郭 雅 麗,王 競(jìng),顧 晨,郭 定 環(huán)
( 大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院, 遼寧 大連 116024 )
近年來,藥品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品(pharmaceutical and personal care products,PPCP)作為一種重要的環(huán)境優(yōu)先污染物,受到越來越廣泛的關(guān)注.布洛芬(ibuprofen,IBP)作為一種典型的PPCP,是目前使用最廣泛的非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)之一[1].由于傳統(tǒng)廢水處理的去除效率相對(duì)較低,IBP無法完全去除并被排放入環(huán)境中[2].已有報(bào)道表明,IBP已在污水、地表水、海水甚至地下水中被檢測(cè)到,濃度范圍從ng·L-1至μg·L-1[3-4].毒理學(xué)研究表明,長(zhǎng)期暴露于即使是低濃度的IBP,仍可顯著影響生物體的生長(zhǎng)和發(fā)育,并降低群落的生物多樣性,對(duì)人類健康和生態(tài)系統(tǒng)的平衡具有潛在威脅[5-6].
在光照環(huán)境中,直接和間接(敏化)光解均可降解IBP[7].已有研究表明,溶解性有機(jī)物,尤其是富里酸是重要的光敏劑[8-9].而Matamoros等發(fā)現(xiàn),在光照條件下,IBP也可以在海水中降解[10].在生物降解方面,已有研究報(bào)道白腐真菌、黏質(zhì)沙雷氏菌和淡水硅藻舟形藻等從陸地及淡水環(huán)境中分離的微生物,在一定條件下也能夠有效地降解IBP[11-13].有報(bào)道表明,由于IBP對(duì)顆粒的相對(duì)較高的吸附系數(shù),能夠吸附于顆粒有機(jī)碳并在湖水中以1 m·d-1的速度沉降,因而易于在沉積物中積累[14].因此IBP不僅存在于海水中,在沉積物中也被檢出[15-19],這也就意味著,在海洋環(huán)境中光降解并不是IBP轉(zhuǎn)化的唯一途徑.因此,本研究利用從近海沉積物中分離得到的麥?zhǔn)辖惶鎲伟鶪CW,考察IBP共代謝降解特性、降解過程中生理特性及胞外活性氧的變化,對(duì)研究海洋細(xì)菌對(duì)IBP的生物降解、了解IBP在海洋環(huán)境中的歸趨具有重要意義.
實(shí)驗(yàn)所用菌株GCW分離自大連市黑石礁近海表層沉積物,經(jīng)富集培養(yǎng)后,反復(fù)利用稀釋涂布平板劃線法分離,從而得到菌株GCW,菌落呈白色,圓形,表面光滑,邊緣整齊.經(jīng)鑒定為麥?zhǔn)辖惶鎲伟鶤lteromonasmacleodii(Genbank登錄號(hào):KY583738).
實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基均用人工海水配制,用20% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0.
唯一碳源培養(yǎng)基:在人工海水中加入12.5 mg·L-1NH4NO3、2.5 mg·L-1K2HPO4·3H2O和250 mg·L-1IBP.
不同共代謝培養(yǎng)基:向人工海水中分別加入6 g/L的蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉.
為定位IBP降解發(fā)生在菌株胞內(nèi)還是胞外,對(duì)降解活性物種進(jìn)行了定域?qū)嶒?yàn).將菌株培養(yǎng)72 h,取菌液6 000 r/min離心分離10 min,將上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜去除細(xì)胞后作為胞外提取液.將沉淀洗滌后用濃度10 mmol·L-1的Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)重懸,隨后冰浴超聲破壁5 min,15 000 r/min離心分離20 min,上清液作為胞內(nèi)提取液.在無菌培養(yǎng)基(空白對(duì)照)、胞外和胞內(nèi)提取液中分別加入1 mg·L-1的IBP,于25 ℃,150 r/min的恒溫?fù)u床中避光反應(yīng)5 h.為了避免胞內(nèi)活性物質(zhì)在超聲破碎過程中變性失活,又進(jìn)行了完整細(xì)胞實(shí)驗(yàn).將離心(6 000 r/min,10 min)后的沉淀用預(yù)冷無菌超純水洗滌2次,重懸于滅菌人工海水,在相同條件下進(jìn)行反應(yīng).
(1)羥基自由基
?OH是一種典型的活性氧(reactive oxygen species,ROS),其測(cè)定采用苯甲酸高效液相色譜法[20].色譜柱為Sinochrom ODS-BP (4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫為40 ℃.其中,流動(dòng)相A為超純水(含0.1%三氟乙酸),流動(dòng)相B為乙腈,流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比為87∶13,波長(zhǎng)為255 nm,單個(gè)樣品運(yùn)行時(shí)間為20 min.?OH濃度計(jì)算方法如下式所示:
c(?OH)=c(p-HBA)×5.87
(1)
其中c(?OH)為?OH濃度,c(p-HBA)為對(duì)羥基苯甲酸濃度.
