(yǎng)，待寄生蠅蛹的出現(xiàn)后，將其收集并單頭放入新的5 mL離心管中，置于溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度65%±5%，光周期14L:10D的人工氣候箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，MGC-450HP-2）內(nèi)。每日觀察寄生蠅的羽化情況。待成蟲(chóng)羽化后，將成蟲(chóng)置于冰塊上，待其靜止后，在超景深三維顯微系統(tǒng)（vhx-2000，KEYENCE，日本）下拍照，觀察其形態(tài)特征。采用傳統(tǒng)昆蟲(chóng)分類(lèi)的形態(tài)鑒定方法確認(rèn)其為日本追寄蠅Exorista japonica(Townsend)，并描述該成蟲(chóng)的形態(tài)特征。

1.2 分子鑒定

取2頭寄生蠅用液氮研磨成粉末，放入1.5 mL離心管中，采用DNA小量抽提試劑盒（天漠生物，TD620-50）提取其DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)對(duì)DNA完整性和純度進(jìn)行檢測(cè)，之后對(duì)COⅠ基因擴(kuò)增，上游引物為 LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′），下游 HCO2198（5′-TAA ACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）[16], 委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：DNA 模板 1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL、Taq PCR Master Mix（2×blue dye）、dd H2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增條件：第一步94 ℃預(yù)變性4 min；第二步94 ℃變性45 s，52 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；第三步72 ℃延伸7 min；第四步4 ℃保溫。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（生工B518141）將目的條帶切膠回收，由上海生工生物工程公司進(jìn)行雙向測(cè)序和拼接，將所得結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)序列一致性確定對(duì)應(yīng)物種種名或?qū)倜?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

本次田間采樣共采集到草地貪夜蛾幼蟲(chóng)171頭，除去死亡的3頭外，存活下的幼蟲(chóng)中被寄蠅寄生的為20頭，寄生率為 11.90%。同時(shí)還觀察了日本追寄蠅產(chǎn)卵寄生草地貪夜蛾的情況。雌寄蠅將卵產(chǎn)在草地貪夜蛾幼蟲(chóng)腹部節(jié)間膜附近，卵呈乳白色或淺綠色，長(zhǎng)約200 μm（圖1）。

圖1 產(chǎn)于草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體表的寄蠅卵粒（紅圈內(nèi)）Fig. 1 E. japonica egg oviposited on the surface of S. frugiperda lavae (in red circle)

寄蠅體長(zhǎng)6～13 mm。后小盾片呈墊狀突起，下側(cè)片披一行鬃狀毛（圖2A）。前胸腹片兩側(cè)緣披毛。頭部具向后彎曲的內(nèi)側(cè)額鬃2根，后足脛節(jié)末端無(wú)腹端刺（圖2E）。翅前鬃顯著小于盾溝后方的第一根背中鬃。翅的中脈曲角為直角，后方具褶痕，胸部翅上鬃之間具填充小鬃（圖2F）。后頭上半部在眼后髯后方，無(wú)小黑毛，髯上方的顏堤髯僅分布在顏堤下方，至多不超過(guò)顏堤長(zhǎng)度的1/2，髯位于口緣上方，水平，口緣向前突出。

復(fù)眼裸，額寬為復(fù)眼寬的2/3，間額兩側(cè)緣平行，較側(cè)額窄；側(cè)額寬為觸角第三節(jié)的1.5～2倍。觸角黑色，第三節(jié)長(zhǎng)為第二節(jié)的2.5～3倍（圖2G）。雄蟲(chóng)側(cè)額、側(cè)顏覆金黃色粉被，雌蟲(chóng)則覆灰黃色粉被，觸角第三節(jié)長(zhǎng)為第二節(jié)的2倍。側(cè)顏披稀疏短黑毛，頰披細(xì)長(zhǎng)的黑毛；單眼鬃著生于前后單眼之向頭部背中線交叉排列，下額須呈黃色。胸部黑色，覆灰黃色粉被，背面有5條黑縱紋，中間1條較細(xì)。小盾片基半部黑褐色，端半部暗黃色。

翅灰色透明，前緣刺粗長(zhǎng)，與徑中橫脈的長(zhǎng)度相等，中脈曲角至翅后緣的距離遠(yuǎn)大于由中脈曲角至中肘橫脈之間的距離（圖2F）。覆白色粉被，各背板上的粉被沿背線中斷，形成1條黑色縱條。無(wú)中心鬃。雄蟲(chóng)的肛尾葉細(xì)長(zhǎng)，末端呈梭鏢形[15]（圖2H）。

圖2 日本追寄蠅雄蟲(chóng)形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of E. japonica

2.2 分子鑒定結(jié)果

利用COI通用引物對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其結(jié)果如圖3所示，擴(kuò)增片段大小約663 bp，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性對(duì)比，待測(cè)寄蠅與日本追寄蠅E. japonica（GenBank登錄號(hào)：NC_044409.1）的CO I 基因核苷酸序列一致性為99%，初步鑒定其為日本追寄蠅。

圖3 待鑒蠅種COI基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 PCR profiles of COI genes form unknown tachinid fly species

分別根據(jù)CO I基因，利用軟件Mega 5.2的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可以確定待測(cè)寄蠅為日本追寄蠅（圖4）。

