袁海川 宋武 顧朝輝 李連紅 羅程鵬 徐可

前列腺癌是常見的惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，并發(fā)現(xiàn)高雄性激素或者雌性激素受體敏感性改變著，其發(fā)病率更高，嚴(yán)重威脅患者的生命，影響患者的生活質(zhì)量，因此早期診斷前列腺癌是提高和延長術(shù)后生存期的關(guān)鍵[1]。微小RNA(miR)是長度為19-25核苷酸的RNA，在真核細(xì)胞中是一類具有調(diào)節(jié)功能的非編碼RNA，其參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，并作為診斷和判斷預(yù)后的腫瘤標(biāo)記物[2,3]?，F(xiàn)常用的標(biāo)本為組織標(biāo)本，雖然準(zhǔn)確度較高，但獲取標(biāo)本為有創(chuàng)性，患者的依從性較差[4]?，F(xiàn)已經(jīng)證實尿液也是重要的標(biāo)本庫，尤其在膀胱癌、前列腺癌和腎癌中的診斷具有優(yōu)勢[5,6]。本研究通過尿液檢測miR-128a和miR-28-3p水平，觀察其在診斷前列腺癌和預(yù)測預(yù)后中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2016年12月在仁和醫(yī)院和復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院就診確診的前列腺癌患者尿液標(biāo)本117例，為前列腺癌組。年齡45～85歲，平均年齡(62.34±10.65)歲；前列腺癌特異性抗原(PSA)≥10 ng/L 38例，<10 ng/L 79例；Gleason評分≥7分77例，<7例40例；腫瘤直徑≥3 cm 54例，<3 cm 63例。選擇同期診斷為前列腺良性增生患者的尿液標(biāo)本75例，為前列腺良性增生組，其中年齡45～83歲，平均年齡(62.76±6.82)歲；選擇同期行健康體檢者尿液30例，為健康對照組，年齡45～80歲，平均年齡(62.19±7.15)歲。3組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：均行手術(shù)治療，病理確診為前列腺癌；所有的患者術(shù)前未行放療、化療和免疫治療等；均經(jīng)倫理委員會審核通過。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：其他臟器的惡性腫瘤；臨床資料不完整，無法進(jìn)行統(tǒng)計分析的患者；已行放療、化療和免疫治療的患者。

1.3 方法

1.3.1 尿液標(biāo)本的保存:患者入院時和前列腺癌患者術(shù)后1周后，禁飲食12 h后收集中后段尿液100 ml，放置低溫冰箱中保存，并在2 h內(nèi)予以離心，離心速度3 000 r/min，時間30 min，并分裝在RNA酶處理過的Eppendorf管中，保存于-80℃的冰箱。

1.3.2 實時定量PCR：取尿液上清液用紫外光光度計分別檢測在230 nm、260 nm和280 nm處的吸收值。實驗采用Primer Premier 5.0 軟件涉及引物。miR-128a引物序列，正向5’-ACACTCCAGCTGGGTCACAG

TGAACCG-3’，反向5’- CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；miR-28-3p的引物序列，正向5’-CACCTAGCTTATCAG

