徐玲玲，康麗峰，劉高飛，何冰芳，儲(chǔ)建林

(1.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211816; 2.常州市第一人民醫(yī)院，江蘇 常州 213003； 3.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816)

核苷類藥物是臨床上重要的抗病毒、抗腫瘤藥物[1-2]，主要有：齊多夫定、阿巴卡韋等可用于治療艾滋?。欢魈婵f、替比夫定等可用于治療乙肝病毒；克拉屈濱、氟達(dá)拉濱等可用于治療白血病、淋巴瘤等腫瘤疾病[3-5]。核苷類化合物以化學(xué)法合成報(bào)道居多，該方法是利用保護(hù)的堿基與多羥基選擇性保護(hù)的核糖進(jìn)行縮合反應(yīng)來制備核苷類產(chǎn)物，但得到的核苷產(chǎn)物往往是核糖(阿糖)α、β同分異構(gòu)體產(chǎn)物；化學(xué)法也可以利用天然核苷類化合物為原料，對(duì)其堿基或核糖基進(jìn)行修飾，得到其核苷類化合物的新型衍生物[6]?；瘜W(xué)法合成核苷類產(chǎn)物往往需要多步反應(yīng)，對(duì)活性基團(tuán)修飾保護(hù)與脫保護(hù)，使用重金屬等特點(diǎn)，不利于環(huán)保[7]；甚至還需要對(duì)其異構(gòu)體拆分，才能得到活性β型核苷類產(chǎn)物，糖異構(gòu)體的化合物一般難以分離獲得高純度的單一異構(gòu)體核苷產(chǎn)物，化學(xué)法合成核苷產(chǎn)物的最終產(chǎn)率往往不是很高[7-8]。

生物酶法合成核苷類藥物具有無需保護(hù)、步驟少、無糖異構(gòu)體產(chǎn)物生成等特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)[6-8]。目前，生物酶法催化合成核苷類藥物主要有核苷磷酸化酶和N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶兩大類酶[8]。依據(jù)核苷磷酸化酶對(duì)嘌呤與嘧啶類底物的選擇性，可細(xì)分為嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶[9-10]。核苷磷酸化酶對(duì)糖供體選擇范圍較為寬泛，能識(shí)別核糖、脫氧核糖等多種核苷類糖供體，被用于核苷類產(chǎn)物的合成制備方面較為引人注目[9-10]。核苷磷酸化酶能以廉價(jià)的天然核苷為原料，可逆催化其磷酸化反應(yīng)，生成1-磷酸核糖為真正的核糖基供體，以堿基為受體合成新的核苷類產(chǎn)物(即催化核苷與堿基之間的轉(zhuǎn)換反應(yīng))[8-10]。嘌呤核苷磷酸化酶往往只能催化嘌呤核苷供體的磷酸化反應(yīng)，并只能合成嘌呤核苷產(chǎn)物，對(duì)嘧啶類堿基供體不反應(yīng)，具有極為嚴(yán)格的堿基底物受體專一性(嘧啶核苷磷酸化酶類同)[11]。

生物酶法合成嘌呤核苷類產(chǎn)物，利用嘌呤核苷磷酸化酶與嘧啶核苷磷酸化酶構(gòu)建的雙酶催化體系來合成嘌呤核苷產(chǎn)物，能得到較高的產(chǎn)率[12-13]。該雙酶催化的具體反應(yīng)過程：第一步由嘧啶核苷磷酸化酶催化嘧啶核苷的磷酸化反應(yīng)水解生成1-磷酸核糖(作為第二個(gè)酶的糖供體)，第二步再由嘌呤核苷磷酸化酶催化嘌呤堿基與1-磷酸核糖的合成反應(yīng)從而得到嘌呤核苷類產(chǎn)物[14]。嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶在熱動(dòng)力學(xué)方面分別偏向于水解合成，雙酶催化有利于嘌呤核苷類產(chǎn)物的合成累積；并且第一步反應(yīng)所產(chǎn)生的嘧啶堿基副產(chǎn)物不會(huì)參與第二步反應(yīng)，不會(huì)因?yàn)楦碑a(chǎn)物的積累而抑制第二步反應(yīng)，最終提高了嘌呤核苷類產(chǎn)物的合成產(chǎn)率[12-15]。

