步洪石，王仁廣，胡力銘，趙天倚，王 檀，王淑敏※

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130021）

2020年1月，中國(guó)科學(xué)家首次鑒定出導(dǎo)致重癥肺炎的新型冠狀病毒即2019-nCoV[1]。2019-nCoV屬于屬的新型冠狀病毒，主要傳播途徑為呼吸道飛沫和接觸傳播，人群普遍易感，根據(jù)目前的病理觀察，對(duì)肺臟、脾臟、心臟、肝臟和腎臟等多組織器官皆有損害的可能[2]，治療手段一般為支持治療及服用抗病毒藥物等，炎癥因子風(fēng)暴在普通型患者轉(zhuǎn)重癥的過(guò)程中起到了推波助瀾的作用，加重了器官損傷程度。

“除濕防疫散”是吉林省抗擊“新冠肺炎”輕癥期的有效方劑，在臨床上發(fā)揮了重要的作用。該方是經(jīng)典名方《平胃散》的變方，由蒼術(shù)（15 g）、陳皮（15 g）、厚樸（10 g）、炙甘草（5 g）、干姜（5 g）和大棗（5 g）組成，具有除濕運(yùn)脾、溫中和胃、扶正辟疫的功效，用于肺脾氣虛患者改善身體狀態(tài)，提升人體防御（濕）疫毒侵襲的能力。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討除濕防疫散預(yù)防新型冠狀病毒肺炎感染的作用靶點(diǎn)與機(jī)制，預(yù)測(cè)防治機(jī)理，為臨床施用提供參考。

1 材料與方法

1.1 除濕防疫散中化合物及靶標(biāo)蛋白篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com）[3]，分別以“蒼術(shù)”、“陳皮”、“甘草”、“生姜”、“大棗”和“厚樸”為關(guān)鍵詞搜索并篩選符合口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性指數(shù)（Drug-like，DL）≥0.18的化學(xué)成分作為活性成分，并得到相關(guān)靶標(biāo)蛋白。

1.2 靶標(biāo)基因名轉(zhuǎn)換及藥材-化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

借助Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行對(duì)應(yīng)的基因名轉(zhuǎn)換，并使用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建藥材-化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用STRING 11.0（https://string-db.org/）平臺(tái)對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行蛋白互作分析，Organism設(shè)定為人（Homo sapiens），將最低要求互作值（minimum required interaction score）設(shè)置為最高，隱藏?zé)o連接靶點(diǎn)，輸出TSV格式文件，導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行Network Analyzer，分析規(guī)則為節(jié)點(diǎn)的大小、邊的粗細(xì)分別按照度值由小到大遞增，節(jié)點(diǎn)及邊的顏色分別按度值及綜合評(píng)分遞增，由冷色到暖色渲染。

1.4 靶點(diǎn)的基因本體及通路富集分析

為了進(jìn)一步了解1.2篩選出的靶標(biāo)蛋白基因的功能以及在信號(hào)通路中的作用，將所得除濕防疫散的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）[4]，該庫(kù)整合了GO、KEGG、UniProt和DrugBank等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)更新快，可完成通路富集和生物過(guò)程注釋，上傳靶基因名稱列表文本文檔，限定物種為人，gene ID轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程注釋、聚類分析和KEGG通路富集分析，將所得KEGG分析結(jié)果前20個(gè)條目進(jìn)行P值轉(zhuǎn)換，以符合標(biāo)準(zhǔn)上傳格式，運(yùn)用Omicshare繪圖云平臺(tái)（https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/seniorbubble）對(duì)其結(jié)果進(jìn)行氣泡圖繪制。

1.5 分子對(duì)接

結(jié)合現(xiàn)有分子對(duì)接研究篩選“2.1”節(jié)關(guān)鍵化合物，選擇尚未進(jìn)行對(duì)接研究的化合物與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II（ACE2）和SARS-CoV-23CL水解酶進(jìn)行分子對(duì)接；通過(guò)PubChem查詢相應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)，保存為SDF格式，導(dǎo)入Chem3D軟件優(yōu)化空間結(jié)構(gòu)，使能量最小化，保存為mol2格式，導(dǎo)入分子對(duì)接軟件AutoDock Tools1.5.6 進(jìn)行加氫，計(jì)算電荷及加root操作后保存為pdbqt格式文件。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB（https://www.rcsb.org/）下載SARS-CoV-23CL水解酶及ACE2的三維晶體pdb格式（PDB ID為6LU7和1R4L），導(dǎo)入Pymol軟件對(duì)蛋白進(jìn)行去水，去除小分子配體后，導(dǎo)入Auto-Dock Tools進(jìn)行加氫，計(jì)算電荷后保存為pdbqt格式文件。通過(guò)AutoDock Vina 4.0進(jìn)行分子對(duì)接，將最優(yōu)對(duì)接結(jié)果導(dǎo)入Pymol進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 除濕防疫散中藥活性成分及靶標(biāo)篩選結(jié)果

圖1除濕防疫散藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Dehumidification and anti-epidemic powder drug-component-target network

