王麗梅，李多慧，羅耀明，鹿志創(chuàng)，何平

（1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省海洋生物資源和生態(tài)學(xué)重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.大連市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 大連 116085）

環(huán)氧丙烷（Propylene epoxide）（又稱1,2-環(huán)氧丙烷,甲基環(huán)氧乙烷,氧化丙烯）為無色醚味液體，低沸點、易燃，是非常重要的有機化合物原料，被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。環(huán)氧丙烷具有急性毒性，長期接觸低質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷的職業(yè)人群具有細(xì)胞遺傳學(xué)毒性，可損傷人的DNA[1,2]，損害動物和人周圍神經(jīng)[3]。近20 年來,環(huán)氧丙烷需求強勁增長，認(rèn)我國和印度為首的亞太地區(qū)是環(huán)氧丙烷產(chǎn)能和消費增長最快的地區(qū)[4]。2018 年我國環(huán)氧丙烷產(chǎn)能達(dá)到3.39×106t/年，供應(yīng)量達(dá)到2.74×106t[5]。隨著有機化工產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，越來越多的有機物通過生產(chǎn)和使用進(jìn)入到環(huán)境的各個領(lǐng)域，而海洋是其進(jìn)入環(huán)境后的重要歸宿。海洋中有機物污染主要來源于海上船載化學(xué)品的泄漏、沿海石油化工企業(yè)的廢水排放以及化學(xué)品船有毒液體物質(zhì)（NLS）污水的直接排放[6]。有機化工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展增加了有機物環(huán)境污染及其引發(fā)的生態(tài)風(fēng)險[7]。

仿刺參（Apostichopus japonicus）是我國水產(chǎn)品中單一經(jīng)濟(jì)總量較大的海水養(yǎng)殖種類。仿刺參對生長環(huán)境要求較高，對環(huán)境污染較為敏感，遇到強烈刺激或環(huán)境異常時，常產(chǎn)生化皮、“排臟現(xiàn)象”；仿刺參容易飼養(yǎng)，基礎(chǔ)生物學(xué)研究較深入，常被用于環(huán)境毒理學(xué)的相關(guān)研究[8-14]。仿刺參屬非特異性免疫，而行使免疫功能的細(xì)胞主要存在于體腔細(xì)胞中[15]。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）是機體產(chǎn)生的一種內(nèi)源性生物酶，可以有效清除氧自由（ROS）和超氧陰離子，阻止ROS 對細(xì)胞膜、生物酶以及DNA 的破壞[16,17]，在維持生物機體內(nèi)的ROS產(chǎn)生與消除的動態(tài)平衡中起重要的作用[18]。過氧化氫酶（Catalase，CAT）也具有清除ROS 的功能，對增強吞噬細(xì)胞防御能力和機體免疫功能有重要作用[19]。CAT 活性的變化能夠反應(yīng)出生物在有機物脅迫下的免疫力[20]。酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）是溶酶體的一種標(biāo)志酶，主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的消化和吸收[22-22]。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）參與生物體營養(yǎng)物質(zhì)如脂質(zhì)、糖類、鈣和無機磷酸鹽的吸收[23]，在堿性環(huán)境中（最佳pH 約為10）可以催化各種醇和磷酸苯酚的水解[24]。ACP 和ALP是參與生物體生長代謝、保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及維持機體健康所必需的酶，對生物體的免疫作用具有重要意義。有關(guān)有機污染物對水生生物毒理學(xué)的研究較多[25-30]，但環(huán)氧丙烷對海洋生物急性毒性及毒理學(xué)的報道較少[9,31]。本研究通過探討環(huán)氧丙烷對仿刺參體內(nèi)的抗氧化酶和免疫酶活性的影響，可為研究環(huán)氧丙烷對海洋生物的毒性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用仿刺參幼參取自大連金州區(qū)杏樹屯某育苗場，在實驗室暫養(yǎng)1 周后用于正式試驗。暫養(yǎng)期間，每日按照仿刺參體質(zhì)量的5%投喂配合餌料，死亡率為0。禁食24 h 后，選取大小均勻、健康刺參[體質(zhì)量（5.23±0.96）g]，水溫控制在13.9℃～15.9℃，溶解氧>6 mg/L，鹽度30～31 進(jìn)行試驗。

試驗使用的主要儀器與試劑有：多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan）、CTl5RE 型臺式微量高速離心機（日本Hitachi）、Me104e 電子天平（瑞士Mettler toledo）、IMS-100 全自動雪花制冰機（常熟市雪科電器有限公司）。環(huán)氧丙烷為化學(xué)純，購自中國國藥有限公司。SOD、CAT、ACP 和ALP 活性及總蛋白含量等由南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.2 方法

