宋丹丹，朱鵬宇，黎文敏，俎俊蕊，曾瑞珍，2，謝利，2，郭和蓉，2，張志勝，2※

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東廣州510642；2.國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510642）

雜交蘭是采用國(guó)蘭和大花蕙蘭雜交選育的蘭花新類型，集國(guó)蘭和大花蕙蘭的部分優(yōu)良性狀于一身，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、文化價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景[1]。葉藝雜交蘭是指葉片上鑲嵌著黃色或白色條紋和斑點(diǎn)的雜交蘭，因其葉片帶藝，觀賞價(jià)值更高。組織培養(yǎng)快速繁殖是雜交蘭種苗生產(chǎn)的主要途徑，因此研究雜交蘭組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)對(duì)推動(dòng)雜交蘭種業(yè)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要作用。目前對(duì)雜交蘭組織培養(yǎng)快速繁殖已有一些研究報(bào)道[1-7]，但關(guān)于葉藝雜交蘭的組培快繁技術(shù)研究未見(jiàn)報(bào)道。

‘小鳳蘭’是以‘大鳳蘭’為母本，‘企劍白墨墨蘭’為父本雜交育成的墨蘭型雜交蘭新品種[8]。該品種株型似‘企劍白墨墨蘭’，但與傳統(tǒng)墨蘭相比，其花期更長(zhǎng)，花更大，組培快繁效率也更高，育成后很快就進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)。在‘小鳳蘭’種苗工廠化生產(chǎn)中篩選到3種葉藝突變體，本研究以其中2種突變體試管苗為材料，研究葉藝雜交蘭的組培快繁技術(shù)，為加快葉藝雜交蘭的新品種選育和產(chǎn)業(yè)化推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為‘小鳳蘭’（Cymbidium‘Xiaofeng’）銀邊覆輪藝突變體G1和青縞藝突變體G2試管苗，G1和G2葉藝突變體是作者從‘小鳳蘭’試管苗中選出。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根狀莖誘導(dǎo)選取生長(zhǎng)健壯的試管苗，在超凈工作臺(tái)上用鑷子和解剖刀切取2～3 mm莖尖，接種于MS+6 BA 1.5 mg L1+NAA 0.5 mg L1+活性炭0.5 g L1+10%椰汁+蔗糖30.0 g L1+卡拉膠7.5 g L1（pH=5.8～6.2）誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種4個(gè)，8瓶為1次重復(fù)，重復(fù)3次，將培養(yǎng)瓶用封口膜封好后，裝入黑色密閉塑料袋中，在溫度為（26±1）℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)50 d，記錄誘導(dǎo)形成根狀莖和死亡的莖尖數(shù)，計(jì)算誘導(dǎo)率和死亡率。

1.2.2 根狀莖增殖取繼代培養(yǎng)的根狀莖，在超凈工作臺(tái)上用鑷子和解剖刀切成約1 cm長(zhǎng)，接種于MS+6-BA 1.5 mg L1+NAA 0.5 mg L1+蔗糖30 g L1+卡拉粉7.5 g L1+活性炭0.3 g L1（pH=5.8～6.2）增殖培養(yǎng)基上，在（26±1）℃、光照強(qiáng)度5 mol m2s1、光照時(shí)間12 h d1的條件下培養(yǎng)40 d，每瓶接10條，5瓶為1次重復(fù)，重復(fù)3次，用電子天平稱量每瓶接種的根狀莖重量和培養(yǎng)40d后根狀莖重量，記錄褐化死亡的根狀莖數(shù)，計(jì)算褐化死亡率和增殖系數(shù)。

1.2.3 根狀莖分化取長(zhǎng)約1 cm帶生長(zhǎng)點(diǎn)的根狀莖，均勻接種于MS+6 BA 1.5 mg L1+NAA 0.1 mg L1+蔗糖30g L1+卡拉粉7.5g L1+活性炭0.05g L1（pH=5.8～6.2）分化培養(yǎng)基中，在溫度（26±1）℃、光照強(qiáng)度10mol m2s1、光照時(shí)間12 h d1的條件下培養(yǎng)，每瓶接種10條，5瓶為1次重復(fù)，重復(fù)3次。培養(yǎng)40d后，記錄分化出芽（長(zhǎng)度≥0.5 cm）和帶根苗的根狀莖數(shù)以及每條根狀莖分化出的芽（長(zhǎng)度≥0.5 cm）和帶根苗數(shù)，計(jì)算分化率、平均芽分化數(shù)和平均苗分化數(shù)。

