毛騰霄+葉華智+秦玉花

摘要：從玉米植株的莖基部葉鞘分離得到枯草芽孢桿菌菌株（Bacillus subtilis BS-8D）。田間小區(qū)防病試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對玉米紋枯病有較好的防效。采用抗利福平標(biāo)記突變菌株BS-8Drif測定其定殖能力，結(jié)果顯示該菌株在玉米葉鞘上有較好的定殖能力，施用10 d后仍能保持較高密度。對BS-8D菌株拮抗機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，菌株無菌培養(yǎng)液能抑制玉米紋枯病菌（Rhizoctoia solani）核萌發(fā)和菌絲生長。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；玉米紋枯病；生物防治；抗菌物質(zhì)；田間試驗(yàn)

中圖分類號：S435.131；S476+.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5252-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.022

Abstract：Antagonistic agents of Bacillus subtilis BS-8D was isolated from the sheaths and rhizosphere of corn. The results showed that the strain BS-8D could control effectively corn sheath blight caused by the Rhizoctonia solani in field. BS-8D could colonize， propagate and remain high population at sheaths for more than ten days. The highest colonizing level was reached on 10th day after inoculation. The mechanism study of BS-8 d antagonism showed that the culture filtrate from BS-8D had a strong inhibiting activity against Rhizoctoia solani sclerotium germination and the growth of mycelia.

Key words： Bacillus subtilis； maize sheath blight； biocontrol； antagonistic substance； field experiment

玉米紋枯病主要是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的土傳病害[1-3]，該病菌侵染玉米基部葉鞘并向上部葉鞘發(fā)展，可危害莖稈和果穗，其典型癥狀是形成不規(guī)則的云紋狀病斑，嚴(yán)重時(shí)造成玉米減產(chǎn)。該病已成為玉米上的主要病害之一。由于缺乏高抗玉米品種，生產(chǎn)上對紋枯病的防治主要施用井岡霉素[4]，由于防治方法單一，容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性[5]。因此，急需尋找其他有效、環(huán)保的防治途徑。

本研究測定了枯草芽孢桿菌BS-8D菌株培養(yǎng)液對玉米紋枯病的田間小區(qū)防治效果，并通過該菌株在玉米葉鞘定殖的消長情況，對其作用機(jī)理作初步研究，以期為玉米紋枯病的防治提供新的方法和參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基有營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NA）、營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基（NA）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PD）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。井岡霉素5%水劑（使用時(shí)配成1 000倍稀釋液），由武漢科諾生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.2 供試材料與試驗(yàn)菌

供試玉米為川單15號，精選、催芽，選取發(fā)芽一致的種子備用。

拮抗菌菌液制備：菌株為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系分離得到的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis BS-8D）。將菌株接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于35 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，制成菌體濃度約為107 CFU/mL的懸液，備用。

病原菌接種體制備：玉米紋枯病病原菌（AG1-IA）為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系提供的強(qiáng)致病菌株。采用麥粒培養(yǎng)基，將R. solani在PDA平板上活化后，用內(nèi)徑5 mm打孔器打孔，將菌絲圓片接種到盛有滅菌麥粒的三角瓶中。28 ℃培養(yǎng)7 d左右，待菌絲在麥粒上充分生長后，作接種體用。

1.3 田間小區(qū)防病效果試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)3種處理：①土壤接種病原菌處理（CK）：將病原菌麥粒接種體施入到玉米窩內(nèi)土壤中，均勻分散于表層6 cm范圍內(nèi)，每窩15 g，播種后覆土；②土壤接種病原菌+拮抗菌菌液拌種處理（BS-8D）：接種病原菌后，種子用拮抗菌菌液拌種4 h后播種；③土壤接種病原菌+井岡霉素拌種處理（井岡霉素）：接種病原菌，種子用井岡霉素拌種后播種。每處理小區(qū)面積為6.0 m×6.0 m，重復(fù)2次。種植方式采用窩距50 cm，行距50 cm，每窩播種5粒，出苗后間苗為2 株/窩，每小區(qū)242株。試驗(yàn)1年1次，重復(fù)2年。