先配制成0.04 g/mL 環(huán)氧丙烷母液，根據(jù)急性毒性的預(yù)試驗結(jié)果，調(diào)配出所需試驗質(zhì)量濃度：100.00 mg/L、200.00 mg/L、300.00 mg/L、400.00 mg/L、500.00 mg/L 和600.00 mg/L，每個梯度設(shè)3 個平行樣。每個10 L 玻璃缸中放入20 頭幼參，隨時觀察其生活情況，統(tǒng)計24 h、48 h、72 h、96 h 幼參死亡率。

參照《水生生物檢測手冊》靜水式毒性法[32]進(jìn)行試驗。死亡率為每組3 個平行結(jié)果的平均值，按照周永欣的《水生物毒性試驗方法》[33]進(jìn)行校正。參照熊治延[34]方法計算劑量-反應(yīng)相關(guān)關(guān)系、半致死質(zhì)量濃度、95%置信區(qū)間和安全質(zhì)量濃度等。

仿刺參亞致死效應(yīng)的試驗方法參照高士博等[11]、羅耀明等[8]，用急性毒性試驗得到的96 h 半致死質(zhì)量濃度來設(shè)計亞致死效應(yīng)試驗，3 個環(huán)氧丙烷質(zhì)量濃度按等比級數(shù)（1/5、1/25、1/125 的96 h-LC50）分別設(shè)定為0.83 mg/L（低質(zhì)量濃度）、4.15 mg/L（中質(zhì)量濃度）和20.77 mg/L（高質(zhì)量濃度），以自然海水為對照組，每組設(shè)3 個平行。每個10 L 玻璃缸中放入30 頭幼參，試驗期間不充氣、不投餌，每24 h 換水1 次。試驗開始后24 h、48 h、72 h 及96 h，每次從每缸隨機取5 頭仿刺參作為一個樣本，用0.9%的生理鹽水沖洗后，用滅菌濾紙吸干體表水分，在滅菌冰培養(yǎng)皿中迅速解剖，收集仿刺參體腔液裝進(jìn)離心管中，放入超低溫冰箱（-80℃）中冷凍保存待用。

總蛋白含量、SOD、CAT、ACP、ALP 活性的測定參照各測試盒說明書進(jìn)行。

SOD、CAT、ACP、ALP 酶活性定義單位分別為U/mg、U/mg、U/g 和金氏單位/g，即酶活水平/總蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan 法做多重比較，顯著性水平為P<0.05，極顯著性水平為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)氧丙烷對超氧化物歧化酶活性的影響

中、高質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷暴露24 h 時，誘導(dǎo)了仿刺參體腔液中SOD 活性，其中高質(zhì)量濃度的誘導(dǎo)活性顯著增高（P<0.05〉；暴露48 h 時，各質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對SOD 活性均有誘導(dǎo)作用，但均無顯著影響（P>0.05）；暴露72 h 時，各質(zhì)量濃度對SOD 活性均有抑制作用，中質(zhì)量濃度有顯著抑制作用（P<0.05），高質(zhì)量濃度有極顯著抑制作用（P<0.01）；暴露96 h 時，低、中質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中SOD 活性的誘導(dǎo)及抑制均不顯著（P>0.05），只有高質(zhì)量濃度抑制作用顯著（P<0.05）（圖1）。

圖1 環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中SOD 活性的影響Fig.1 Effect of propylene oxide on SOD activity in the coelomic fluid of sea cucumber A.japonicus

2.2 環(huán)氧丙烷對過氧化氫酶活性的影響

環(huán)氧丙烷對CAT 活性的影響見圖2。由圖2 可知，暴露24 h 時，不同質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中CAT 活性均呈不同程度誘導(dǎo)作用，只有高質(zhì)量濃度有極顯著的誘導(dǎo)作用（P<0.01），其他質(zhì)量濃度誘導(dǎo)不顯著（P>0.05）；暴露48 h 時，反應(yīng)最強烈，不同質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對其活性均有極顯著抑制作用（P<0.01）；暴露72 h 時，不同質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對CAT 活性均有誘導(dǎo)，只有低質(zhì)量濃度有極顯著誘導(dǎo)作用（P<0.01）；暴露96 h 時，不同質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對CAT 活性影響呈現(xiàn)分化現(xiàn)象，低、高質(zhì)量濃度具有抑制作用，中質(zhì)量濃度有誘導(dǎo)作用，但影響均不顯著（P>0.05）。