(2)超氧陰離子自由基
(3)過氧化氫
H2O2檢測(cè)采用的是DPD/POD法[22].向2 mL 的胞外提取液中加入0.2 mL濃度為0.5 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH=6),再加入37 μL 用濃度為0.05 mol·L-1的H2SO4配制的10 g·L-1DPD溶液和37 μL的1 g·L-1POD溶液,利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量吸光度,波長(zhǎng)為551 nm,體系以不加POD為空白對(duì)照.
(4)鐵載體
鐵載體的檢測(cè)基于鉻天青(chrome azurol S,CAS)法[22].將CAS檢測(cè)液與胞外提取液等體積充分混勻后放置1 h,利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度,波長(zhǎng)為630 nm,以酵母浸粉培養(yǎng)基作為空白對(duì)照.
(5)L-氨基酸氧化酶
L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,LAAO)的檢測(cè)同樣基于DPD/POD法[23].取1 mL 胞外提取液,加入等體積的5 g·L-1亮氨酸溶液作為底物,以不作處理的胞外提取液作對(duì)照,一同在25 ℃,150 r/min的恒溫?fù)u床中反應(yīng)1 h,用DPD/POD法分別測(cè)定反應(yīng)后體系的H2O2濃度,相減則為1 h內(nèi)產(chǎn)生的H2O2.
(1)生長(zhǎng)曲線
生長(zhǎng)曲線的測(cè)定采用比濁法,利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度來推測(cè)菌體的濃度,測(cè)定波長(zhǎng)為600 nm.
(2)胞外聚合物
利用堿法提取菌株經(jīng)過72 h培養(yǎng)后的胞外聚合物(EPS).取10 mL菌液,10 000 r/min離心分離20 min,上清液即為溶解態(tài)EPS.在沉淀中加入10 mL超純水充分混勻,加入0.06 mL濃度為36.5%的甲醛溶液,靜置于4 ℃條件下反應(yīng)1 h,隨后向體系內(nèi)加入4 mL濃度為1 mol·L-1的NaOH溶液靜置于4 ℃條件下培養(yǎng)3 h,離心分離(10 000 r/min,4 ℃,20 min),收集上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾后即為結(jié)合態(tài)EPS.EPS中多糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法,蛋白質(zhì)測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法.
(3)胞外脫氫酶活性
脫氫酶活性(dehydrogenase activity,DHA)的檢測(cè)采用氯化三苯基四氮唑-脫氫酶活性法[24].
(4)電子傳遞系統(tǒng)活性
電子傳遞系統(tǒng)活性(electron transport system activity,ETSA)的檢測(cè)是基于四唑還原作用來體現(xiàn)耗氧值,底物是碘硝基氯化四氮唑藍(lán)(INT)[25].
IBP的測(cè)定采用高效液相色譜法.色譜柱為Supersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫為40 ℃.其中,流動(dòng)相A為含有0.02 mmol·L-1磷酸二氫鈉的超純水(用磷酸調(diào)pH=3.0±0.05),流動(dòng)相B為乙腈,流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為40∶60,流速為0.8 mL·min-1,在222 nm 波長(zhǎng)下對(duì)IBP濃度進(jìn)行測(cè)定.單個(gè)樣品運(yùn)行時(shí)間為12 min.
首先,為了考察菌株GCW能否以IBP為唯一碳源生長(zhǎng),進(jìn)行了唯一碳源降解實(shí)驗(yàn)(圖1).實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IBP未發(fā)生明顯降解,表明在實(shí)驗(yàn)條件下,GCW不能夠以IBP為唯一碳源生長(zhǎng).而IBP在自然環(huán)境中可能與各種易降解物質(zhì)共存,因此,選取常見的有機(jī)質(zhì)作為共代謝底物考察了IBP的共代謝降解效果(圖1).實(shí)驗(yàn)表明,在無細(xì)胞接入和經(jīng)過熱失活細(xì)胞的兩個(gè)不同空白對(duì)照組中,72 h 后IBP未發(fā)生明顯降解(<5%).而牛肉膏和蛋白胨培養(yǎng)基中的3 d降解率分別為85%和69%,酵母浸粉培養(yǎng)基最高,為90%.因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇酵母浸粉作為共代謝底物.對(duì)菌株GCW好氧共代謝降解IBP進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.在經(jīng)歷24 h的停滯期后,對(duì)24~72 h的IBP濃度基于c/c0值取對(duì)數(shù),按一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程線性擬合,擬合結(jié)果符合準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué),IBP降解速率常數(shù)為0.061 h-1,相對(duì)應(yīng)的半衰期T1/2為35.4 h.
