王 芳 陸志民 王 君 張世凱 李峪曦 李紹臣 張建秋 楊雨春*

（1. 吉林省林業(yè)科學(xué)研究院，長(zhǎng)春 130000；2. 東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

溫度是影響林木生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，對(duì)林木生長(zhǎng)發(fā)育起至關(guān)重要的作用。林木只有在最適溫度條件下才能表現(xiàn)出最大產(chǎn)量，如果生存溫度過(guò)高或者過(guò)低，林木生長(zhǎng)的新陳代謝及生理過(guò)程均會(huì)發(fā)生變化［1］。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于低溫脅迫的研究越來(lái)越詳細(xì)，逐漸由低溫脅迫下表型、生理生化向分子研究轉(zhuǎn)變。在諸多體現(xiàn)低溫脅迫的生理指標(biāo)中，光合作用是最先，也是最容易測(cè)定的指標(biāo)之一，也是判斷植物抗逆性強(qiáng)弱的重要因素［2］。在低溫脅迫下，低溫可以降低植物光合過(guò)程中相關(guān)酶活性，導(dǎo)致光合速率下降［3］，但由于應(yīng)對(duì)不同脅迫溫度與脅迫時(shí)間［4］，植物生長(zhǎng)與生理指標(biāo)可表現(xiàn)較大差異。

紅松（Pinus koraiensis）與西伯利亞紅松（Pinus sibirica）是中國(guó)東北以及俄羅斯等寒溫帶地區(qū)生長(zhǎng)的重要頂級(jí)群落樹(shù)種，對(duì)其研究較多，重點(diǎn)在良種選育［5］、木材特性［6］、育苗技術(shù)［7］、生態(tài)效益［8］、分子結(jié)構(gòu)［9］等，而對(duì)于紅松與西伯利亞紅松光合特性研究較少［10］。20 世紀(jì)80 年代，紅松曾大量引種至大興安嶺北坡寒冷地區(qū)，但由于抗寒性較差，全部死亡［11］，之后在東北林業(yè)大學(xué)科研團(tuán)隊(duì)的帶領(lǐng)下，大興安嶺林區(qū)大量引種西伯利亞紅松，至今已經(jīng)開(kāi)花、結(jié)實(shí)、育苗，表明大興安嶺北坡等寒冷地區(qū)引種西伯利亞紅松是可行的，也表明西伯利亞紅松與紅松的抗低溫能力具有較大差異，西伯利亞紅松較紅松具有更強(qiáng)的耐寒性。為探討低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松的生理響應(yīng)機(jī)制及抗寒生理機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)紅松和西伯利亞紅松幼苗的質(zhì)膜透性、超氧化物歧化酶、可溶性糖等10個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)紅松與西伯利亞紅松幼苗在高于-40℃的低溫脅迫下植株均可正常生長(zhǎng)，各指標(biāo)均體現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)，而-60℃和-80℃時(shí)2 個(gè)樹(shù)種幼苗均已冰凍致死［12］。基于以上研究背景，本研究以西伯利亞紅松和紅松為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)低溫脅迫下（高于-40℃的低溫）幼苗的光合特性、氣孔特性進(jìn)行測(cè)定分析，進(jìn)一步探究低溫脅迫下兩樹(shù)種間的光合指標(biāo)、氣孔特性及形態(tài)等變化情況，為紅松以及西伯利亞紅松抗寒研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紅松與西伯利亞紅松的種子分別來(lái)自中國(guó)吉林省龍井市（129°45′E，42°40′N）和俄羅斯新西伯利亞（82°55′E，55°2′N），新西伯利亞的年均溫、1月氣溫和7 月氣溫分別是0.2℃、-18.8℃和19.0℃［5］，龍井的年均溫、1 月氣溫和7 月氣溫分別是5.3℃、-13.4℃和21.2℃［13］。西伯利亞和龍井的最低溫分別是-60℃和-34.8℃［14］。2010 年采種，次年播種，4年后選擇生長(zhǎng)健壯的紅松和西伯利亞紅松幼苗放在東北林業(yè)大學(xué)白樺強(qiáng)化種子園中進(jìn)行培育。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3 個(gè)脅迫溫度（0℃、-20℃和-40℃）和3個(gè)脅迫時(shí)間（6、24和48 h），以20℃（室溫）為對(duì)照，共計(jì)10 個(gè)處理。各樹(shù)種在不同處理?xiàng)l件下分別以24株為實(shí)驗(yàn)材料。低溫處理利用低溫光照培養(yǎng)箱（丙林SPX-800FT（-22℃～60℃））和海爾DW-40W380（-20℃～-40℃）進(jìn)行，將栽植于容器內(nèi)的幼苗直接放入相應(yīng)的低溫儀器中處理，低溫處理后，恢復(fù)30 min 進(jìn)行光合指標(biāo)與氣孔性狀的測(cè)定。采用美國(guó)lico 公司生產(chǎn)的lico-6400 光合儀對(duì)不同單株第二輪枝條上的針葉進(jìn)行各光合指標(biāo)測(cè)定，測(cè)量時(shí)，光照強(qiáng)度和CO2分別設(shè)定為1 600μmol·m-2·s-1和400 μmol·mol-1，其他環(huán)境因子不進(jìn)行控制，儀器輸出數(shù)據(jù)主要包括瞬時(shí)光合速率（Pn，μmol·m-2·s-1）、蒸騰速率（Tr，μmol·m-2·s-1）和氣孔導(dǎo)度（Gs，mol·m-2·s-1）等。氣孔的觀察采用掃描電鏡法，用NeoScope 型臺(tái)式掃描電鏡觀察不同處理的針葉并拍照。利用CellSens Entry 顯微圖像軟件測(cè)得氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)寬度和氣孔開(kāi)度等信息。

