藍江林 史懷 陳倩倩 劉波

藍江林 ，史懷，陳倩倩，等.養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中大腸桿菌K88（Escherichia coli K88）生長動態(tài)分析[J].福建農業(yè)科技，2021，52（12）：01-06.

優(yōu)秀學者論壇

藍江林，1972年生，研究員，主要從事農業(yè)微生物的研究與應用。主持完成國家“863”計劃項目（二級合同）、福建省自然科學基金等項目20余項，作為主要完成人參加國家公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項、福建省科技重大專項等項目20余項。獲神農中華農業(yè)科技獎三等獎1項（排名第2），福建省科學技術進步獎二等獎1項（排名第4），福建省專利獎二等獎1項（排名第3），中國產學研合作創(chuàng)新與促進獎一等獎（排名第3）。以第一作者發(fā)表論文20多篇，其中獲福建省自然科學優(yōu)秀學術論文二等獎、三等獎各1篇。現(xiàn)任福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源研究所副所長，兼任福建農林大學校外研究生導師、《福建農業(yè)學報》編委。

摘 要：為明確自然條件下養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料對大腸桿菌生長的影響，探究大腸桿菌（Escherichia coli ）在墊料中的生長狀況，采用人工接種方法，將綠色熒光蛋白（GFP）標記的大腸桿菌K88接種到養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中;采用平板分離培養(yǎng)方法，觀察大腸桿菌K88-GFP（Escherichia coli K88-GFP）在墊料中的生長動態(tài)。結果表明：E.coli K88-GFP在滅菌處理的新鮮墊料和使用1年的舊墊料中均能很好生長，分離培養(yǎng)168 h含量分別達到4.03×108 cfu·g-1和5.37×108 cfu·g-1，在數量級上無顯著差別;而在未滅菌處理的新鮮墊料和使用1年舊墊料中均不能生長。說明在自然環(huán)境下，養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料對大腸桿菌K88的生長有抑制作用。

關鍵詞：大腸桿菌K88GFP;微生物發(fā)酵床;動態(tài)模擬

中圖分類號：S 828.5?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2021）12-0001-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.001

Analysis on the Growth Dynamics of Escherichia coli K88 in the Padding ofMicrobial Fermentation Bed for Pig Raising

LAN Jiang-lin， SHI Huai， CHEN Qian-qian， LIU Bo

（Institute of Agricultural Biological Resources， Fujian Academy ofAgricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： In order to clarify the effect of padding on the growth of Escherichia coli in the fermentation bed for pig raising under natural conditions， the growth of Escherichia coli in padding was studied. The green fluorescent protein （GFP）-labeled Escherichia coli K88 was inoculated into the padding of microbial fermentation bed for pig raising by using the method of artificial inoculation. The growth dynamics of Escherichia coli K88-GFP in the padding were observed by using the plate isolating culture method. The results showed that Escherichia coli K88-GFP could grow well both in the fresh padding with bactericidal treatment and the old padding used for one year， and the contents of Escherichia coli K88-GFP reached 4.03×108 cfu·g-1 and 5.37×108 cfu·g-1 after 168 h of isolating culture， respectively， with no significant difference in order of magnitudes. However， Escherichia coli K88-GFP could not grow in the fresh padding without bactericidal treatment and the old padding used for one year. The results indicated that the padding of microbial fermentation bed for pig raising could inhibit the growth of Escherichia coli K88 in the natural environment.

Key words： Escherichia coli K88-GFP; Microbial fermentation bed; Dynamic simulation