苗期處理：待玉米植株長到4葉期，各處理分別用清水、拮抗菌液和井岡霉素均勻噴施植株基部。

成株期處理：待植株生長到拔節(jié)前期和喇叭口期時(shí)，再次噴施，方法同苗期。

病情調(diào)查：待植株抽穗后，調(diào)查病斑上升的葉鞘位，按以下5級標(biāo)準(zhǔn)記載病級[6]。0級，全株不發(fā)??；1級，果穗位下第4葉鞘及以下葉鞘發(fā)病；2級，果穗位下第3葉鞘及以下葉鞘發(fā)?。?級，果穗位下第2葉鞘及以下葉鞘發(fā)??；4級，果穗位下第1葉鞘及以下葉鞘發(fā)??；5級，果穗位及以上葉鞘發(fā)病。

1.4 拮抗菌株在玉米葉鞘上的消長動態(tài)測定

1.4.1 抗藥性菌株的篩選和標(biāo)記 為研究拮抗菌株在田間玉米葉鞘上的消長動態(tài)，進(jìn)行了抗利福平標(biāo)記[7]。拮抗菌培養(yǎng)72 h，將菌懸液涂抹于NA平板上，在黑暗條件下用40 W紫外燈距離40 cm照射3～10 min，以95%菌體死亡為最佳處理時(shí)間。經(jīng)誘變后的菌株在無光條件下培養(yǎng)，以后接種到含利福平的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)；再逐步接種到含利福平濃度逐級升高的培養(yǎng)基上，最后純化培養(yǎng)于含300 μg/mL利福平的NA平板培養(yǎng)基上。挑單菌落純化3次，選取拮抗性穩(wěn)定的作為供試菌的抗利福平標(biāo)記菌株。

1.4.2 標(biāo)記菌株在葉鞘上的動態(tài)消長測定 取在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h的利福平標(biāo)記菌株的菌液（濃度約為107 CFU/mL），加0.1%的吐溫-20（以增強(qiáng)展著力），噴霧接種于抽雄期玉米植株近地面健康葉鞘上，處理后1 h，取樣分離作為初始菌量，以后分別在處理后2、4、6、8、10、12、16、18 d，取樣分離1次，直至葉鞘表面菌量大幅下降為止。每次取樣時(shí)用無菌刀片隨機(jī)在各植株噴菌于葉鞘表面，共劃取10塊2.0 cm×3.0 cm大小的組織，剪碎后用50 mL無菌生理鹽水振蕩洗滌30 min，梯度稀釋，取0.1 mL不同稀釋度洗滌液涂布于含利福平濃度為300 μg/mL的NA平板培養(yǎng)基上，每稀釋梯度3皿，35 ℃下培養(yǎng)72 h，記載菌落數(shù)。菌量用CFU/cm2表示，根據(jù)接種后測定時(shí)間和所測得的菌量繪制出標(biāo)記菌株的種群消長曲線。

1.5 拮抗菌株無菌濾液對R. solani菌核萌發(fā)的影響

將已融化的瓊脂均勻涂布于無菌載玻片上，待其凝固后，放在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)的兩支玻璃棒上，每皿兩片。皿內(nèi)加5 mL無菌水保濕。選大小基本一致的PDA平板新培養(yǎng)的R. solani菌核依次經(jīng)75%乙醇、0.1%升汞表面消毒5～30 s后，經(jīng)無菌水洗滌，稍晾干，再于拮抗菌培養(yǎng)72 h的無菌濾液和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（CK）中浸潤10 s，然后放在瓊脂玻片上，每片5粒，粒距1.5 cm，每處理12片（60粒）。蓋上培養(yǎng)皿蓋，28 ℃培養(yǎng)，分別于48、72、85 h后鏡檢萌發(fā)情況。

萌發(fā)菌絲指數(shù)測定[8]：在玻片背面以菌核為圓心半徑為2 mm劃一圓圈，低倍鏡下觀察，自菌核長出圈外者定為萌發(fā)菌絲，萌發(fā)菌絲按以下標(biāo)準(zhǔn)分6級。0級，萌發(fā)核絲數(shù)為0；1級，萌發(fā)菌絲數(shù)為1～20；2級，萌發(fā)菌絲數(shù)為21～50；3級，萌發(fā)菌絲數(shù)為51～80；4級，萌發(fā)菌絲數(shù)為81～140；5級，萌發(fā)菌絲數(shù)≥141。按以下公式計(jì)算萌發(fā)菌絲指數(shù)。

1.6 無菌濾液對R. solani的抗生作用

將拮抗菌BS-8D培養(yǎng)72 h的無菌濾液按10%比例加入到無菌PD培養(yǎng)基中，然后接種生長旺盛的R. solani菌絲塊，于28 ℃下培養(yǎng)8 d，挑取少許培養(yǎng)的菌絲，用棉藍(lán)乳酚油染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)等特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間小區(qū)防病效果