然而，單獨(dú)添加的游離雙酶的生物催化是在液體反應(yīng)體系下進(jìn)行的，中間產(chǎn)物可能很容易擴(kuò)散，且局部濃度不高、傳質(zhì)效率較低，導(dǎo)致中間產(chǎn)物不易很快進(jìn)入第二個(gè)酶的活性中心參與反應(yīng)[14]。因此，考慮利用連接肽將第一個(gè)酶與第二酶相互連接在一起，形成新的融合蛋白[16-17]。連接肽特性如連接肽長度、剛?cè)嵝缘瓤赡苡绊懨傅谋磉_(dá)與酶的活性[18-21]，合適的連接肽可增強(qiáng)酶與酶分子之間的臨近效應(yīng)，可能會(huì)形成較強(qiáng)的底物通道效應(yīng)，顯著提高參與反應(yīng)物質(zhì)的傳質(zhì)效率，并減少中間物的擴(kuò)散，從而大幅度地提高反應(yīng)效率[22-23]。

本文利用自行篩選，并實(shí)現(xiàn)表達(dá)的尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP為研究對(duì)象，酶EcUP和酶AmPNP具有相對(duì)較小的分子量，具有相似的三維結(jié)構(gòu)；酶EcUP和酶AmPNP適合進(jìn)行雙酶融合的表達(dá)研究。對(duì)尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP進(jìn)行融合設(shè)計(jì)；考察不同特性的連接肽(Linker)對(duì)酶融合的可溶性表達(dá)影響，并研究了融合效果最好的融合蛋白催化合成克拉曲濱等嘌呤核苷類產(chǎn)物的影響，以期實(shí)現(xiàn)雙酶高效催化合成核苷產(chǎn)物，增強(qiáng)生物催化合成核苷的實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株E.coli和菌株AneurinibacillusmigulanusAM007，由南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院何冰芳教授的研究室篩選并保存，其中菌株AneurinibacillusmigulanusAM007在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的編號(hào)為CCTCC NO.M2016404[24]；E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，南京市諾唯贊公司；質(zhì)粒pET-28a(+)，北京市索萊寶公司。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase、Prime STAR HS DNA聚合酶、DNA Marker等，北京市TaKaRa公司；2×EVO Master Mix，南京市諾唯贊公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，美國AXYGEN公司。HPLC分析使用的溶劑甲醇為色譜級(jí)；尿苷，脫氧尿苷，核苷堿基等其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

工程菌株的液體培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)： NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，上述培養(yǎng)基于121 ℃滅菌 20 min，加入過濾除菌的硫酸卡那霉素(Kana)使其終質(zhì)量濃度為50 mg/L，制得液體培養(yǎng)基。工程菌株的平板固體培養(yǎng)基：在上述的液體培養(yǎng)基中額外添加瓊脂粉20 g/L，相同條件滅菌，加入過濾除菌的Kana使其終質(zhì)量濃度為50 mg/L，制得平板固體培養(yǎng)基。

所用的相關(guān)引物見表1。

表1 核苷磷酸化酶EcUP與AmPNP的基因克隆與酶融合設(shè)計(jì)的引物序列Table 1 Primer sequences of purine nucleoside phosphorylase EcUP,pyrimidine nucleoside phosphorylase AmPNP and fusion enzymes

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP基因的克隆

分別提取本研究室自行篩選獲得的菌株AneurinibacillusmigulanusAM007與大腸桿菌(E.coli)的總DNA基因組，以對(duì)應(yīng)菌株的總DNA為模板，分別進(jìn)行酶AmPNP與酶EcUP的基因擴(kuò)增。PCR基因擴(kuò)增的反應(yīng)體系為2×EVO Master Mix 25 μL，分別加入2 μL對(duì)應(yīng)的引物E1/E2與A1/A2，DNA模板2 μL和超純水19 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：1) 94 ℃，預(yù)變性3 min；2) 94 ℃，變性15 s；3) 55 ℃，退火30 s；4) 72 ℃，延伸1 min； 2)～4)步驟循環(huán)重復(fù)30次；5) 72 ℃徹底延伸10 min，冷卻至4 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的基因的DNA片段，獲得嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP與嘧啶核苷磷酸化酶EcUP的基因序列。