1.2.4 生根壯苗將高4 cm左右的苗，均勻接種于1/2 MS+6 BA 0.1 mg L1+NAA 0.5 mg L1+蔗糖20 g L1+卡拉粉7.5 g L1+活性炭0.5 g L1（pH=5.8～6.2）生根壯苗培養(yǎng)基中，在溫度（26±1）℃、光照強(qiáng)度15 mol m2s1、光照時(shí)間12 h d1的條件下培養(yǎng)，每瓶接種7條苗，5瓶為1次重復(fù)，重復(fù)3次。培養(yǎng)40 d后，測(cè)量株高、株幅、莖粗、葉片數(shù)、最長(zhǎng)葉長(zhǎng)、根數(shù)和最長(zhǎng)根長(zhǎng)。

1.2.5 試管苗移栽將試管苗從培養(yǎng)瓶中小心取出，用清水洗凈根部，置于通風(fēng)陰涼處晾干。用樹(shù)皮、泥炭土、椰糠按1∶1∶1的比例混合基質(zhì)種植于口徑為5cm的黑色種植袋中，放在具雙層遮陽(yáng)網(wǎng)的溫室中栽培，溫室溫度為5～32℃，相對(duì)濕度為30%～90%。剛移栽的試管苗用2 500倍液鏈霉素和800倍液惡霉靈灌根，一周內(nèi)每天向葉面噴水，隨后進(jìn)入常規(guī)管理，觀察記錄試管苗的生長(zhǎng)情況，記錄死亡苗數(shù)，計(jì)算成活率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)（處理接種外植體數(shù)量＞30個(gè)，重復(fù)3次）所有數(shù)據(jù)在Excel 2016中整理后采用SPSS 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出根狀莖的莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)100%；增殖系數(shù)=培養(yǎng)后鮮重/接種鮮重；芽分化率（%）=分化出芽的根狀莖數(shù)/接種根狀莖數(shù)100%；平均芽分化數(shù)（個(gè)/條）=分化出的芽總數(shù)/接種根狀莖數(shù)；苗分化率（%）=分化出苗的根狀莖數(shù)/接種根狀莖數(shù)100%；平均苗分化數(shù)（根/條）=分化出的苗總數(shù)/接種根狀莖數(shù)；褐化死亡率（%）=死亡（褐化）的根狀莖數(shù)/接種根狀莖數(shù)100%；試管苗成活率（%）=成活試管苗數(shù)/移栽的試管苗總數(shù)100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘葉藝小鳳蘭’莖尖根狀莖誘導(dǎo)

不同‘葉藝小鳳蘭’根狀莖的誘導(dǎo)特性不同（圖1）。培養(yǎng)50 d，G1的誘導(dǎo)率為40.74%，顯著低于G2，而褐化死亡率為20.37%，顯著高于G2（圖1 A）；G2莖尖誘導(dǎo)形成的根狀莖粗壯，而G1的弱小（圖1 B），說(shuō)明G2根狀莖生長(zhǎng)比G1快。

圖1‘葉藝小鳳蘭’的根狀莖誘導(dǎo)Fig.1 Rhizome Induction of Cymbidium‘Xiaofeng’with leaf color and pattern mutation

2.2 ‘葉藝小鳳蘭’根狀莖增殖

基本培養(yǎng)基對(duì)‘葉藝小鳳蘭’根狀莖增殖有影響，但對(duì)不同‘葉藝小鳳蘭’的影響不同。在暗培養(yǎng)條件下，G1根狀莖在MS和1/2MS中的增殖系數(shù)沒(méi)有顯著差異，而G2根狀莖在1/2 MS培養(yǎng)基中的增殖系數(shù)顯著高于G1（圖2A）。光照對(duì)‘葉藝小鳳蘭’根狀莖增殖也有明顯影響，G1根狀莖在暗培養(yǎng)下的增殖系數(shù)顯著高于5mol m2s1光照，而G2根狀莖在黑暗和5mol m2s1光照下的增殖系數(shù)沒(méi)有顯著差異（圖2 B）。

不同‘葉藝小鳳蘭’根狀莖顏色和增殖系數(shù)不同，G1根狀莖為綠色，而G2根狀莖為黃綠色（圖2 C），且增殖后產(chǎn)生的新根狀莖顏色一致；在黑暗條件下培養(yǎng)，G1根狀莖的增殖系數(shù)比G2高，而在光照下培養(yǎng)G2比G1高。

