官雪芳 王琦 徐慶賢 孫美玲 林斌 黃菊青

摘 要：為提高枯草芽孢桿菌內切葡聚糖酶的分泌水平，對枯草芽孢桿菌SB13產內切葡聚糖酶的促進因子進行了篩選，并通過正交試驗進行條件優(yōu)化，結果表明：MgSO4、VB1、VB2和大豆多糖對菌SB13產內切葡聚糖酶均有顯著的促進作用，各因子對菌SB13產內切葡聚糖酶的最佳促進濃度分別為（w/v）：MgSO4 0.6%、VB1 0.2%、VB2 0.4%和大豆多糖 0.8%，正交試驗法L934表明菌SB13最優(yōu)促酶因子組合為VB1 0.2%、VB2 0.5%、Mg2+ 1.6%、大豆多糖0.4%，優(yōu)化獲得最優(yōu)促進溫度為30℃、pH值為7.0。通過對促進因子的篩選及條件優(yōu)化，最終使菌SB13產內切葡聚糖酶活力分別提高了200%，為高內切葡聚糖酶水平的芽孢桿菌制劑生產及應用提供參考依據(jù)。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌;內切葡聚糖酶;大豆多糖;豆清水;維生素B2

中圖分類號：TQ 920.6?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2021）12-0038-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.007

Screening of the Promoting Factors and Optimization of the Conditions forthe Production of Endoglucanase by Bacillus Subtilis SB13

GUAN Xue-fang1，2， WANG Qi1，2， XU Qing-xian1， SUN Mei-ling1， LIN Bin1*， HUANG Ju-qing1，2

[1. Institute of Agricultural Engineering Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences，

Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Fujian Key Laboratory of Agricultural Products

（Food） Processing， Fuzhou， Fujian 350002， China]

Abstract： In order to improve the secretion level of endoglucanase from Bacillus subtilis， the promoting factors for the production of endoglucanase by Bacillus subtilis SB13 were screened， and the condition optimization was carried out by orthogonal test. The results showed that MgSO4， VB1， VB2 and soybean polysaccharides all had significant promoting effects on the production of endoglucanase by Bacillus subtilis SB13. The optimal promoting concentrations of each factor for the production of endoglucanase by Bacillus subtilis SB13 were （w/v）： 0.6% MgSO4， 0.2% VB1， 0.4% VB2， and 0.8% soybean polysaccharides， respectively. The orthogonal test L934 showed that the optimal combination of enzyme-promoting factors for Bacillus subtilis SB13 was 0.2% VB1， 0.5% VB2， 1.6% Mg2+， and 0.4% soybean polysaccharides. The optimal promotion temperature was 30℃ and pH value was 7.0. By screening the promoting factors and optimizing the conditions， the activity of endoglucanase produced by Bacillus subtilis SB13 was increased by 200%， which provided reference for the production and application of Bacillus preparations with high level of endoglucanase.

Key words： Bacillus subtilis; Endoglucanase; Soybean polysaccharide; Soybean whey; Vitamin B2

內切葡聚糖酶（endoglucanase，EC 3.2.1.4）是纖維素酶的重要組成部分，該酶主要作用于纖維素的非結晶區(qū)域，通過隨機切斷β1，4糖苷鍵，從而降解纖維素釋放出不同長度的短鏈低聚糖，如纖維寡糖、纖維三糖等[1-2]。在纖維素等物質的開發(fā)利用過程中，內切葡聚糖酶起著非常重要的作用[3]，同時內切葡聚糖酶還可以應用于飼料生產、瓶酒及果汁等的生產加工中[4-5]，是自然界纖維素類物質降解及食品工業(yè)中不可或缺的重要酶系。

內切葡聚糖酶主要由真菌和細菌分泌獲得，細菌由于生長速度快，生長周期短而備受青睞，但有限的產酶活力一直是制約細菌廣泛應用于工業(yè)生產的主要因素，因此提高細菌產內切葡聚糖酶的活力使其更適合于工業(yè)生產一直是研究的熱點[6]。為提高各菌產內切葡聚糖酶效率，國內外學者進行了大量的研究，目前主要以馴化篩選、誘變育種、基因工程、化學修飾的方法居多[7-9]，例如唐自鐘等[10]采用易錯PCR技術對枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis C-36 的內切葡聚糖酶基因進行定向進化，獲得比親本酶活力提高4.2倍的大腸桿菌突變株 F-10;寶力德等[11]將菌Bacillus.sp.bs-1的內切葡聚糖酶進行克隆并在大腸桿菌中進行了誘導表達，獲得酶活力較高的工程菌;陸寧等[12]采用定點突變技術對枯草芽孢桿菌celA 263丙氨酸殘基位點進行了不同的替換，但替換后內切葡聚糖酶的活力較野生型顯著下降?；蚬こ碳夹g無疑是國內外近年來使用的提高菌酶活力的主流技術，在獲得能分泌更高活力的內切葡聚糖酶的同時，加入內切葡聚糖酶產酶促進因子則可使相關高產菌株產酶效率更進一步提升，與高產菌種形成互補作用，目前關于內切葡聚糖酶促進因子的研究甚少，主要體現(xiàn)在添加特異金屬離子或者表面活性劑等方法以提高酶活力[13]，但提高的效率極其有限，因此尋找其他未知內切葡聚糖酶促進因子，以進一步提高酶的活力，可為其更好的應用于工業(yè)生產發(fā)揮無可替代的作用。

