逄弓一郎，卓小玉，劉玉婷，田 明

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040）

二氫槲皮素因具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗病毒、抗心血管系統(tǒng)疾病、改善毛細(xì)血管微循環(huán)、改善腦部血液循環(huán)、抗血小板凝聚等作用，用于治療腦梗及其后遺癥、腦血栓、心臟冠狀動(dòng)脈等疾病,為近年來廣泛研究[1]。俄羅斯西伯利亞落葉松材料廣泛、消耗量大，近些年逐漸成為生產(chǎn)工業(yè)原料，其廢料利用率低，本實(shí)驗(yàn)以貼合生產(chǎn)實(shí)際考慮廢物利用，以原落葉松廢料為主從中提取二氫槲皮素，考察原料經(jīng)后處理加熱時(shí)間、提取用乙醇用量、濃度、時(shí)間、次數(shù)多因素對其二氫槲皮素提取含量的影響，采用單因素實(shí)驗(yàn)與星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)對比，對二氫槲皮素提取流程優(yōu)化，以HPLC 色譜法快速、準(zhǔn)確對二氫槲皮素含量進(jìn)行測定。星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程的常用方法，基于非線性模型設(shè)計(jì)預(yù)測性高，方法高效、簡便[2]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

FW135 型中藥粉碎機(jī)（天津泰斯特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DZTW 型調(diào)溫電熱套（北京永光明實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；AB204-N 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；Thermo-Sciencetific Ultimate3000 高效液相色譜儀（配有四元泵、在線脫氣裝置、柱溫箱、控溫自動(dòng)進(jìn)樣器和UV 檢測器，美國Thermo 公司）；超聲波清洗機(jī)（MP5200H，陜西鵬展科技有限公司）。

落葉松（俄羅斯）；二氫槲皮素對照品（批號：PS000323 成都普思生物科技有限公司）；乙醇、甲醇、甲酸均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

1.2 方法

1.2.1 二氫槲皮素含量測定方法的建立

1.2.1.1 色譜條件 二氫槲皮素含量測定采用高相液相法，色譜條件色譜柱AgilentZORBAX SBC18，250mm×4.6mm 流動(dòng)相為甲醇-甲酸（0.15%）；波長290nm；流速1.0mL·min-1；柱溫28℃；進(jìn)樣量10μL。

1.2.1.2 溶液的制備

對照品溶液 電子天平稱取二氫槲皮素對照品精密稱定（15.0mg），置10mL 容量瓶中，加色譜甲醇定容搖勻，用0.45μm 的微孔濾膜過濾即得（約1.50mg·mL-1）。

供試品溶液 精密稱取供試品細(xì)粉15g，加入甲醇5mL 超聲30min，冷卻至室溫，用0.45μm 微孔濾膜過濾即得。

1.2.2 單因素考察

1.2.2.1 提取條件 稱取落葉松適量，粉碎過8 目篩，稱取20g，6 份，分別加100mL 50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇浸泡1h 后，加熱回流提取2次，每次1h，濾過，合并濾液，用各自乙醇濃度定容在100mL 容量瓶中，用0.45μm 微孔濾膜過濾1mL，HPLC 法測定含量。

色譜條件 色譜柱AgilentZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流動(dòng)相為甲醇-甲酸（0.1%）；波長290nm；流速1.0mL·min-1；柱溫35℃；進(jìn)樣量10μL。

1.2.2.2 溶劑用量 稱取落葉松粗粉20.0g，5 份，分別加4、6、8、10、12 倍量80%乙醇浸泡1h 后，加熱回流提取2 次，每次1h，濾過，合并濾液，用80%乙醇定容在100mL 容量瓶中，用0.45μm 微孔濾膜過濾1mL，HPLC 法測定含量。

1.2.2.3 提取時(shí)間 稱取落葉松粗粉20.0g，5 份，加100mL 80%乙醇浸泡60min 后，分別回流提取60、90、120、150、180min 后，濾過，用80%乙醇定容在100mL 容量瓶中后，用0.45μm 微孔濾膜過濾1mL，HPLC 法測定含量。

1.2.3 星點(diǎn)試驗(yàn)

提取工藝優(yōu)化應(yīng)用的是星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法，以此優(yōu)化落葉松在乙醇提取的條件下最優(yōu)方案。根據(jù)“1.2.2”項(xiàng)下因素水平篩選結(jié)果，最終選乙醇濃度80%～95%（X1）、溶劑用量4～10 倍（X2）、提取時(shí)間1.5～3h（X3）為考察因素水平。由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，在星點(diǎn)設(shè)計(jì)處理結(jié)果模型擬合中比較困難，再結(jié)合單因素考察結(jié)果[3]，把提取次數(shù)定為2 次，分別測定二氫槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，取其平均數(shù)作為響應(yīng)值，優(yōu)選提取工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察結(jié)果

2.1.1 提取條件對二氫槲皮素含量的影響 在乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%、95%浸泡藥材1h，加熱回流提取2 次，每次1h 的條件下，考察提取液乙醇不同濃度對落葉松中二氫槲皮素的含量影響。結(jié)果見表1、圖1。