1.2.2 融合蛋白EcUP-Linker-AmPNP的重組菌構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

分別以酶AmPNP和酶EcUP基因序列為模板，進(jìn)行基因擴(kuò)增。以酶EcUP基因?yàn)槟０?，雙酶融合設(shè)計(jì)使用的引物分別為E-S-N/E-X-L1，E-S-N/E-X-L2，E-S-N/E-X-L3，E-S-N/E-X-L4；以酶AmPNP基因?yàn)槟０?，融合設(shè)計(jì)使用的引物分別為A-X-B/A-S-L1，A-X-B/A-S-L2，A-X-B/A-S-L3，A-X-B/A-S-L4，基因擴(kuò)增反應(yīng)體系與方法同上一步。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的基因片段。獲得目的基因片段ELn和ALn(n=1、2、3、4)。以基因片段ELn(n=1～4)和 ALn(n=1～4)為模板，以引物E-S-N和A-X-B進(jìn)行重疊PCR反應(yīng)，連接肽將酶EcUP的C端連接到酶AmPNP的N端，重疊PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件同上。純化后的基因片段與pET-28a(+)質(zhì)粒，加入NdeI和BamHI限制性內(nèi)切酶，于37 ℃反應(yīng)6 h，純化后得到酶融合蛋白的基因片段產(chǎn)物，再用T4 DNA連接酶16 ℃下連接12 h后轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆子，樣品送至南京思普金生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得對(duì)應(yīng)的重組雙酶融合蛋白的工程菌株。

采用優(yōu)化后的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行重組雙酶融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將獲得的重組菌接種至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的Kana液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)12 h作為種子液。種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接種到上述培養(yǎng)基中相同條件培養(yǎng)2 h左右(OD600約為0.6)，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為20 ℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h后于4 ℃，8 000 r/min離心20 min收集菌體，用等體積pH 8.0 Na2HPO4-KH2PO4(PBS)緩沖液50 mmol/L懸浮菌體，菌體細(xì)胞超聲破碎10 min后，于4 ℃，12 000 r/min離心20 min獲得酶上清液并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.2.3 核苷磷酸化酶及融合酶的酶活力與水解產(chǎn)率的測(cè)定

利用HPLC法測(cè)定核苷磷酸化酶的活力[15]。核苷磷酸化酶AmPNP的酶學(xué)性質(zhì)，如最適反應(yīng)溫度、pH等條件，參照參考文獻(xiàn)[24]。核苷磷酸化酶EcUP的序列與已有的文獻(xiàn)報(bào)道一致，該酶的酶學(xué)性質(zhì)參照參考文獻(xiàn)[25]。核苷磷酸化酶與酶融合蛋白的活力測(cè)定方法如下：用pH 8.0、50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，其中含1 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)分別配制含有40.0 mmol/L的肌苷、尿苷、鳥苷、腺苷和脫氧尿苷的底物溶液。酶活力測(cè)定時(shí)，反應(yīng)體系中分別加入250 μL上述底物溶液和700 μL上述PBS緩沖液，最后加入50 μL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液(在酶的C端加入了6×His，利用鎳柱親和層析的方法純化獲得的純酶)，于50 ℃條件下反應(yīng)10 min，取樣50 μL立即加入到950 μL甲醇中，終止反應(yīng)，檢測(cè)計(jì)算各樣品中生成產(chǎn)物的量。1個(gè)單位(U)核苷磷酸化酶或融合酶的酶活力定義為在上述最適的反應(yīng)條件下，每分鐘催化磷酸化反應(yīng)消耗1 μmol的核苷底物所需的酶量。

1.2.4 融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷的反應(yīng)條件

嘌呤核苷合成的反應(yīng)條件參照參考文獻(xiàn)[24]，以pH 8.0的PBS緩沖液(含1 mmol/L的EDTA)配制10 mmol/L的尿苷或脫氧尿苷(核苷糖供體)，5 mmol/L的各種嘌呤類堿基(堿基受體)；加入合適濃度的嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的融合酶(在酶的C端加入了6×His，鎳柱親和層析的方法純化獲得了其純酶)，在恒溫振蕩反應(yīng)器中50 ℃反應(yīng)，進(jìn)行嘌呤核苷產(chǎn)物的合成。反應(yīng)一定時(shí)間后，取50 μL樣品立即加入950 μL甲醇終止反應(yīng)。樣品預(yù)處理后，采用HPLC檢測(cè)相應(yīng)的產(chǎn)物[14-15]，檢測(cè)分析條件：Discovery C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相V(甲醇)∶V(純水)=1∶ 9，波長為254 nm，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP基因的獲取