圖2 環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中CAT 活性的影響Fig.2 Effect of propylene oxide on CAT activity in the coelomic fluid of sea cucumber A.japonicus

2.3 環(huán)氧丙烷對刺參酸性磷酸酶活性的影響

在暴露24 h 時，環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中的ACP 活性有一定的誘導(dǎo)作用和抑制作用，但作用均不顯著（P>0.05）；在暴露48 h 時，不同質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對ACP 活性有誘導(dǎo)作用，但不顯著（P>0.05）；在暴露72 h 時，中、高質(zhì)量濃度組的環(huán)氧丙烷對ACP 活性分別有極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）抑制作用；在96 h 時低、高質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對ACP 活性有抑制作用，其中高質(zhì)量濃度組環(huán)氧丙烷對其有極顯著（P<0.01）抑制作用，中質(zhì)量濃度有不顯著的誘導(dǎo)作用（P>0.05）（圖3）。

圖3 環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中ACP 活性的影響Fig.3 Effect of propylene oxide on ACP activity in the coelomic fluid of sea cucumber A.japonicus

2.4 環(huán)氧丙烷對刺參堿性磷酸酶的影響

在暴露24 h 時，不同質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中堿性磷酸酶（ALP）活性有一定的誘導(dǎo)和抑制作用，但作用均不顯著（P>0.05）；在48 h 時，各質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中ALP 活性均有誘導(dǎo)作用，高質(zhì)量濃度組有極顯著誘導(dǎo)作用（P<0.01）；暴露72 h 時，低質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對ALP活性有極顯著誘導(dǎo)作用（P<0.01），中質(zhì)量濃度對其有顯著抑制作用（P<0.05）；暴露96 h 時，不同質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對ALP 活性均有抑制作用，高質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷抑制作用顯著（P<0.05）（圖4）。

圖4 環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中ALP 活性的影響Fig.4 Effect of propylene oxide on ALP activity in the coelomic fluid of sea cucumber A.japonicas

3 討論

3.1 環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶SOD 和CAT 活性的改變可以反映生物體在不同脅迫條件下的生理狀況[35]。受到環(huán)氧丙烷脅迫后，隨著作用時間的延長，仿刺參體腔液中不同抗氧化酶活性的變化趨勢不同，首先表現(xiàn)在短期的毒物興奮效應(yīng)，可能因機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到干擾而引起過度補償[36,37]，即生物體的一種自我矯正[38]。短期環(huán)氧丙烷脅迫，機體產(chǎn)生防御能力和免疫力，在高質(zhì)量濃度污染物刺激下，體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，細(xì)胞迅速啟動一系抗氧化通路維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[14]，阻止ROS 對生物體的破壞，誘導(dǎo)仿刺參體內(nèi)SOD、CAT 的活性顯著增強，通過消除體內(nèi)ROS，來調(diào)節(jié)其體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)；隨著作用時間延長和ROS 的質(zhì)量濃度增加，機體內(nèi)抗氧化酶無法及時消除過多ROS，破壞了體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，抑制了生物體內(nèi)抗氧化酶[39]，導(dǎo)致抗氧化酶活性降低。48 h時在不同質(zhì)量濃度污染物脅迫下CAT 活性均被破壞，受到極顯著抑制；暴露時間進(jìn)一步延長則抑制作用逐漸減小至無顯著影響，抗氧化酶活性恢復(fù)，而72 h 時在中、高質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷刺激下SOD活性在才受到顯著抑制，而這時CAT 活性得到恢復(fù)，機體的抗氧化能力增強，有效清除體內(nèi)ROS，SOD 活性恢復(fù)要慢，直到96 h 時高質(zhì)量濃度組還對其有顯著抑制作用，持續(xù)損傷體內(nèi)的SOD 活性。這一結(jié)果與張喆等[29]研究十溴聯(lián)苯醚對菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）抗氧化酶活性影響的結(jié)果相似，與羅耀明等[8]研究異戊二烯對刺參抗氧化酶活性的影響不同，在其研究中短期內(nèi)異戊二烯對仿刺參體腔液SOD 活性有誘導(dǎo)作用與本試驗相同，但誘導(dǎo)作用比本試驗大，到96 h 時中、低質(zhì)量濃度組仿刺參SOD 活性還有顯著誘導(dǎo)作用，只有高質(zhì)量濃度組有極顯著抑制作用，而本試驗后期只有顯著抑制作用；異戊二烯從脅迫開始就一直抑制刺參體內(nèi)的CAT 活性，且隨著時間延長質(zhì)量濃度增高抑制作用更強，表現(xiàn)為單調(diào)的劑量—效應(yīng)關(guān)系?？赡苷驗楫愇於AT 活性有顯著抑制，導(dǎo)致其毒性比環(huán)氧丙烷更強，這與羅耀明等[9]比較幾種有機污染物對刺參幼參毒性結(jié)果一致。與本試驗結(jié)果不同的是，姜北[10]研究認(rèn)為，中、低質(zhì)量濃度苯系物對仿刺參SOD 活性有誘導(dǎo)作用，而高質(zhì)量濃度有抑制作用。高士博等[11]研究發(fā)現(xiàn)，暴露12 h 苯系物誘導(dǎo)了刺參呼吸樹中CAT 酶活性，抑制了腸組織中CAT活性。這種短期誘導(dǎo)作用與本試驗相同，不同的是有的化合物對仿刺參抗氧化酶只有誘導(dǎo)作用，而無抑制作用。田秀慧等[40]研究表明，氨基脲對仿刺參的SOD 和CAT 活性均有誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)強度隨時間延長而降低；同樣，張晶[12]研究表面活性劑成分十二烷基磺酸鈉（SDS）對仿刺參幼參的毒理效應(yīng)，對比幼參體肌中的SOD 和CAT 活性變化發(fā)現(xiàn)，污染暴露對幼參體壁肌中SOD 和CAT 活性的誘導(dǎo)效應(yīng)存在時間依賴性，對內(nèi)臟中SOD 活性的誘導(dǎo)效應(yīng)存在時間依賴性，與SDS 暴露質(zhì)量濃度無關(guān)。