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis作為我國獲得批準可用作飼料添加劑的一類益生細菌，由于其抗逆性強、營養(yǎng)要求低、易儲存等獨特的生物學特性已被廣泛研究[14]。本研究通過前期篩選工作，獲得可高產內切葡聚糖酶的枯草芽孢桿菌SB13，同時發(fā)現(xiàn)單獨采用豆腐黃漿水即可培養(yǎng)菌SB13，且采用黃漿水為培養(yǎng)基時菌SB13產內切葡聚糖酶的活力都得到極大的提高[15]，為了進一步提高菌產內切葡聚糖酶的活力，本研究以有益生特性的枯草芽孢桿菌SB13為研究對象，以離子、多糖及從豆腐黃漿水中提取獲得的大豆多糖、大豆異黃酮等物質為對象進行內切葡聚糖酶促進因子的篩選，通過最優(yōu)促進因子及組合篩選，獲得枯草芽孢桿菌SB13產內切葡聚糖酶的促進因子。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis SB13（CGMCC No.8867）為實驗室自有菌種，并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

1.1.2 試劑與耗材 無水乙醇和丙酮（國藥集團化學試劑有限公司）;三氯乙酸（國藥集團化學試劑有限公司）;3，5二硝基水楊酸（國藥集團化學試劑有限公司）;VB1（天津市福晨化學試劑廠）;VB2（湖北廣濟藥業(yè)股份有限公司）;MgSO4（天津市大茂化學試劑廠）;羧甲基纖維素鈉和KH2PO4（西隴化工股份有限公司）;Na2HPO4·12H2O（西隴化工股份有限公司）;酒石酸鉀鈉（國藥集團化學試劑有限公司）;苯酚（天津市大茂化學試劑廠）;亞硫酸鈉（聯(lián)試化工試劑有限公司）;Tween 20（天津市凱通化學試劑有限公司）;Tween 80（國藥集團化學試劑有限公司）;香菇多糖、黃芪多糖、普魯蘭糖、殼聚糖和幾丁質均來自北京索萊寶科技有限公司，即用型透析袋購自默瑞生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 pH計 FE20[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]，電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）、Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機（力康發(fā)展香港有限公司），雙層小容量空氣浴恒溫搖床NS2102C（上海皓莊儀器有限公司），Cary50型紫外可見分光光度計（美國瓦里安技術中國有限公司），SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.1.4 試驗材料 基礎培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%牛肉膏、1% NaCl、純凈水調整至100%、pH 7.0、高壓滅菌后保存待用。大豆多糖：取豆腐廢水（自制）濃縮至10%，加入15%三氯乙酸晶體，混勻，4℃、8500 r·min-1離心5 min。去沉淀取上清液，加入4倍體積無水乙醇混勻，4℃、8500 r·min-1離心5 min，棄去上清液，向沉淀中加入適量丙酮混勻，洗滌2～3次，離心、風干獲得粗多糖。大豆蛋白：取100 mL豆腐廢水加入76.75 g硫酸銨固體，使其均勻溶解，在25℃、8500 r·min-1離心5 min，棄去上清液，向沉淀中加入5 mL磷酸緩沖液混勻，透析袋透析去除硫酸銨。

1.2 試驗方法

1.2.1 促進因子篩選 以枯草芽孢桿菌SB13為對象，分別稱取各種離子、維生素、大豆多糖、大豆異黃酮、大豆蛋白及Se等因子溶于含有50 mL基礎培養(yǎng)基的錐形瓶中，以未加物質的基礎培養(yǎng)基為對照，調pH至7.0，121℃、20 min高壓滅菌，根據(jù)1%的量接種菌SB13母液，37℃、160 r·min-1恒溫培養(yǎng)20 h，每一處理3個重復，即獲得菌SB13發(fā)酵液。以發(fā)酵液內切葡聚糖酶相對活性為指標，分析各因子對菌SB13產內切葡聚糖的促進效果，其中內切葡聚糖酶活力檢測方法為：吸取各樣品發(fā)酵液2 mL，10000 r·min-1，4℃離心10 min獲得胞外上清液，DNS法檢測上清液中內切葡聚糖酶活力，酶活計算等參考Guan等[15]?；诙嗵堑姆N類繁多，研究同時分析香菇多糖、黃氏多糖、殼聚糖、普魯蘭糖和幾丁質對菌SB13產內切葡聚糖酶的促進效果，最終確定最佳促進因子類型。