以菌株AneurinibacillusmigulanusAM007總DNA基因組為模板，利用相應(yīng)的引物，PCR擴(kuò)增獲得了編碼嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP的基因，電泳條帶大小與預(yù)期的嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP基因長度相符(圖1)，并進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證了其大小為813 bp。以大腸桿菌(E.coli) 的總DNA基因組為模板，利用相應(yīng)的引物，PCR擴(kuò)增獲得嘧啶核苷磷酸化酶EcUP的基因，電泳分析表明：嘧啶核苷磷酸化酶EcUP基因長度與預(yù)期相符(圖1)并進(jìn)行測(cè)序,驗(yàn)證了其大小為762 bp。

M—Marker；PNP—嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP的基因產(chǎn)物；EcUP—嘧啶核苷磷酸化酶EcUP基因產(chǎn)物圖1 嘌呤核苷磷酸化酶基因與嘧啶核苷磷酸化酶基因PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification product of purine nucleosidephosphorylase and pyrimidine nucleoside phosphorylase gene

2.2 核苷磷酸化酶的融合表達(dá)菌株構(gòu)建與融合蛋白的表達(dá)量影響

嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP(編碼270個(gè)氨基酸)與嘧啶核苷磷酸化酶EcUP(編碼253個(gè)氨基酸)可分別在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP在GenBank中的登記號(hào)為MH992394，嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP的氨基酸列在本文研究申請(qǐng)的發(fā)明專利中也有詳細(xì)記載[24]，嘧啶核苷磷酸化酶EcUP在GenBank中的登記號(hào)為QBF93483。

選用不同特性的典型剛性/柔性連接肽，分別構(gòu)建了EcUP與AmPNP的4種融合蛋白的重組菌，考察了連接短肽對(duì)雙酶融合表達(dá)的影響，雙酶融合蛋白的表達(dá)情況見圖2。如圖2所示：SDS-PAGE分析表明，嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP融合表達(dá)后，在分子量6.3×104處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期融合蛋白的理論分子量大小相符。4種融合蛋白EcUP-L1-AmPNP，EcUP-L2-AmPNP，EcUP-L3-AmPNP，EcUP-L4-AmPNP均可以實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)；但不同連接肽獲得的融合蛋白的可溶性表達(dá)水平差異較大。以柔性連接肽L1、L2、L3構(gòu)建獲得的融合蛋白表達(dá)以包涵體為主，僅有少部分的可溶性蛋白。使用剛性連接短肽L4 (EEEEEEKKK)構(gòu)建獲得的融合蛋白EcUP-L4-AmPNP的可溶性部分比較多，包涵體部分的量極少?？梢娒窤mPNP與酶EcUP融合時(shí)，剛性連接肽對(duì)其融合蛋白的可溶性表達(dá)有利，可實(shí)現(xiàn)融合蛋白的正確折疊，能形成具有較高酶活性的雙酶融合體。

M—蛋白Marker；1—EcUP-L1-AmPNP的破碎上清；2—EcUP-L1-AmPNP的破碎沉淀(包涵體)；3—EcUP-L2-AmPNP的破碎上清；4—EcUP-L2-AmPNP的破碎沉淀(包涵體)；5—EcUP-L3-AmPNP的破碎沉淀(包涵體)；6—EcUP-L3-AmPNP的破碎上清；7—EcUP-L4-AmPNP的破碎上清；8—EcUP-L4-AmPNP的破碎沉淀(包涵體)圖2 不同連接肽對(duì)核苷磷酸化酶融合蛋白表達(dá)影響的SDS-PAGE分析圖Fig.2 Effect of different linker on the recombinant fusion protein of purine nucleoside phosphorylase and pyrimidine nucleoside phosphorylase by SDS-PAGE analysis