氣孔面積［15］=3.14×（保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度/2×氣孔開(kāi)度/2）

在對(duì)光合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，-20℃時(shí)兩樹(shù)種的凈光合速率已出現(xiàn)負(fù)值，因此未對(duì)-40℃處理的苗木進(jìn)行光合指標(biāo)的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下光合特性的t檢驗(yàn)

t 檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。在室溫（20℃）和任一低溫處理?xiàng)l件下，各光合指標(biāo)在紅松與西伯利亞紅松中的差異是顯著的（P＜0.05），表明紅松與西伯利亞紅松在正常狀態(tài)下和在應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)的光合能力均具有顯著差異。

表1 不同處理?xiàng)l件下各光合指標(biāo)的t檢驗(yàn)Table 1 t test of each photosynthetic index under different treatments

2.2 紅松與西伯利亞紅松光合特性的方差分析比較

本研究以不同處理為變異來(lái)源，進(jìn)行單因素方差分析（見(jiàn)表2）。紅松與西伯利亞紅松在不同處理?xiàng)l件下各測(cè)定指標(biāo)差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01），表明低溫以及低溫脅迫時(shí)間對(duì)紅松與西伯利亞紅松各光合指標(biāo)影響較大。

2.3 低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松的凈光合速率

不同處理?xiàng)l件下紅松與西伯利亞紅松凈光合速率見(jiàn)圖1，在室溫（20℃）條件下，紅松與西伯利亞紅松凈光合速率Pn分別為14.65和11.95μmol·m-2·s-1，隨著溫度降低與脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，這兩個(gè)樹(shù)種凈光合速率均呈顯著下降趨勢(shì)，在0℃處理?xiàng)l件下，2個(gè)樹(shù)種穩(wěn)步下降，但是在-20℃處理?xiàng)l件下，紅松凈光合速率急劇下降，脅迫6 h 后平均凈光合速率只有0.66 μmol·m-2·s-1，在脅迫24 與48 h 均達(dá)負(fù)值。西伯利亞紅松在-20℃處理后6 h 平均凈光合速率顯著高于紅松，達(dá)到3.81μmol·m-2·s-1，在脅迫24 h后平均凈光合速率也在0 以上（0.34μmol·m-2·s-1），在脅迫48 h后達(dá)到負(fù)值。

2.4 低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松的氣孔導(dǎo)度

不同處理?xiàng)l件下，紅松與西伯利亞紅松氣孔導(dǎo)度Gs見(jiàn)圖2。在室溫（20℃）條件下，紅松與西伯利亞紅松Gs分別為0.682 和0.589 mol·m-2·s-1，隨著溫度降低與脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，這兩個(gè)樹(shù)種Gs均呈顯著下降趨勢(shì)。在0℃處理?xiàng)l件下，2 個(gè)樹(shù)種的Gs均隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)穩(wěn)步下降，變化范圍分 別 為0.506～0.291 mol·m-2·s-1和0.386～0.208 mol·m-2·s-1，但是在-20℃處理?xiàng)l件下，紅松Gs急劇下降，脅迫6 h 后平均Gs只有0.036 mol·m-2·s-1，在脅迫24 與48 h 分別為0.029 和0.028 mol·m-2·s-1。西伯利亞紅松在-20℃處理后6 h 平均Gs比紅松高3.75倍，達(dá)到0.135 mol·m-2·s-1，在脅迫24與48 h的Gs分別為0.022和0.018 mol·m-2·s-1。

表2 不同處理?xiàng)l件下紅松與西伯利亞紅松各光合指標(biāo)的方差分析Table 2 Variance analysis of photosynthetic indices of P.koraiensis and P.sibirica under different treatments