1.2.2 促進因子的濃度篩選 在基礎培養(yǎng)基中分別加入VB1和VB2至終濃度分別為（w/v） 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%，Mg2+（w/v 0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0 %），多糖（w/v 0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%），接種枯草芽孢桿菌SB13，160 r·min-1、37℃培養(yǎng)20 h，檢測胞外液中內切葡聚糖胞外酶活力，確定最佳促進濃度。

1.2.3 正交試驗篩選最優(yōu)促進組合 采用L934正交法對MgSO4、VB1、VB2、大豆多糖四因子及濃度進行枯草芽孢桿菌SB13產酶切葡聚糖酶活性檢測分析，篩選出菌產內切葡聚糖酶的最優(yōu)發(fā)酵條件組合，各因素添加濃度見表1。

1.2.4 枯草芽孢桿菌SB13產內切葡聚糖酶促進溫度及pH值優(yōu)化 根據(jù)最優(yōu)促進濃度、分別在基礎培養(yǎng)基中加入各促進因子，進行不同溫度（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃），不同發(fā)酵pH值（5～9）條件下菌SB13產內切葡聚糖酶的活力檢測分析，篩選出最優(yōu)產酶促進溫度及pH值。

2 結果與分析

2.1 促進因子篩選

2.1.1 各因子對枯草芽孢桿菌SB13產內切葡聚糖酶的影響 從表2可知，MgSO4、VB1、VB2、大豆多糖對菌SB13產內切葡聚糖酶的相對酶活分別為114.66%、111.24%、165.72% 和152.61%，說明以上物質對菌SB13產內切葡聚糖酶有極好的促進作用，其中大豆多糖及VB2可提高對內切葡聚糖的產酶率達50%以上。

2.1.2 多糖類物質對菌產內切葡聚糖酶的影響 由圖1可知，香菇多糖、黃氏多糖對菌SB13產內切葡聚糖酶有顯著的促進作用，相對酶活分別達到197.44%和186.95%，與大豆多糖（194.07%）效果相當，最終挑選大豆多糖為產內切葡聚糖酶的最佳促進因子。

2.2 促進因子最優(yōu)條件組合

2.2.1 各促進因子最適促進濃度優(yōu)化 由圖2可知，VB1（圖2a）、大豆多糖（圖2d）對菌SB13產內切葡聚糖酶的最佳促進濃度分別為0.2%和0.8%;VB2（圖2b）、MgSO4（圖2C）對菌SB13最佳促進濃度分別為0.4%和1.5%。由于濃度為0.6%～1.5%的MgSO4對菌SB13促進效果差異不顯著，故選0.6%最為最佳促進濃度。

2.2.2 正交試驗篩選因子最佳條件組合 正交法L934分析促進因子VB1、VB2、Mg2+、大豆多糖對菌SB13產內切葡聚糖酶最佳促進組合（表4）。極差R值大小可見，各因子對菌產內切葡聚糖酶的影響為B>D>A>C（菌SB13），即VB2影響最大，大豆多糖次之，VB1、鎂離子影響最小;最優(yōu)促進組合為A3B3C3D1（菌SB13），產內切葡聚糖酶的最優(yōu)工藝條件為0.2%VB1、0.5%VB2、1.6%Mg2+、0.4%大豆多糖。

2.3 各因子對菌SB13產內切葡聚糖酶的最適發(fā)酵條件

2.3.1 最適溫度優(yōu)化 由圖3可知，溫度在30℃時，加入MgSO4、VB1、VB2、大豆多糖及最優(yōu)組合后，菌SB13的內切葡聚糖酶活力分別為0.80、0.50、0.97、1.27和1.44 U·mL-1，均高于對照組的0.48 U·mL-1，各因子酶活力分別是對照的1.67、1.04、2.02、2.65和3倍，表現(xiàn)出極好的促進作用，故選取30℃作為各因子促進菌SB13的最佳促進溫度。

2.3.2 最適pH值優(yōu)化 分析不同pH值條件下，各促進因子對菌SB13的產酶效果，由圖4可知，當pH值為7.0時，加入MgSO4、VB1、VB2、大豆多糖及最優(yōu)組合后，菌SB13的內切葡聚糖酶活力分別為0.52、0.67、0.76、0.95和1.07（U·mL-1），均高于對照0.49 U·mL-1，各因子酶活力分別是對照的1.06、1.37、1.55、1.94和2.18倍，故選擇7.0為最適促進pH值。