2.3 融合酶EcUP-Linker-AmPNP的活性及其對(duì)核苷底物的水解產(chǎn)率影響

筆者克隆表達(dá)獲得的尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP只能水解嘧啶核苷類底物，不能水解嘌呤核苷類底物；嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP只能水解嘌呤核苷類底物，但不能水解嘧啶核苷類底物。這兩個(gè)酶對(duì)核苷類底物的反應(yīng)性能情況與一些現(xiàn)有的報(bào)道相似[9]。通過雙酶的融合表達(dá)可能實(shí)現(xiàn)融合酶對(duì)多種類核苷底物的反應(yīng)活性。筆者分別測(cè)試分析了4種雙酶融合體EcUP-L1-AmPNP，EcUP-L2-AmPNP，EcUP- L3-AmPNP，EcUP-L4-AmPNP對(duì)幾種核苷類底物的反應(yīng)情況。結(jié)果表明：以包涵體較多的融合酶EcUP-L1-AmPNP，EcUP-L2-AmPNP，EcUP-L3-AmPNP可溶性蛋白與包涵體部分均沒有反應(yīng)活性或極低的反應(yīng)活性。在大腸桿菌中能大部分可溶性表達(dá)的融合酶EcUP-L4-AmPNP具有較高的活性。核苷磷酸化酶的融合體EcPNP-L4-AmUP對(duì)尿苷、肌苷等核苷類底物的酶活力情況(表2)。由表2可知：融合酶EcUP-L4-AmPNP對(duì)嘌呤和嘧啶核苷類底物的水解比活力大小順序?yàn)槟蜍铡⒓≤?、脫氧尿苷、鳥苷、腺苷；融合酶EcUP-L4-AmPNP對(duì)嘌呤和嘧啶核苷類底物的水解產(chǎn)率的大小依次為脫氧尿苷、尿苷、肌苷、腺苷、鳥苷。從反應(yīng)熱力學(xué)方面來看：酶融合蛋白EcUP-L4-AmPNP對(duì)嘧啶核苷的水解產(chǎn)率都大于嘌呤核苷，這可能是融合酶EcUP-L4-AmPNP中的嘧啶核苷磷酸化酶EcUP催化嘧啶類核苷的水解反應(yīng)活性相對(duì)比較高，而嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP催化磷酸化反應(yīng)合成嘌呤核苷活性相對(duì)比較高導(dǎo)致的。利用連接肽將嘧啶核苷磷酸化酶EcUP和嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP相互融合，并成功地實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)；獲得了對(duì)嘌呤和嘧啶類底物均有活性的融合蛋白EcUP-L4-AmPNP，拓展了其可催化反應(yīng)的核苷類底物類型，該融合蛋白可能適用于生物催化合成嘌呤核苷類產(chǎn)物。

表2 雙酶融合蛋白EcPNP-L4-AmUP的水解嘌呤核苷類與嘧啶核苷類底物的活力情況與水解產(chǎn)率Table 2 The phosphorolysis reaction activity and hydrolyzing yield of fusion enzyme EcPNP-L4-AmUP towards purine nucleosides and pyrimidine nucleosides