表1 不同乙醇濃度提取二氫斛皮素含量測定結(jié)果Tab.1 Determination results of dendrobium dendrobium content extracted by different ethanol concentrations

圖1 不同乙醇濃度含量測定結(jié)果Fig.1 Determination results of different ethanol concentrations

結(jié)果表明，濃度為80%到95%的差異不顯著，RSD 值接近5%，綜合考慮試劑用量，避免造成試劑浪費(fèi)等因素，所以選擇提取液乙醇濃度80%為適宜濃度。

2.1.2 溶劑用量對二氫槲皮素含量的影響 在加入4、6、8、10、12 倍量80%乙醇浸泡藥材1h 后，加熱回流提取2 次，每次1h 的條件下，考察提取液乙醇不同用量對落葉松中二氫槲皮素的含量影響。結(jié)果見表2、圖2。

表2 不同溶劑量提取二氫斛皮素含量測定結(jié)果Tab.2 Determination results of dihydrodendrobin content extracted with different solvent amounts

圖2 不同乙醇用量含量測定結(jié)果Fig.2 Determination results of different amounts of ethanol

結(jié)果表明，落葉松中二氫槲皮素的含量隨著提取液用量的增加而增大，當(dāng)溶劑用量為12 倍量時(shí)，二氫槲皮素的提取效果與10 倍量提取量幾乎一樣，說明無差異，故確定提取液用量為10 倍量。

2.1.3 提取時(shí)間對二氫槲皮素含量的影響 在回流提取時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3h 的條件下，考察提取時(shí)間對落葉松中二氫槲皮素的含量影響。結(jié)果如表3、圖3。

表3 不同提取時(shí)間對二氫斛皮素含量測定結(jié)果Tab.3 Determination results of the content of dihydrodendrobin at different extraction times

圖3 不同提取時(shí)間量含量測定結(jié)果Fig.3 Determination results of different amounts of extraction time

結(jié)果表明，二氫槲皮素的含量隨著回流提取時(shí)間增大而增大，在加熱回流2h 后趨于平緩，考慮實(shí)驗(yàn)時(shí)間因素，故選擇回流提取時(shí)間2h 最為適宜。

2.2 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)“1.2.2”項(xiàng)下因素水平篩選結(jié)果，最終選乙醇濃度80%～95%（X1）、溶劑用量4～10 倍（X2）、提取時(shí)間90～180min（X3）為考察因素水平。由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，在星點(diǎn)設(shè)計(jì)處理結(jié)果模型擬合中比較困難，再結(jié)合單因素考察結(jié)果，把提取次數(shù)定為2 次，分別測定二氫槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，取其平均數(shù)作為響應(yīng)值。優(yōu)選提取工藝。CCD 效應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平見表4；CCD 效應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5。

二氫槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）=每1mL 落葉松中二氫槲皮素含量×稀釋倍數(shù)/落葉松木藥材取樣量。

表4 CCD 效應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平Tab.4 Factor level of CCD effect surface test

表5 CCD 效應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.5 CCD effect surface test design and results

使用statistica 軟件將表1 數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合。以二氫槲皮素得率為因變量對各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，多元非線性回歸：

Y =84.08 +0.25X1+0.13X2+0.11X3+0.12X1X2+0.24X2X3-0.20X1X3-0.31X12-0.12X22-0.13X32。經(jīng)t檢驗(yàn)顯示，模型方程具有顯著性（P＜0.05），r＝0.9866，表明該模型的擬合良好。對模型方程求極值得X1=81.21%，X2=8.21，X3=118.15min。

2.3 提取工藝參數(shù)優(yōu)化

把因變量與另兩因素?cái)M合為三維曲面圖，因只能表達(dá)含兩個(gè)因素的函數(shù)，故固定3 個(gè)變量中的一個(gè)為中值，再以擬合的目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，繪制因變量曲面圖。

根據(jù)Design expert 8.0.6 軟件分析結(jié)果，見圖4，得到二氫槲皮素提取率較佳工藝范圍：X1：60～90%，X2：4～10 倍，X3：90～180min。結(jié)果表明，根據(jù)Design expert 8.0.6 軟件分析結(jié)果及模型方程極值點(diǎn)對應(yīng)的條件，并綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)情況，選取二氫槲皮素提取工藝為：第一次10 倍量80%乙醇回流120min，第二次8 倍量80%乙醇回流90min，結(jié)果較為理想，二氫槲皮素提出含量較高，可說明此工藝條件具有良好的可行性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用HPLC 法提取落葉松中的二氫槲皮素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為提取液乙醇濃度為80%、溶劑用量為藥材的10 倍量、提取時(shí)間為120min、提取2 次時(shí)落葉松中二氫槲皮素含量較高，為163.0mg·mL-1。如若考慮到實(shí)際生產(chǎn)，乙醇回收問題，在考慮成本情況下，也可將第一次倍量調(diào)制10 倍量、提取時(shí)間120min，第二次提取量8 倍量、提取時(shí)間90min。