3 結論與討論

本研究系統(tǒng)地分析了各種離子、各種維生素、大豆蛋白、大豆異黃酮、EDTA、大豆多糖及其他部分物質的多糖對枯草芽孢桿菌SB13產內切葡聚糖酶的影響，發(fā)現(xiàn)MgSO4、VB1、VB2、香菇多糖、黃氏多糖和大豆多糖對其產酶有促進作用，其中VB2、香菇多糖、黃氏多糖和大豆多糖促進效果極顯著。為了進一步提高菌SB13等產內切葡聚糖酶的發(fā)酵工藝，本研究確定Mg2+、VB1、VB2和大豆多糖為主要內切葡聚糖酶促進因子進行了因子組合優(yōu)化及條件優(yōu)化分析。

通過對各因子加入量的優(yōu)化，各因子對菌SB13促產內切葡聚糖酶的最佳促進濃度分別為（w/v）：MgSO4 0.6%、VB1 0.2%、VB2 0.4%和大豆多糖 0.8%，采用正交法L934對四因子進行了最優(yōu)條件組合分析，確定菌SB13的最優(yōu)發(fā)酵條件組合為0.2 % VB1、0.5 % VB2、1.6% MgSO4、0.4% 大豆多糖，優(yōu)化獲得最優(yōu)促進溫度為30℃，最優(yōu)促進pH值為7.0。本研究通過對促進因子的篩選及條件優(yōu)化，最終使枯草芽孢桿菌SB13產內切葡聚糖酶的活力提高了200%，為枯草芽孢桿菌SB13更好的應用于工業(yè)生產提供研究基礎。

已有研究表明各種氮源、金屬離子、維生素的添加，會使纖維素分解酶的產生水平發(fā)生明顯的變化[16]，程旺開[17]研究金屬離子對纖維素酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)MgSO4對β葡萄糖苷酶活性具有一定的促進作用，本次研究發(fā)現(xiàn)Mg2+對菌SB13產內切葡聚糖酶有一定的促進作用，是否Mg2+也通過影響內切葡聚糖酶的活性而使內切葡聚糖酶活力得到提高，還需進一步研究。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)纖維素的酶解產物之一纖維二糖能被吸收進入細胞內誘導諸多真菌產纖維素酶[18]，這些水解的纖維二糖主要通過與定位于細胞膜上的纖維二糖轉運蛋白Crtl相結合后形成纖維素酶誘導信號經(jīng)下游信號途徑的傳遞進入細胞核激活纖維素酶的表達[19]。除了纖維二糖，多種其他類型的二糖也被證實能直接誘導真菌產纖維素酶：Mandels等[20]發(fā)現(xiàn)，從含有雜質的試劑級的葡萄糖中分離出的槐糖（由2個葡萄糖分子經(jīng)過β1，2糖苷鍵連接所形成） 可直接誘導里氏木霉產纖維素酶，其誘導活性是纖維二糖的2500倍，是微晶纖維素等其他誘導物的幾十到幾千倍，但槐糖卻不能誘導其他菌如青酶、曲霉及枯草芽孢桿菌等產纖維素酶;乳糖（由葡萄糖及半乳糖經(jīng)過β1，4糖苷鍵連接形成）也可以直接誘導里氏木霉和其他真菌產纖維素酶，該糖對里氏木霉的誘導能力弱于槐糖，但可顯著促進絲狀真菌Acremoniumcellulolyticus高效合成纖維素酶[21]。山梨糖則通過在轉錄水平上調控6種纖維素酶基因的表達，影響細胞壁蛋白的糖基化，降低細胞壁的形成來提高內切葡聚糖苷酶Ⅰ和外切葡聚糖苷酶Ⅱ的分泌和表達

[22-23]。本研究基于這樣的啟示，從豆腐黃漿水中提取分離了大豆多糖，并發(fā)現(xiàn)其同樣對菌SB13產內切葡聚糖酶有極顯著的促進作用，是否大豆多糖通過其酶解產物促進內芽孢桿菌對內切葡聚糖的分泌，其促進機理有待進一步探索。

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（責任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-09-10

作者簡介：官雪芳，女，1979年生，碩士研究生，助理研究員，主要從事微生物學應用研究。

通信作者：林斌，男，1964年生，博士研究生，研究員，主要從事農業(yè)廢棄物資源化利用（E-mail：linbin591@126.com）。

基金項目：福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項（2019R1032-4）;福建省農業(yè)科學院“十三五”食品加工科技創(chuàng)新團隊（CXTD2021032）。