關(guān)于海洋環(huán)境中IBP生物降解目前還未見報(bào)道,本研究中的降解速率與IBP在海水中光降解的相關(guān)研究結(jié)果(0.14 h-1)也相當(dāng)[10].對(duì)比淡水及陸地環(huán)境中IBP生物降解的研究,Marco-Urrea等發(fā)現(xiàn)白腐真菌對(duì)IBP的7 d降解率約為70%[11],Xu等分離的黏質(zhì)沙雷氏菌對(duì)IBP的5 d降解率為93%[12],本研究在降解周期及降解率方面具有一定優(yōu)勢(shì).
圖1 不同培養(yǎng)基中的IBP降解曲線
圖2 IBP降解曲線
為了明確降解發(fā)生的位置,進(jìn)行了降解活性物種定位實(shí)驗(yàn)(圖3).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,菌株GCW胞內(nèi)提取液和完整細(xì)胞中的IBP均不發(fā)生降解,而胞外提取液中IBP發(fā)生明顯降解,降解率達(dá)79%.因此,降解IBP的活性物質(zhì)位于胞外.
圖3 GCW不同部分的IBP降解
為了分辨降解活性物質(zhì)的種類,進(jìn)行了活性物種淬滅實(shí)驗(yàn)(圖4).發(fā)現(xiàn)煮沸抑制了97.2%的IBP降解,說明降解活性物質(zhì)為熱敏性物質(zhì).而蛋白酶K抑制了56.9%的降解,說明菌株GCW降解IBP為酶和非酶物質(zhì)共同作用,其中酶的作用占56.9%.隨后進(jìn)行了ROS淬滅實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)SOD抑制了3.4%的降解,CAT抑制了31.2%的降解,硫脲抑制了56.8%的降解.結(jié)果表明,ROS參與了菌株GCW對(duì)IBP的降解,且H2O2和?OH起主要作用.
圖4 淬滅實(shí)驗(yàn)的IBP相對(duì)降解率
為了探究IBP對(duì)菌株GCW的影響,考察了菌株在含與不含IBP的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線、胞外聚合物、脫氫酶活性等生理特性,這些生理特性也在一定程度上反映了其降解IBP的機(jī)理.
菌株GCW在含與不含IBP體系中的生長(zhǎng)曲線如圖5所示.GCW經(jīng)過6 h左右生長(zhǎng)到達(dá)對(duì)數(shù)期,經(jīng)過約36 h生長(zhǎng)到達(dá)對(duì)數(shù)末期并進(jìn)入穩(wěn)定期,隨后直至72 h菌量不再有明顯變化.同時(shí)還可以看出,1 mg·L-1的IBP對(duì)菌株GCW的生長(zhǎng)無顯著影響.
胞外聚合物是微生物分泌于細(xì)胞外的高分子聚合物,它覆蓋在微生物表面,在微生物與外部環(huán)境之間形成一個(gè)緩沖層,能夠幫助細(xì)胞抵御有害物質(zhì)的毒害.同時(shí),已有報(bào)道表明Alteromonasmacleodii菌屬能夠產(chǎn)生EPS[26].經(jīng)72 h培養(yǎng)后,IBP對(duì)菌株GCW分泌EPS的影響如圖6所示.結(jié)果表明,加入IBP的實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組EPS的蛋白質(zhì)含量提高了15.5%,多糖含量提高了
圖5 含/不含IBP培養(yǎng)基中GCW的生長(zhǎng)曲線
圖6 IBP對(duì)EPS分泌的影響
16.7%,這一結(jié)果表明加入IBP促進(jìn)了EPS的分泌,這可能是由于菌株通過分泌EPS來抵御外界環(huán)境的毒害.
脫氫酶是細(xì)菌關(guān)鍵的氧化還原酶之一,在細(xì)菌生長(zhǎng)和降解污染物過程中起到重要作用.本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了IBP對(duì)菌株胞外脫氫酶活性的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示.結(jié)果表明,含IBP實(shí)驗(yàn)組的DHA相對(duì)于不含IBP的對(duì)照組有顯著提高,尤其是在前60 h內(nèi),提高了10.8%~35.5%.以上結(jié)果說明,IBP會(huì)刺激菌株GCW胞外脫氫酶活性,進(jìn)而有利于污染物的降解.