2.3 ‘葉藝小鳳蘭’根狀莖分化

G1和G2根狀莖芽分化率、苗分化率、平均苗分化數(shù)和褐化死亡率沒(méi)有顯著差異，但G2根狀莖平均芽分化數(shù)顯著高于G1（圖3 A和B）。G1根狀莖分化出的芽苗為淡綠色，葉片具銀邊覆輪藝，而G2的芽苗為淡黃綠色，葉片具青縞藝，兩者的葉藝保持率均為100%（圖3 B和D），說(shuō)明G1和G2葉藝穩(wěn)定。

圖2‘葉藝小鳳蘭’的根狀莖增殖Fig.2 Rhizome proliferation of Cymbidium‘Xiaofeng’with leaf color and pattern mutation

圖3‘葉藝小鳳蘭’根狀莖分化Fig.3 Rhizome differentiation of Cymbidium‘Xiaofeng’with leaf color and pattern mutation

2.4 ‘葉藝小鳳蘭’生根壯苗

不同‘葉藝小鳳蘭’生根壯苗特性差異明顯（圖4）。G1的株高為5.96±0.08 cm，顯著低于G2，但兩者株幅沒(méi)有顯著差異（圖4 A）。G2的葉片數(shù)和葉長(zhǎng)顯著高于G1，但根數(shù)和芽數(shù)顯著少于G1，而兩者的根長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異（圖4 B和C）。G1和G2的所有再生植株葉片均具有各自的葉藝，進(jìn)一步說(shuō)明其葉藝是穩(wěn)定的（圖4 D和E）。

圖4‘葉藝小鳳蘭’的生根壯苗Fig.4 Strengthening of test-tube seeding of Cymbidium‘Xiaofeng’with leaf color and pattern mutation

2.5 ‘葉藝小鳳蘭’試管苗栽培

不同‘葉藝小鳳蘭’試管苗栽培特性差異明顯（圖5）。G1試管苗移栽30 d、60 d和90 d的成活率均顯著低于G2，說(shuō)明G2試管苗移栽后更易成活。

圖5‘葉藝小鳳蘭’試管苗栽培成活率Fig.5 Survival rate of test-tube seeding of Cymbidium‘Xiaofeng’with leaf color and pattern mutation

3 討論

葉藝蘭具有重要的觀賞價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景，越來(lái)越受到研究者的重視[9-13]?！~藝小鳳蘭’是墨蘭型雜交蘭‘小鳳蘭’的無(wú)性系變異材料。本研究結(jié)果表明，通過(guò)莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)的‘葉藝小鳳蘭’試管苗葉藝穩(wěn)定，在MS+6 BA 1.5 mg L1+NAA 0.5 mg L1+活性炭0.3 g L1培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)40 d，銀邊覆輪藝G1和青縞藝G2根狀莖增殖系數(shù)分別為2.36和2.28，在MS+6 BA 1.5 mg L1+NAA 0.1 mg L1+蔗糖30g L1+卡拉粉7.5g L1+活性炭0.05g L1培養(yǎng)基上，其芽苗分化率分別為114.00%和133.33%，90 d試管苗移栽成活率分別為87.56%和96.35%。研究結(jié)果可加快‘葉藝小鳳蘭’新品種審定和推廣應(yīng)用，對(duì)推動(dòng)我國(guó)雜交蘭育種和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。

葉藝蘭在組培快繁過(guò)程中通常會(huì)出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，導(dǎo)致其種苗生產(chǎn)效率降低[14-15]。本研究結(jié)果表明，銀邊覆輪藝G1和青縞藝G2的葉藝均可以通過(guò)組織培養(yǎng)快速繁殖穩(wěn)定傳遞，這一結(jié)果與石樂(lè)娟等[16]在葉藝春蘭‘綠云’、王玉英等[17]在輻照獲得的葉藝蘭新品系‘TRIR-2’中的研究結(jié)果一致。蔣彧等[18]研究結(jié)果表明，與‘隆昌素’相比，‘隆昌素’葉色突變體根狀莖增殖和分化能力下降，試管苗長(zhǎng)勢(shì)緩慢。楊靖等[3]研究結(jié)果表明，在MS+6 BA 1.5 mg L1+NAA 0.5 mg L1+活性炭0.5 g L1培養(yǎng)基上培養(yǎng)，‘小鳳蘭’根狀莖增殖系數(shù)為3.0；而本研究結(jié)果表明，銀邊覆輪藝G1和青縞藝G2‘小鳳蘭’根狀莖增殖系數(shù)分別為2.36和2.28，進(jìn)一步證明葉藝變異導(dǎo)致中間繁殖體增殖能力下降。