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)除濕防疫散組方進(jìn)行檢索共得到活性成分102個(gè)，其中蒼術(shù)4個(gè)，陳皮4個(gè)，大棗12個(gè)，甘草76個(gè)，生姜4個(gè)，厚樸2個(gè)，柚皮素（naringenin）為陳皮和甘草共有成分，槲皮素（quercetin）、丁子香萜（Mairin）為大棗和甘草共有成分，-谷甾醇（beta-sitosterol）及豆甾醇（Stigmasterol）為大棗和生姜共有成分；活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)1613個(gè)，剔除重復(fù)最終獲得97個(gè)活性成分、227個(gè)靶點(diǎn)。Cytoscape構(gòu)建所得藥材-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖1，內(nèi)圈綠色為藥物，藍(lán)色為成分，外圈黃色為靶點(diǎn)。拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析得到度值前5位的成分為MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山柰酚）、MOL000173（漢黃芩素）、MOL004328（柚皮素）和MOL003896（7-甲氧基-2-甲基異黃酮），對(duì)應(yīng)度值分別為137、86、76、70和60。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

通過(guò)STRING 11.0平臺(tái)對(duì)組方靶點(diǎn)分析，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)統(tǒng)計(jì)節(jié)點(diǎn)數(shù)量共226個(gè)，邊數(shù)量897條，平均節(jié)點(diǎn)度7.94，PPI富集P＜10-16，平均局部聚類系數(shù)0.439。通過(guò)Cytoscape對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行Network Analyzer得到圖2，以度值排序得到交互作用較多的靶標(biāo)前10個(gè)為SATA3、JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK 14、CXCL 8、FOS和EGFR。SATA 3、JUN、FOS、MAPK和EGFR系列為癌基因，涉及細(xì)胞發(fā)育分化等，有研究表明，SATA3表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)特征均有一定關(guān)系，SATA3的激活可能會(huì)增強(qiáng)扭曲蛋白（Twist）、上皮鈣黏素（E-cad）在胃癌組織中的表達(dá)[5]；RELA可調(diào)控NF-B炎癥信號(hào)通路系統(tǒng)[6]，與IL-6、CXCL8等炎癥因子存在協(xié)同作用，密切聯(lián)系著病毒、細(xì)菌感染患者的臨床癥狀。

2.3 GO富集分析及KEGG富集分析

以P＜0.01，最小計(jì)數(shù)為3，富集因子＞1.5篩選得到GO富集條目共計(jì)245條，其中前20條皆為生物過(guò)程（GO，Biological Processes），涉及激素水平的調(diào)節(jié)、對(duì)酮的反應(yīng)、血液循環(huán)、血管發(fā)育和細(xì)胞死亡的陽(yáng)性調(diào)節(jié)等，見(jiàn)圖3；基因功能聚類結(jié)果展示了各生物過(guò)程間的關(guān)系聯(lián)接，通常使用scores作為在豐度項(xiàng)上進(jìn)行層次聚類時(shí)的相似度度量[7]，越高表示臨近調(diào)控關(guān)系越復(fù)雜，所處區(qū)域網(wǎng)絡(luò)核心性越明顯，相同大小的scores表示基因間的相似性及功能相關(guān)性很高。將score＞0.3的子樹(shù)視為一個(gè)聚類，共獲得21個(gè)子集，包括細(xì)胞對(duì)有毒物質(zhì)、激素刺激、無(wú)機(jī)物、脂多糖、細(xì)菌起源分子、受傷、抗生素、細(xì)胞外刺激和氧化應(yīng)激的反應(yīng)等，見(jiàn)圖4和圖5。圖4是由群集ID著色的網(wǎng)絡(luò)，其中相同群集ID的節(jié)點(diǎn)顏色接近，圖5是由P值著色，其中含有較多基因的項(xiàng)具有較顯著的P值，即具有較深的著色；以P＜0.05篩選得到KEGG生物過(guò)程共計(jì)245條，其中前20條涉及癌癥相關(guān)途徑。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、沙門氏菌感染、NF-B信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、卵巢類固醇生成、朊病毒病、AMPK信號(hào)通路和PPAR信號(hào)通路等，見(jiàn)圖6。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析Fig.2 PPI network analysis

圖3 GO富集分析前20條條目Fig.3 The first 20 entries of GO enrichment analysis

圖6 KEGG通路富集分析前20條條目Fig.6 The first 20 entries of KEGG channel enrichment analysis

2.4 分子對(duì)接結(jié)果

因槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素與SARSCoV-23CL水解酶和ACE2的分子對(duì)接已有相關(guān)研究[8]，故選擇7-甲氧基-2-甲基異黃酮（MOL003896）作為配體進(jìn)行分子對(duì)接。當(dāng)分子與受體穩(wěn)定結(jié)合時(shí)，結(jié)合能（binding energy）越低，發(fā)生作用的可能性越大，結(jié)果顯示，MOL003896與SARS-CoV-23CL水解酶最小結(jié)合能為﹣6.1 kJ/mol，MOL003896與ACE2最小結(jié)合能為﹣8.4 kJ/mol，皆具有穩(wěn)定的結(jié)合表現(xiàn)。核心化合物MOL003896與SARS-CoV-23CL水解酶及ACE2對(duì)接模式見(jiàn)圖7和圖8。