圖4 鄰接法構(gòu)建的日本追寄蠅與其他寄蠅和黑腹果蠅基于COI基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of COI of E. japonica, other tachinid flies and D. melanogaster by neighbor-joining method

3 討論

草地貪夜蛾自2019年1月入侵我國(guó)以來(lái)，研究人員對(duì)其防控技術(shù)開(kāi)展了大量的研究，化學(xué)防控為目前的主要防控策略。由于草地貪夜蛾易對(duì)化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗性，同時(shí)還會(huì)殺傷天敵昆蟲(chóng)和非靶標(biāo)生物以及農(nóng)藥殘留等，因此草地貪夜蛾的長(zhǎng)期防控策略應(yīng)側(cè)重綠色防控、生態(tài)調(diào)控等措施[18]?！耙韵x(chóng)治蟲(chóng)”是生物防治的主要方法之一，草地貪夜蛾天敵種類(lèi)豐富，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在世界范圍內(nèi)，草地貪夜蛾的天敵有 10科170種寄生蜂、4 科66種寄生蠅和豐富的捕食性天敵昆蟲(chóng)等[19,20]。

我國(guó)地域遼闊，地形復(fù)雜，生態(tài)類(lèi)型多樣，植被種類(lèi)多且覆蓋率廣，因此具有豐富的天敵資源。目前國(guó)內(nèi)已有諸多草地貪夜蛾寄生性天敵的報(bào)道，其中多以膜翅目寄生蜂為主，卵寄生蜂，如夜蛾黑卵蜂[14]、螟黃赤眼蜂[14]；幼蟲(chóng)寄生蜂，如斯氏側(cè)溝繭蜂[13,21]、斜紋夜蛾長(zhǎng)距姬小蜂[13]、半閉彎尾姬蜂[13]、淡足側(cè)溝繭蜂Microplitis pallidipes(Szepligeti)[22]和蛹寄生蜂——霍氏嚙小蜂Tetrastichus howardi(Ollif)[22]，以及卵幼蟲(chóng)寄生蜂：臺(tái)灣甲腹繭蜂Chelonus formosanus(Sonan)[22]。

DNA條形碼技術(shù)主要被用于鑒定近緣種或者建立數(shù)據(jù)庫(kù)、分析某個(gè)大的類(lèi)群。前者一般是同一個(gè)屬或者同一個(gè)科，但個(gè)體小、形態(tài)鑒定困難的幾個(gè)種[23-25]，常常用于一個(gè)總科甚至目或者某一個(gè)大的區(qū)域同類(lèi)昆蟲(chóng)的區(qū)分[26,27]。本研究從田間采集的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了一種寄生蠅，并利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)該寄蠅進(jìn)行了序列測(cè)定和對(duì)比分析，明確了其為日本追寄蠅。結(jié)合形態(tài)特征鑒定進(jìn)一步確定為日本追寄蠅，其田間自然寄生率高達(dá)11.90%。在黔南地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)繭蜂科與姬蜂科對(duì)草地貪夜蛾田間寄生率分別為3.00%和20.00%[28]；在德宏田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)斯氏側(cè)溝繭蜂、半閉彎尾姬蜂與斜紋夜蛾長(zhǎng)距姬小蜂，田間最高自然寄生率分別為12.00%、22.30%和5.33%[13]。由此可以看出日本追寄蠅對(duì)草地貪夜蛾具有較高的寄生率。本研究極大地豐富了草地貪夜蛾的天敵資源。

日本追寄蠅屬于大型卵寄蠅，雌蠅將尚未完成胚胎發(fā)育的卵產(chǎn)于寄主體表，待幼蟲(chóng)孵化后，其采用口器鑿開(kāi)寄主表皮進(jìn)入寄主體內(nèi)，并游離一段時(shí)間后，選擇合適部位形成寄生組織[15]。研究發(fā)現(xiàn)日本追寄蠅偏向于將大部分卵產(chǎn)在家蠶Bombyx mori幼蟲(chóng)靠近頭部區(qū)域的前胸部，其次是頭部，只有很少的卵產(chǎn)于腹部，且產(chǎn)卵位置與寄生成功率有著極密切的關(guān)系[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，日本追寄蠅雌蟲(chóng)將卵塊產(chǎn)于草地貪夜蛾幼蟲(chóng)腹部，并未觀察到幼蟲(chóng)頭部帶有卵粒的情況，這是否與草地貪夜蛾高齡幼蟲(chóng)具有較高的攻擊性有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。李揚(yáng)等[29]選擇家蠶、人紋污燈蛾Spilarctia subcarnea、美國(guó)白蛾Hyphantria cunea作為寄主，研究日本追寄蠅對(duì)不同齡期寄主的著卵量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)日本追寄蠅偏好寄生這三種鱗翅目高齡幼蟲(chóng)。日本追寄蠅對(duì)草地貪夜蛾不同齡期幼蟲(chóng)的寄生選擇偏好性，有待進(jìn)一步試驗(yàn)觀察。

日本追寄蠅與膜翅目寄生天敵相比，擁有較好的寄生率，并在國(guó)內(nèi)已經(jīng)有了較為完整的繁殖技術(shù)，史永善[30]提出用黏蟲(chóng)Mythimna seperata幼蟲(chóng)做為寄主飼養(yǎng)日本追寄蠅，因此為其田間應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。