ACTGATGTTGATTTTTTG-3’，反向5’-AGCTCAAAAA

ATCAACATCAGTCTGATTTTTTG-3’；U6引物序列，正向5’-ATTGGAACGATACAGAAGATT-3’，反向5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。使用20 μl的cDNA 的合成反應(yīng)體系，使用PCR擴增儀，分別在26℃，42℃和85℃的溫度下，分別反應(yīng)30 min，30 min和10 min。最后將引物，定量PCR Master Mix， Taq DNA 聚合酶和cDNA 模板加入ddH2O中形成20 μl的反應(yīng)體系。反應(yīng)過程：分別在95℃，95℃和60℃，分別反應(yīng)時間3 min，12 s和40 s，總共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，測定CT值。采用2-ΔΔCT表示miR-128a和miR-28-3p相對表達(dá)量，其中ΔΔCt=前列腺癌組(CT目的基因-CTU6)-健康對照組(CT目的基因-CTU6)。每個樣本重復(fù)3次。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察3組尿液中miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平，比較術(shù)前術(shù)后前列腺癌表達(dá)水平的變化，與臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系及其在診斷和判斷預(yù)后的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 3組尿液miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平比較 前列腺癌組尿液miR-128a表達(dá)水平明顯高于前列腺良性增生組和健康對照組(P<0.01)，且前列腺良性增生組表達(dá)水平明顯高于健康對照組(P<0.01)，術(shù)后前列腺癌組尿miR-128a表達(dá)較術(shù)前明顯降低(P<0.01)；而前列腺癌組尿液miR-28-3p表達(dá)明顯低于前列腺良性增生組合健康對照組(P<0.01)，且良性前列腺增生組明顯低于健康對照組(P<0.01)，術(shù)后前列腺癌組的miR-28-3p表達(dá)水平較術(shù)前出現(xiàn)明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1 3組尿液miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平比較

2.2 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平在診斷前列腺癌的效能 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平在診斷前列腺癌具有較高的靈敏度和特異性，將miR-128a和miR-28-3p進(jìn)行Logistics分析，得方程=1.250XmiR-128a-2.351XmiR-28-3p+1.009，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測的靈敏度為76.9%，特異性為90.7%，其AUC為0.915明顯優(yōu)于單個指標(biāo)miR-128a(Z=3.859，P<0.01)和miR-28-3p(Z=2.861，P<0.01)，而miR-128a與miR-28-3p比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖1。

表2 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平診斷前列腺癌的效能

圖1 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平在診斷前列腺癌曲線下面積比較

2.3 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平與前列腺癌臨床病理因素的關(guān)系 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平與Gleason評分、腫瘤直徑、分化類型和腫瘤分期呈明顯相關(guān)性(P<0.05或<0.01)，而對年齡和PSA水平無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平與前列腺癌臨床病理因素的關(guān)系

2.4 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平與前列腺癌預(yù)后的關(guān)系 患者隨訪2年，41例患者死亡為死亡組，76例存活為存活組。死亡組的尿miR-128a表達(dá)水平明顯高于存活組(P<0.01)，而尿miR-28-3p表達(dá)水平死亡組低于存活組(P<0.01)。見表4。

表4 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平與前列腺癌預(yù)后的關(guān)系

2.5 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平在預(yù)測2年內(nèi)死亡的效能 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平在預(yù)測2年內(nèi)死亡具有較高的靈敏度和特異性，通過Logistics分析綜合兩指標(biāo)得方程=1.091XmiR-128a-3.297XmiR-28-3p-0.876，聯(lián)合檢測的靈敏度為82.9%，特異性為82.9%，其AUC為0.895明顯優(yōu)于單個指標(biāo)miR-128a(Z=2.621，P<0.01)和miR-28-3p(Z=2.168，P<0.05)，而miR-128a與miR-28-3p比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5，圖2。

表5 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平在預(yù)測2年內(nèi)死亡的效能

圖2 尿miR-128a和miR-28-3p表達(dá)水平預(yù)測2年內(nèi)死亡的效能

3 討論

診斷前列腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)是組織活檢，但患者往往出現(xiàn)癥狀活檢時已經(jīng)屬于晚期，并且屬于一種侵入性檢測手段。目前較為廣泛使用的PSA作為前列腺癌篩查和預(yù)后的重要指標(biāo)，但其特異性和靈敏度仍不盡人意。有文獻(xiàn)表明miRNA通過外泌體進(jìn)行細(xì)胞信息的傳遞，外泌體是一種囊泡樣結(jié)構(gòu)，存在血液、尿液、精液和唾液等體液中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為[7]。研究表明尿液外泌體中的miRNA可以反映細(xì)胞的代謝情況，并且發(fā)現(xiàn)尿液中的外泌體具有miRNAs含量高，且比血液等更為穩(wěn)定，能夠反映泌尿生殖系統(tǒng)的病變[8]。故尿液中外泌體的miRNA是最有潛力成為診斷前列腺癌和預(yù)后判定的重要無創(chuàng)分子標(biāo)記物[9]，為前列腺癌的診斷和預(yù)后判定開辟了一條新的路徑。