2.5 低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松的蒸騰速率

不同處理?xiàng)l件下紅松與西伯利亞紅松蒸騰速率Tr見(jiàn)圖3。在室溫（20℃）條件下，紅松與西伯利亞紅松蒸騰速率Tr分別為2.485和2.096μmol·m-2·s-1，隨著溫度降低與脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，這兩個(gè)樹(shù)種Tr均呈顯著下降趨勢(shì)。在0℃處理?xiàng)l件下，2 個(gè)樹(shù)種穩(wěn)步下降，變化范圍分別為1.840～1.154 和1.408～0.816μmol·m-2·s-1。在-20℃處理?xiàng)l件下，紅松Tr急劇下降，脅迫6 h 后平均Tr只有0.144μmol·m-2·s-1，在脅迫24與48 h分別為0.117和0.114μmol·m-2·s-1。西伯利亞紅松在-20℃處理后6 h平均Tr是紅松的3.67倍，達(dá)到0.529 μmol·m-2·s-1，在脅迫24 與48 h 的Tr分別為0.089和0.072μmol·m-2·s-1。

2.6 氣孔特性的t檢驗(yàn)

5 個(gè)氣孔特性相關(guān)指標(biāo)的t 檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。紅松的氣孔密度與西伯利亞紅松的氣孔密度差異顯著（P＜0.05），保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)、保衛(wèi)細(xì)胞寬、氣孔開(kāi)度和氣孔面積在紅松與西伯利亞中差異不顯著。

2.7 紅松與西伯利亞紅松氣孔特性比較的方差分析

各氣孔特性相關(guān)指標(biāo)的雙因素方差分析見(jiàn)表4。不同溫度條件下，紅松與西伯利亞紅松氣孔開(kāi)度與氣孔面積差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01），其余各指標(biāo)差異均未達(dá)顯著水平。不同時(shí)間或不同的溫度×?xí)r間的互作對(duì)各指標(biāo)沒(méi)有顯著影響，差異不顯著。因此以下僅研究了不同溫度下紅松與西伯利亞紅松形態(tài)和特征。

表3 各氣孔特性指標(biāo)的t檢驗(yàn)Table 3 t test of each stomatal character index

表4 紅松和西伯利亞紅松氣孔各測(cè)定指標(biāo)的雙因素方差分析Table 4 Two-way ANOVA of each index for P.koraiensis and P.sibirica

2.8 不同低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松的氣孔形態(tài)及特征

脅迫前紅松與西伯利亞紅松的氣孔均為橢圓形（見(jiàn)圖4：A，E），隨著溫度的降低，紅松與西伯利亞紅松針葉氣孔呈現(xiàn)相同變化趨勢(shì)，從對(duì)照20℃到0℃、-20℃，氣孔開(kāi)度均顯著下降，-40℃與-20℃氣孔開(kāi)度差異不顯著。低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松具體氣孔特性見(jiàn)表5。處理前后氣孔密度變化不大，沒(méi)有顯著差異，紅松與西伯利亞紅松變化范圍分別為2.0×10-4～2.4×10-4（個(gè)·μm-2）和2.0×10-4～2.1×10-4（個(gè)·μm-2），紅松的氣孔密度顯著大于西伯利亞紅松（見(jiàn)表3）；從保衛(wèi)細(xì)胞來(lái)看，隨著溫度的降低，保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度和寬度則沒(méi)有顯著差異，紅松與西伯利亞紅松保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度變化范圍分別為42.63～45.95μm 和43.06～45.10μm，保衛(wèi)細(xì)胞寬度變化范圍分別為30.58～32.92 μm 和25.12～28.16 μm；低溫對(duì)紅松和西伯利亞紅松氣孔開(kāi)度以及氣孔面積影響較大，隨著低溫脅迫的加強(qiáng)，紅松氣孔開(kāi)度變化范圍為6.07～12.54μm，20℃處理?xiàng)l件下紅松氣孔開(kāi)度是-40℃處理?xiàng)l件下的2.07倍；西伯利亞紅松氣孔開(kāi)度的變化范圍為5.83～13.44μm，20℃處理?xiàng)l件下西伯利亞紅松氣孔開(kāi)度是-40℃處理?xiàng)l件下的2.31倍；低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松氣孔面積急劇下降，紅松與西伯利亞紅松氣孔面積變化范圍分別為212.15～421.38μm2和196.56～452.92μm2，最大值分別為最小值的1.99和2.30倍。

表5 不同溫度脅迫下紅松與西伯利亞紅松的氣孔特征Table 5 Stomatal characteristics of P.koraiensis and P.sibirica under different temperature stress