3.2 環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中免疫酶活性的影響

本實驗中，前期（24 h）環(huán)氧丙烷脅迫對ACP、ALP 免疫酶活性無顯著影響，仿刺參細(xì)胞膜能正常吸收脂質(zhì)、糖類、鈣和無機磷酸鹽；直到暴露48 h時，高質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷的強刺激下ALP 產(chǎn)生毒物興奮效應(yīng)[36,37]，極顯著誘導(dǎo)了其活性，表明刺參在有機物脅迫下，提高了自身的非特異性的免疫功能，隨著時間延長，中、高質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷對免疫酶活性產(chǎn)生了顯著抑制作用。免疫酶活性的變化促進(jìn)或抑制了刺參機體的營養(yǎng)吸收，打破刺參生長代謝的平衡，阻礙了機體蛋白質(zhì)的消化吸收，可能導(dǎo)致仿刺參營養(yǎng)不良，影響機體健康。

與抗氧化酶活性相比，環(huán)氧丙烷影響仿刺參體腔液中免疫酶活性的時間滯后、程度小，這一與羅耀明等[9]研究的結(jié)果一致。從污染物對兩種免疫酶活性影響來看，對ACP 活性無顯著誘導(dǎo)，只有作用時間長的顯著抑制作用；而ALP 活性變化與此不同，是先誘導(dǎo)后抑制，這一結(jié)果與本試驗的抗氧化酶SOD 活性變化趨勢相似，這表明外源性化合物對仿刺參機體內(nèi)ALP 活性的影響與機體抗氧化還原系統(tǒng)間存在一定的聯(lián)系[40]。本試驗結(jié)果與羅耀明等[9]研究結(jié)果不同，異戊二烯對仿刺參體腔液中免疫酶活性只有顯著誘導(dǎo)作用，而無暴露時間延長的顯著抑制作用。田麗粉等[30]認(rèn)為，低質(zhì)量濃度的原油對牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼魚的肝臟ALP活性只有誘導(dǎo)作用,隨著質(zhì)量濃度的升高對其活性影響越大。

3.3 結(jié)論

（1）環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中SOD、ACP、ALP和CAT 4 種酶活性影響不同，對CAT 活性抑制作用最大，但恢復(fù)也最快；除對ACP 活性誘導(dǎo)作用不顯著外，對其他3 種酶活性均是前期顯著誘導(dǎo)，后期活性均受到顯著抑制；對SOD、ACP、ALP 活性抑制作用持續(xù)時間長，至96 h 時高質(zhì)量濃度環(huán)氧丙烷仍有顯著抑制作用。

（2）環(huán)氧丙烷對仿刺參體內(nèi)免疫酶活性的影響時間滯后于抗氧化酶活性的影響，影響程度較小。