本研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組尿液表達(dá)miR-128a水平明顯高于良性前列腺增生組和健康對照組，且手術(shù)后其表達(dá)水平明顯下降，說明miR-128a參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，與前列腺癌具有明顯相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn)與Gleason評分、腫瘤直徑、分化類型和腫瘤分期具有明顯的相關(guān)性，說明尿液中miR-128a表達(dá)水平高低與前列腺癌的惡性程度具有明顯相關(guān)性，與前列腺癌分期相關(guān)。本研究通過隨訪2年，發(fā)現(xiàn)與死亡組比較前列腺癌患者生存患者尿液中的miR-128a表達(dá)水平出現(xiàn)明顯降低，說明尿液miR-128a表達(dá)水平是前列腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)?，F(xiàn)已知miR-128a在乳腺癌和神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤中出現(xiàn)明顯下降[10]，表現(xiàn)為抑癌基因，而在我們研究中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)出現(xiàn)明顯升高，說明在前列腺癌患者中miR-128a為促癌基因，對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用。與郭學(xué)軍等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-128a在肝癌組織中呈高表達(dá)，并且認(rèn)為miR-128a能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖類似。本研究開發(fā)現(xiàn)尿液miR-128a表達(dá)在診斷前列腺癌患者的靈敏度為61.5%，特異性93.3%，AUC為0.815，說明尿液外泌體中的miR-128a在診斷前列腺癌具有一定的臨床診斷價值。本研究還發(fā)現(xiàn)在預(yù)測2年內(nèi)死亡方面具有較高的診斷效能，故對預(yù)測2年內(nèi)死亡具有較高的診斷效能，說明尿液miR-128a表達(dá)為預(yù)測預(yù)后較好的指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者尿液中miR-28-3p表達(dá)水平明顯低于良性前列腺患者和健康體檢者，且手術(shù)后尿液中miR-28-3p表達(dá)出現(xiàn)明顯升高，說明miR-28-3p在前列腺癌中是重要的保護基因，作為抑癌基因的角色，對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。有研究表明miR-28-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌[12]出現(xiàn)明顯高表達(dá)，而在結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)明顯低表達(dá)[13]，說明miR-28-3p在不同腫瘤中有著不同的作用。與文獻(xiàn)表達(dá)血清miR-28-3p表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后相關(guān)[14]一致。本研究還發(fā)現(xiàn)尿液中miR-28-3p表達(dá)水平與診斷前列腺癌和判斷預(yù)后具有較高的效能，AUC為0.915明顯高于單獨miR-128a和miR-28-3p指標(biāo)的檢測，說明兩者指標(biāo)在檢測前列腺癌具有一定的互補作用。本研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測尿液中miR-128a和miR-28-3p水平在預(yù)后2年內(nèi)死亡的靈敏度和特異性均高達(dá)82.9%，曲線下面積為0.895，均高于單純指標(biāo)的檢測，說明兩指標(biāo)在預(yù)測預(yù)后方面具有某種聯(lián)系，類似癌基因和抑癌基因這兩種基因，內(nèi)在存在一定的聯(lián)系，故對于尿液miR-128a表達(dá)>3.753和miR-28-3p表達(dá)≤1.2患者是否需要采取進(jìn)一步的干預(yù)，這些干預(yù)是否能夠改變預(yù)后及其可能的機制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，MiR-128a和miR-28-3p參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，在診斷前列腺癌和判斷預(yù)后具有重要臨床價值。