圖7 IBP對(duì)胞外脫氫酶活性的影響
電子傳遞系統(tǒng)活性是檢測(cè)微生物潛在代謝活性的重要生化指標(biāo)之一,可作為降解能力測(cè)定的有力補(bǔ)充.測(cè)定其活力是測(cè)定電子傳遞過程中的限速步驟酶反應(yīng)即CoQ-Cytb復(fù)合體的氧化活力.本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了菌株胞內(nèi)電子傳遞系統(tǒng)活性的變化,如圖8所示.結(jié)果表明,菌株GCW在培養(yǎng)至36 h后ETSA最高,含IBP與不含IBP分別為1.11和0.85 μg·g-1·min-1,隨后菌體的電子傳遞系統(tǒng)活性隨時(shí)間呈降低趨勢(shì).菌株GCW在培養(yǎng)的前60 h內(nèi),含IBP實(shí)驗(yàn)組的ETSA相對(duì)于不含IBP的對(duì)照組有顯著提高,提高了10.1%~30.7%.以上結(jié)果表明,IBP會(huì)刺激菌株GCW電子傳遞系統(tǒng)活性.
圖8 IBP對(duì)電子傳遞系統(tǒng)活性的影響
隨后還測(cè)定了降解過程中H2O2濃度及IBP降解情況,如圖10(a)所示.結(jié)果表明,H2O2濃度在降解過程中呈上升趨勢(shì),并在72 h結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值,分別為0.93和1.21 μmol·L-1.同時(shí)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)至指數(shù)期后期(36 h)之前,H2O2的產(chǎn)生幾乎可以忽略不計(jì).已有研究表明,LAAO在細(xì)胞外H2O2產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用,廣泛分布于包括細(xì)菌在內(nèi)的不同生物中.Gómez等首次報(bào)道海洋細(xì)菌Marinomonasmediterranea可以合成L-賴氨酸-ε-氧化酶(lodA),該酶可以催化L-賴氨酸的氧化脫氨反應(yīng)釋放H2O2[30].他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),lodA在生長(zhǎng)的穩(wěn)定期會(huì)分泌到細(xì)胞外環(huán)境中[31],這與本文的研究結(jié)果相一致.此外,在IBP降解過程中(24~60 h),含IBP的H2O2濃度低于不含IBP的;而通過對(duì)兩組中LAAO活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),含IBP中LAAO的活性明顯高于不含IBP的(圖10(b)所示).這意味著含IBP的產(chǎn)胞外H2O2能力高于不含IBP的,進(jìn)而說明含IBP的H2O2濃度下降并不是由于IBP抑制了H2O2的產(chǎn)生,而是降解IBP消耗了H2O2所致.這也解釋了IBP降解結(jié)束后(72 h),含IBP的H2O2濃度高于不含IBP的這一現(xiàn)象.
圖9 IBP對(duì)NADH氧化還原酶的影響
而研究表明,H2O2本身并不能降解IBP,需要轉(zhuǎn)化為其他活性物質(zhì)才能起到降解作用.已有研究表明,海洋系統(tǒng)中有機(jī)Fe(Ⅱ)絡(luò)合物可以催化H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)產(chǎn)生?OH[32].在蘇榮葵對(duì)UV/H2O2高級(jí)氧化技術(shù)降解布洛芬的研究中,?OH也被證明是導(dǎo)致IBP降解的最主要原因[33].因此,本研究測(cè)定了體系中的胞外?OH濃度和鐵載體的活性.在胞外提取液中檢測(cè)到?OH濃度分別為1.7和1.0 μmol·L-1,且在達(dá)到穩(wěn)定期(60 h)后,濃度趨于穩(wěn)定(圖11(a)).同時(shí),含IBP鐵載體的活性顯著高于不含IBP(圖11(b)),結(jié)合H2O2的測(cè)定結(jié)果,含IBP的胞外?OH濃度應(yīng)高于不含IBP的.然而含IBP的胞外?OH濃度卻明顯低于不含IBP的,因此這可能是由于在IBP降解中消耗了?OH,這也是IBP非酶降解的主要途徑.
本研究首次探討了海洋環(huán)境中IBP的生物降解,證實(shí)了麥?zhǔn)辖惶鎲伟鶪CW能夠共代謝降解IBP,以酵母浸粉為共基質(zhì)時(shí)具有最好的降解效果,并且在降解周期及降解率方面具有一定優(yōu)勢(shì).IBP的加入可以提高菌株EPS、DHA和ETSA等生理特性,并且促進(jìn)與胞外ROS產(chǎn)生相關(guān)的NADH氧化還原酶、LAAO和鐵載體的活性.GCW降解IBP發(fā)生在胞外,由酶和非酶物質(zhì)共同介導(dǎo).降解IBP的非酶物質(zhì)主要為ROS,且?OH起最主要作用.本研究加深了對(duì)海洋環(huán)境中IBP生物降解的了解,對(duì)研究IBP在海洋環(huán)境中的歸趨具有啟示作用.