圖7 MOL003896與SARS-CoV-2 3CL的對(duì)接模式圖Fig.7 MOL003896 and ACE2 docking mode diagram

3 討論

此次COVID-19以“寒、濕、瘀、虛”為主要病機(jī)特點(diǎn)，寒濕犯脾則邪毒易侵，除濕防疫散是平胃散的變方。劉瑤等[9]研究表明，平胃散可改善濕困脾胃證大鼠疲勞狀態(tài)，提高血漿肝糖原含量；李建等[10]研究表明，針對(duì)脾虛痰濁阻滯證痛風(fēng)患者，平胃散合桂枝芍藥知母湯能夠減少痛風(fēng)發(fā)作次數(shù)，降低尿酸水平，并減輕IL-1、IL-8等炎癥因子的反應(yīng)。有相關(guān)文獻(xiàn)驗(yàn)證[11]，PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到的AKT1、IL-6、MAPK3等主要靶點(diǎn)，干預(yù)了COVID-19臨床治療中期階段?；虮倔w分析及通路富集分析結(jié)果展現(xiàn)了除濕防疫散對(duì)多種疾病具有潛在治療作用，最顯著的是對(duì)癌癥及腫瘤相關(guān)通路（p53信號(hào)通路，Wnt信號(hào)通路）的作用，對(duì)于細(xì)菌感染及朊病毒感染亦有效果。此外，還涉及多個(gè)炎癥及代謝相關(guān)信號(hào)通路的干預(yù)，如NF-B通過(guò)刺激因子（病毒、腫瘤壞死因子、B細(xì)胞活化因子和淋巴毒素等）的活化誘導(dǎo)相關(guān)靶基因的表達(dá)而產(chǎn)生多種細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)[12]。Ma等[13]研究發(fā)現(xiàn)，抗病毒作用可通過(guò)TLR4/NF-B信號(hào)通路相關(guān)炎性細(xì)胞因子的下調(diào)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)；PPI網(wǎng)絡(luò)得到的核心靶點(diǎn)AMPK能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、抗炎等途徑減輕肺部相關(guān)疾病癥狀，如哮喘、肺部感染和肺損傷等[14]；PPAR在炎性細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、呼吸道上皮、支氣管黏膜下層和呼吸道平滑肌均有表達(dá)，有抑制炎癥、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡等作用[15]。有分子對(duì)接相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[8]，拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析得到的核心化學(xué)成分槲皮素、山柰酚、漢黃芩素和柚皮素等，與SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2的結(jié)合能力優(yōu)于臨床推薦用藥，經(jīng)分子對(duì)接驗(yàn)證的7-甲氧基-2-甲基異黃酮（MOL003896）與ACE2及SARSCoV-23CL水解酶具有較好的對(duì)接活性，進(jìn)一步體現(xiàn)了除濕防疫散針對(duì)COVID-19具有臨床治療潛力。綜上所述，除濕防疫散發(fā)揮抗病毒作用，一方面通過(guò)健脾利濕，扶正辟疫，提升脾虛濕滯患者抵抗外邪的能力，另一方面可能通過(guò)上述AKT1、IL-6、MAPK等靶點(diǎn)及NF-B、AMPK等炎癥代謝通路，抑制COVID-19過(guò)程中炎癥因子風(fēng)暴的產(chǎn)生，起到抗病毒的作用。

有研究對(duì)新型冠狀病毒的傳播潛力進(jìn)行了預(yù)估[16，17]，國(guó)內(nèi)疫情狀況于6月出現(xiàn)轉(zhuǎn)暖，我國(guó)通過(guò)采取一系列預(yù)防控制和醫(yī)療救治措施，境內(nèi)疫情上升的勢(shì)頭得到了有效遏制。病毒起源尚未確定，其傳播能力不容小覷。中醫(yī)中藥作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，千百年來(lái)保障著中國(guó)人的身體健康，是抵御多次重大疫情的強(qiáng)力工具。針對(duì)COVID-19，國(guó)家衛(wèi)健委已修訂發(fā)布了多版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，各省、市也相繼出臺(tái)了以中醫(yī)藥治療為手段的解讀方案，體現(xiàn)了中醫(yī)藥在COVID-19治療過(guò)程中至關(guān)重要的作用。針對(duì)此次冠狀病毒的預(yù)防，中醫(yī)始終提倡“治未病”[18，19]，包括未病先防、欲病救萌、既病防變和瘥后防復(fù)4個(gè)層次，尤其是針對(duì)易感人群，治未病原則顯得尤其重要?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》有載：“正氣存內(nèi)，邪不可干”，此次COVID-19中不乏年邁體弱的危重患者，該群體自身體質(zhì)虛弱，多患有老年病及并發(fā)癥，免疫功能低下，易受病毒疫邪侵?jǐn)_。除濕防疫散可調(diào)節(jié)機(jī)體環(huán)境，提升抵抗病毒的正氣，最終實(shí)現(xiàn)防病治病的目的。