BS-8D菌株對成株期玉米紋枯病的防治效果見表1。從病情擴(kuò)展速度看，BS-8D菌液處理與對照相比，病斑上升到的葉鞘位平均降低1.2 cm左右；從病情指數(shù)上看，BS-8D菌液處理低于對照，差異達(dá)顯著水平，相對防效為41.12%。而BS-8D處理植株與井岡霉素處理相比，病情指數(shù)高于井岡霉素，且差異顯著，其相對防效低于井岡霉素的63.01%。說明BS-8D菌株在田間具有一定的防病效果，但效果較井岡霉素仍有一定差距。

2.2 拮抗菌株在玉米葉鞘上消長動態(tài)的測定

2.2.1 抗藥性菌株的篩選和標(biāo)記 通過利福平從低濃度到高濃度逐級誘變及誘變后的拮抗性檢測，獲得了耐利福平濃度300 μg/mL的突變株BS-8Drif。

2.2.2 標(biāo)記菌株在玉米葉鞘上的動態(tài)消長測定 拮抗菌BS-8Drif在田間玉米葉鞘上的定殖、消長動態(tài)見圖1。接種后，葉鞘上菌量呈明顯下降趨勢，第4 天下降了69.7%，這段時(shí)間稱為適應(yīng)期。此后，菌量逐步上升，至第8天菌量達(dá)到最高，是初始帶菌量的1.91倍，這段時(shí)間稱為繁殖期。此后，菌量呈下降趨勢?？梢娋暝谌~鞘表面維持較高數(shù)量可達(dá)10 d以上。

2.3 拮抗機(jī)理的探討

2.3.1 無菌濾液對R. solani菌核萌發(fā)的影響 BS-8D無菌培養(yǎng)液對R. solani菌核萌發(fā)的影響見表2、圖2。由表2可知，培養(yǎng)72 h后，菌核萌發(fā)指數(shù)和菌落直徑分別比對照降低98.11%和57.41%，培養(yǎng)85 h后，抑制作用也十分明顯，兩項(xiàng)指標(biāo)與對照相比分別降低60.04%和30.80%。由圖2可以看出，菌核用BS-8D無菌濾液處理后，72 h內(nèi)未觀察到菌核萌發(fā)，85 h后可見少量菌絲萌發(fā)，而對照處理72 h時(shí)已大量萌發(fā)。

2.3.2 抗菌物質(zhì)對R. solani的抗生作用 顯微觀察發(fā)現(xiàn)，R. solani正常菌絲為淡褐色至褐色（圖3-A）。經(jīng)BS-8D無菌濾液作用后的R. solani菌絲，在拮抗菌BS-8D的作用下，菌絲顏色加深，壁加厚，有些菌絲膨大內(nèi)部形成球狀顆粒（圖3-B）；有些菌絲隔膜增加，菌絲變?yōu)闄E圓形或念珠狀（圖3-D）；有些菌絲變粗，細(xì)胞壁被破壞，原生質(zhì)外溢而造成菌絲空殼（圖3-C、圖3-D）；有些菌絲細(xì)胞出現(xiàn)畸形、裂解和斷裂（圖3-D）。

3 小結(jié)與討論

本研究從玉米植株根際分離到拮抗玉米紋枯病菌的芽孢桿菌菌株BS-8D，解決了外來菌株難于在作物上定植的問題。田間小區(qū)試驗(yàn)、葉鞘定植試驗(yàn)表明，該菌株對玉米紋枯病有較好的防病效果，能在葉鞘表面定植較長時(shí)間，說明與病原菌有相似的生態(tài)適應(yīng)性。采用噴施BS-8D菌懸液防治紋枯病，其防效與當(dāng)前主流農(nóng)藥井崗霉素相比仍有一定差距，說明還需要進(jìn)一步研究，如施用方式、施用濃度、有效成分、菌劑制作等。因此，未來仍需通過不同地域大面積田間試驗(yàn)來進(jìn)一步證明其實(shí)用效果，并篩選拮抗菌田間施用的最佳濃度，在此基礎(chǔ)上開展菌株的遺傳穩(wěn)定性、對人畜的安全性、菌劑的生產(chǎn)等方面的試驗(yàn)研究工作。

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