3 討論

光合作用是植物生長(zhǎng)和發(fā)育最重要的生理指標(biāo)之一，高光合速率一般會(huì)增加植物同化二氧化碳和水的能力，最終產(chǎn)生高生物量［16］。本研究中脅迫前紅松中的各光合指標(biāo)均顯著高于西伯利亞紅松，紅松與西伯利亞紅松凈光合速率分別為14.65 和11.95 μmol·m-2·s-1，與王曼［10］對(duì)二者之間的光合速率測(cè)定結(jié)果不同，原因可能是由于材料與測(cè)定環(huán)境不同造成的，王曼利用的是樟子松為砧木的嫁接苗，同時(shí)測(cè)定環(huán)境為室外，而本研究采用的是實(shí)生苗，在室內(nèi)進(jìn)行的光合測(cè)定實(shí)驗(yàn)，測(cè)定儀器所要求的環(huán)境因子控制的更理想。0℃的低溫處理后，紅松與西伯利亞紅松中的各光合指標(biāo)穩(wěn)步下降，但紅松中各光合指標(biāo)值仍顯著高于西伯利亞紅松，說(shuō)明0℃對(duì)兩個(gè)樹(shù)種是一個(gè)相對(duì)較弱的低溫［12］。

隨著低溫脅迫的加重，紅松與西伯利亞紅松各光合指標(biāo)值顯著降低，-20℃時(shí)急劇下降，表明低溫對(duì)二個(gè)樹(shù)種均產(chǎn)生較強(qiáng)影響，這與劉偉對(duì)黃瓜（Cucumis sativus L.）［17］、須海榮對(duì)茶樹(shù)（Camellia si?nensis L.）［3］、陳劍成對(duì)凹葉厚樸（Magnolia officina?lis subsp.biloba）［18］的研究結(jié)果相同。由于光合作用不僅與植物自身葉綠體結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與光合磷酸化、光合電子傳遞、暗反應(yīng)相關(guān)的酶活性有關(guān)，低溫不僅影響這些酶的活性，還可能造成光合機(jī)構(gòu)的損傷［19］，本研究也再一次證明低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松各生理指標(biāo)逐漸降低的合理性［12］。低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率與光合速率變化規(guī)律相近，都是逐漸降低，且紅松中各光合指標(biāo)的含量高于西伯利亞紅松，但在-20℃處理6 h 時(shí)，西伯利亞紅松的凈光合速率、蒸騰速率與氣孔導(dǎo)度顯著高于紅松，表明在瞬間低溫處理?xiàng)l件下，西伯利亞紅松抵御低溫的能力比紅松強(qiáng)，這可能是西伯利亞紅松抗寒性比紅松強(qiáng)的間接因素之一，具體原因需要進(jìn)一步研究。

氣孔是由保衛(wèi)細(xì)胞構(gòu)成的，是直接影響植物葉片光合作用的細(xì)胞器，其會(huì)隨著溫度的高低呈現(xiàn)開(kāi)放與閉合的狀態(tài)［20］。溫度變化可以影響氣孔運(yùn)動(dòng)，當(dāng)溫度過(guò)高或者過(guò)低時(shí)，氣孔會(huì)趨向關(guān)閉并引起氣孔導(dǎo)度的變化，進(jìn)一步影響植物的蒸騰速率和凈光合速率［21］。本研究中紅松中的氣孔密度顯著高于西伯利亞紅松，而氣孔長(zhǎng)、氣孔寬、氣孔開(kāi)度和氣孔面積無(wú)顯著差異，這可能是導(dǎo)致室溫（20℃）和較弱的低溫（0℃）下紅松中的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率顯著高于西伯利亞紅松的原因之一。紅松與西伯利亞紅松在低溫脅迫后，氣孔開(kāi)放程度明顯下降，表明低溫脅迫后，紅松與西伯利亞紅松會(huì)依靠大量生理代謝反應(yīng)來(lái)降低脅迫帶來(lái)的危害［22］，這也是這兩個(gè)樹(shù)種自我保護(hù)的體現(xiàn)。本研究中紅松與西伯利亞紅松光合速率下降、氣孔導(dǎo)度降低除了與低溫脅迫下各種酶活性能力下降有關(guān)以外［12］，氣孔開(kāi)放程度的降低也是重要因素之一。

總之，從低溫脅迫下光合指標(biāo)與氣孔性狀來(lái)看，紅松與西伯利亞紅松均形成系統(tǒng)的自我保護(hù)機(jī)制，但西伯利亞紅松抗寒能力比紅松稍強(qiáng)，這與二者其余生理指標(biāo)研究結(jié)果相同［12］，下一步研究應(yīng)以低溫脅迫下兩樹(shù)種的分子機(jī)理研究為主，融合轉(zhuǎn)錄組、代謝組以及蛋白質(zhì)組的測(cè)定與分析，切實(shí)為紅松與西伯利亞紅松的良種選育提供技術(shù)支撐。