微生物發(fā)酵床養(yǎng)殖技術是采用谷殼、鋸糠、椰殼粉等有機材料制成微生物發(fā)酵床墊料，吸納養(yǎng)殖過程中畜禽排泄的糞尿，經過畜禽的踩踏，機械或人工翻扒，將畜禽排泄的糞尿與墊料充分混合，通過墊料中豐富的微生物進行發(fā)酵，將畜禽糞尿分解消納，去污除臭，實現(xiàn)了養(yǎng)殖過程的清潔環(huán)保[1]。這一技術是養(yǎng)豬業(yè)環(huán)保發(fā)展的新模式，不僅能夠實現(xiàn)糞污源頭消納，清潔環(huán)境，還能提高生豬機體抗病能力，減少疾病的發(fā)生，用后的墊料還可以作為生物基質等進行資源循環(huán)利用，是當前生豬養(yǎng)殖污染治理的主推技術之一[2-7]。在微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬體系中，墊料是承載畜禽糞便的載體，墊料中豐富的微生物是降解畜禽糞便的核心，微生物的種類、活性與數量同時也是反映發(fā)酵舍環(huán)境健康狀況的重要判定指標。而養(yǎng)殖過程中，最常見的環(huán)境污染微生物是腸道病原菌，其中，大腸桿菌和沙門氏菌的數量和動態(tài)則是反映環(huán)境衛(wèi)生狀況及群體健康動態(tài)的重要指標之一[8]。研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)養(yǎng)豬相比，發(fā)酵床養(yǎng)豬出現(xiàn)疾病的情況明顯減少，豬死亡率下降96%，可能的原因是微生物發(fā)酵床墊料形成的平衡穩(wěn)定的微生物組不利于有害微生物的生長，有利于保持豬腸道健康，減少豬的腸道疾病[9-10]。也有研究表明，自然條件下，正常的發(fā)酵床墊料可以抑制大腸桿菌特別是攜帶毒素基因的大腸桿菌的生長，且對大腸桿菌的生防效果隨發(fā)酵床使用時間的延長而增加

[11]。在墊料發(fā)酵級別為一級的墊料中，即墊料使用時間較短、發(fā)酵程度較低的條件下，可以分離到大腸桿菌;而在發(fā)酵程度較高的墊料中，即墊料發(fā)酵程度二級以上的環(huán)境中未分離到大腸桿菌[12-13]。說明在自然狀態(tài)下，發(fā)酵床養(yǎng)殖環(huán)境可以顯著抑制病原性大腸桿菌的數量[14]。

在以往的研究過程中，從豬舍采集的自然條件下墊料樣品難以分離到大腸桿菌，為研究大腸桿菌在養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中的生長動態(tài)，采用室內人工接種方法，模擬觀察大腸桿菌在發(fā)酵床墊料中的生長狀況。試驗選用新鮮墊料和使用1年的墊料，采用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的大腸桿菌Escherichia coli菌株K88，以區(qū)別于墊料中自然環(huán)境攜帶的大腸桿菌。人工接種GFP 標記的E.coli-K88至滅菌和未滅菌處理的墊料中，觀察大腸桿菌的生長狀態(tài)，驗證發(fā)酵床墊料對大腸桿菌的抑制作用，為發(fā)酵床養(yǎng)豬安全性研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮墊料：組成為谷殼∶鋸糠=1∶1。

舊墊料：使用1年的墊料，采自福州新店養(yǎng)豬場。采樣方法：發(fā)酵床面積3 m×3 m，墊料厚度80 cm，將墊料上層約40 cm的厚度翻耕均勻，隨機5點采集墊料樣品，每個樣品1000 g，混合均勻，冷藏待用。

試驗菌株：大腸桿菌K88-GFP（Escherichia coli K88-GFP）發(fā)酵液，濃度3.6×109 cfu·g-1。

1.2 養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中可培養(yǎng)細菌的分離

采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）培養(yǎng)細菌[15]。取新鮮墊料和使用1年的舊墊料樣品各200 g，分別置于500 mL無菌燒杯中，用3層無菌紗布封住杯口，于30℃恒溫箱中培養(yǎng)，每24 h取樣10 g，持續(xù)168 h，加入100 mL無菌水中，振蕩15 min，使之充分混勻，梯度稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5。每個濃度平板涂布3塊，每塊平板涂布菌懸液200 uL。靜置20 min，倒置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，統(tǒng)計菌落數量，計算對應細菌的含量。

1.3 養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中大腸桿菌K88-GFP的生長動態(tài)分析

1.3.1 墊料滅菌處理 將墊料分裝成5 L的小包，121℃高壓滅菌，重復滅菌2次。滅菌后墊料采用無菌水稀釋涂板培養(yǎng)，未長出任何微生物，則為滅菌完全。

1.3.2 人工接種大腸桿菌K88-GFP? 試驗處理見表1，每個處理設3個重復。

在超凈臺中，取各處理5 L置于體積7 L的無菌大塑料杯中，加入墊料體積比10%的大腸桿菌K88-GFP發(fā)酵液，用無菌水調節(jié)墊料濕度至40%～50%，混合均勻;用3層無菌紗布封住杯口，置30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。每12 h取出，在超凈臺內上下翻動，保持濕度均勻。每24 h取樣10 g，持續(xù)168 h;相同處理的重復樣品混合均勻，取10 g，無菌水進行梯度稀釋，采用伊紅美蘭+氨芐（Amp，100 μg%）抗性培養(yǎng)基涂板分離培養(yǎng)E.coli-K88-GFP。

1.4 試驗數據處理

試驗數據采用Excel 2010軟件處理。

2 結果與分析

2.1 養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中細菌的生長動態(tài)分析

由表2可知，培養(yǎng)24 h時，新鮮墊料中細菌的含量為1.12×108 cfu·g-1;隨后，呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，培養(yǎng)至120 h時，細菌的濃度達到最高值2.01×108 cfu·g-1;隨后又呈現(xiàn)下降趨勢，至168 h時，濃度為0.50×108 cfu·g-1。使用1年墊料中細菌的含量也呈現(xiàn)類似的變化趨勢，培養(yǎng)24 h時細菌的含量為0.33×108 cfu·g-1;培養(yǎng)至120 h時，細菌的含量達到最高值1.41×108 cfu·g-1;隨后下降，168 h時，含量為0.29×108 cfu·g-1。整個培養(yǎng)周期中，新鮮墊料的細菌平均含量顯著高于（P<0.05）使用1年的舊墊料，說明自然條件下，隨著墊料使用時間延長，發(fā)酵程度較高的墊料對細菌的生長存在抑制作用。

2.2 養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中大腸桿菌K88-GFP的生長動態(tài)分析

2.2.1 未滅菌處理墊料中大腸桿菌K88-GFP的生長動態(tài)分析 人工接種后，采用伊紅美蘭+Amp抗性培養(yǎng)基分離到的細菌可確定為E.coli-K88-GFP。試驗結果表明未滅菌處理的新鮮墊料和使用1年舊墊料中均未分離到E.coli-K88-GFP。說明未滅菌處理墊料即自然狀態(tài)下的發(fā)酵床墊料對E.coli-K88-GFP的生長有抑制作用，接種的

E.coli-K88-GFP未能成功存活。

2.2.2 滅菌處理墊料中大腸桿菌K88-GFP的生長動態(tài)分析 由圖1、圖2可知，滅菌新鮮墊料+E.coli-K88-GFP處理分離的E.coli-K88-GFP數量總體呈現(xiàn)為先下降后上升的趨勢;24 h時含量為4.48×108 cfu·g-1，至72 h時，降至最低1.07×108 cfu·g-1;隨后，E.coli-K88-GFP的含量呈上升趨勢，至144 h時，含量達到4.34×108 cfu·g-1;培養(yǎng)到168 h，最終含量為4.03×108 cfu·g-1。而未滅菌新鮮墊料+E.coli-K88-GFP處理（CK1）未檢測到E.coli-K88-GFP。

滅菌舊墊料處理中，0～72 h時E.coli-K88-GFP含量呈不斷上升趨勢，含量從3.02×108 cfu·g-1上升至5.11×108 cfu·g-1;然后下降，96 h時含量最低2.00×108 cfu·g-1;96～168 h時含量再次呈現(xiàn)不斷升高趨勢，至168 h時，達到最高5.37×108 cfu·g-1。而未滅菌舊墊料未檢測到E.coli-K88-GFP。

滅菌新鮮墊料+E.coli-K88-GFP和滅菌舊墊料+E.coli-K88-GFP兩個處理的E.coli-K88-GFP含量總體無顯著差異（P>0.05）。

3 結論與討論

養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中含有的微生物，數量多，種類豐富[16];其中細菌分布數量最大，在各使用時間和層次的分布量均達到107 cfu·g-1數量級以上，分布數量呈現(xiàn)隨著墊料使用時間的增加先上升后下降的趨勢[17]。王瀟娣等[18]分離到細菌主要有大腸桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌、鏈球菌、黏液性枯草芽孢桿菌、普通枯草芽孢桿菌等，通過小鼠致病性試驗表明，黏液性枯草芽孢桿菌與普通枯草芽孢桿菌為有益菌。張慶寧等[19]分離獲得的好氧細菌，經鑒定均為芽孢桿菌屬不同的種。發(fā)酵試驗和飼養(yǎng)試驗表明，這些菌株在豬糞和墊料組成的發(fā)酵床生長優(yōu)勢強，耐發(fā)酵高熱，能夠產生多種與豬糞降解相關的酶類，除臭效果明顯;對某些病原菌具有抑制作用，對豬安全并有促進生長的功能。且隨著墊料使用時間的延長發(fā)酵床墊料理化性質不斷變化，全氮、全磷、全鉀、pH、電導率（EC）含量呈逐漸升高趨勢，總菌數呈遞減的趨勢[20]。本試驗的結果與之吻合，通過對墊料中的細菌進行分離培養(yǎng)，其含量達到107 cfu·g-1數量級，而新鮮的墊料細菌含量顯著高于使用1年的舊墊料。說明自然條件下，隨著墊料使用時間延長，發(fā)酵程度不斷加深，墊料對細菌的生長存在抑制作用。

胡元慶等[14]檢測微生物發(fā)酵床養(yǎng)禽基質墊料中病原性大腸桿菌和沙門氏菌的數量，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床基質中大腸桿菌和沙門氏菌病原微生物的數量明顯低于普通飼養(yǎng)舍組，發(fā)酵床養(yǎng)殖環(huán)境中禽的腸道大腸桿菌和沙門氏菌的數量也低于普通養(yǎng)殖環(huán)境中動物體內攜帶的病原菌數量，說明發(fā)酵床養(yǎng)殖環(huán)境可以顯著抑制病原微生物的繁殖。鄭雪芳等[8]研究發(fā)現(xiàn)，墊料使用后期（第9個月）比使用初期（第1個月）大腸桿菌種群數量明顯減少，降低幅度在67.45%～96.53%，說明微生物發(fā)酵床能抑制大腸桿菌特別是攜帶毒素基因大腸桿菌的生長，且對大腸桿菌的生防效果隨使用時間的延長而增加。說明微生物發(fā)酵床墊料中豐富的微生物能形成以有益微生物為優(yōu)勢菌群的生物保護屏障，阻止有害微生物的侵入，對致病菌的定殖產生抑制作用[1，11，21-24];而且發(fā)酵床養(yǎng)豬豬舍與傳統(tǒng)豬舍相比，環(huán)境中和豬體表的菌落總數、大腸菌群、金黃色葡萄球菌數均較少;發(fā)酵床養(yǎng)豬潔凈衛(wèi)生，為豬提供較好的生活環(huán)境[25]。本研究通過在墊料中人工接種大腸桿菌K88-GFP，也驗證了自然條件下，微生物發(fā)酵床墊料環(huán)境的生防作用;結果表明，大腸桿菌K88-GFP在滅菌處理的新鮮墊料和舊墊料中均能很好生長，在未滅菌處理墊料中，微生物含量大，接種大腸桿菌K88-GFP均沒有成功存活。說明在自然條件下，微生物發(fā)酵床墊料中豐富的微生物對大腸桿菌K88-GFP的生長具有抑制作用，能夠提高對養(yǎng)豬健康環(huán)境的保障。

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（責任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-10-12

作者簡介：藍江林，女，1972年生，博士，研究員，主要從事農業(yè)微生物研究。

基金項目：福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項（2019R1034-2）。