2.4 融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷的反應(yīng)進(jìn)程曲線

游離雙酶催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產(chǎn)物的反應(yīng)優(yōu)化后，其反應(yīng)條件為50 mmol/L、pH 8.0磷酸緩沖(含1 mmol/L EDTA)，反應(yīng)溫度為50 ℃，核苷糖供體為嘧啶類尿苷(10 mmol/L)，嘌呤堿基受體為2,6-二氨基嘌呤(5 mmol/L)。反應(yīng)體系中分別加入游離的尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP(摩爾比為1∶ 1混合)，該條件下游離雙酶催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產(chǎn)物的最高產(chǎn)率約63.0%(圖3)。利用雙酶融合體EcUP-L4-AmPNP為生物催化劑，研究其催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產(chǎn)物的反應(yīng)進(jìn)程曲線，雙酶融合體EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產(chǎn)物的情況(HPLC分析圖譜見圖4)，產(chǎn)物經(jīng)與2,6-二氨基嘌呤核苷標(biāo)準(zhǔn)品比較，并進(jìn)行質(zhì)譜分析確證。測(cè)定了融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產(chǎn)物的反應(yīng)進(jìn)程曲線(圖3)。由圖3可知：當(dāng)反應(yīng)達(dá)到60 h時(shí)，融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產(chǎn)物的反應(yīng)趨于平緩，產(chǎn)率最高可以達(dá)到98.4%。已有報(bào)道利用來源于AeropyrumpernixK1的嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶合成2,6-二氨基嘌呤核苷的產(chǎn)率大約為60.0%[14]。Zhou等[15]使用來源于Thermusthermophilus的核苷磷酸化酶(PNP)和來源于Geobacillusthermoglucosidasius的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)“一鍋法”合成2,6-二氨基嘌呤核苷的產(chǎn)率可以達(dá)到95.3%(底物濃度及比例為尿苷∶ 2,6-二氨基嘌呤為2∶ 1)。本研究獲得的融合酶EcUP-L4-AmPNP合成2,6-二氨基嘌呤核苷產(chǎn)物的產(chǎn)率高于現(xiàn)有的一些文獻(xiàn)報(bào)道，并且合成嘌呤核苷的反應(yīng)底物濃度水平顯著高于目前已有的報(bào)道。推測(cè)可能是融合蛋白中AmPNP與EcUP微觀空間上的距離更加接近，形成了一定的底物通道效應(yīng)，可能有利于增加在溶液中的中間體產(chǎn)物的局部濃度，提高中間體物質(zhì)的傳質(zhì)效率，從而提高了其催化合成嘌呤核苷類產(chǎn)物的產(chǎn)率。

圖3 融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷的反應(yīng)進(jìn)程曲線Fig.3 Time course of purine nucleoside synthesized reaction catalyzed by fusion enzyme EcUP-L4-AmPNP

圖4 融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產(chǎn)物的HPLC分析圖Fig.4 HPLC analysis of purine nucleoside product catalyzed by fusion enzyme EcUP-L4-AmPNP

2.5 融合酶EcUP-L4-AmPNP高效生物催化合成的嘌呤核苷類產(chǎn)物

融合酶EcUP-L4-AmPNP對(duì)尿苷、脫氧尿苷(嘧啶類核苷)具有較高的水解活性，結(jié)果見表2。由表2可知：融合酶EcUP-L4-AmPNP也可以利用較為廉價(jià)的尿苷、脫氧尿苷(嘧啶類核苷)為糖供體，以嘌呤堿基為受體合成嘌呤核苷類產(chǎn)物。游離雙酶(將酶AmPNP與酶EcUP按1∶ 1的比例添加到反應(yīng)體系中)與融合酶EcUP-L4-AmPNP均能催化合成幾種嘌呤核苷類產(chǎn)物(嘌呤核苷產(chǎn)物的編號(hào)分別為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4，具體見圖5)。研究比較了游離雙酶與融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成多種嘌呤核苷類產(chǎn)物的產(chǎn)率情況(圖6)。

圖5 尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP雙酶法催化合成嘌呤核苷類產(chǎn)物(A1～B4)的反應(yīng)示意圖Fig.5 Dual enzyme catalyzed the reaction of purine nucleosides biosynthesis by purine nucleoside phosphorylase EcUP and pyrimidine nucleoside phosphorylase AmPNP,products (A1-B4)

以尿苷為核苷糖供體，反應(yīng)體系中分別加入游離雙酶(尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP，比例為1∶ 1)催化合成幾種嘌呤核苷類產(chǎn)物的產(chǎn)率在47%～63%；而使用融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成嘌呤核苷類產(chǎn)物的產(chǎn)率在85.6%～98.3%(圖6)。在嘌呤核苷產(chǎn)物的合成產(chǎn)率方面，融合酶EcUP-L4-AmPNP比游離雙酶提高了約1.5～1.8倍。以2′脫氧尿苷為核苷糖供體，反應(yīng)體系中分別加入游離雙酶(尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP，比例1∶ 1)催化合成幾種2′脫氧嘌呤核苷類產(chǎn)物的產(chǎn)率在33.7%～60.5%(圖6)；而使用融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2′脫氧嘌呤核苷類產(chǎn)物的產(chǎn)率為70.4%～96.5%。在2′脫氧嘌呤核苷產(chǎn)物的合成產(chǎn)率方面，融合酶EcUP-L4-AmPNP比游離雙酶提高了約1.6～2.0倍。游離雙酶與融合酶EcUP-L4-AmPNP均能合成抗白血病作用的克拉屈濱核苷類產(chǎn)物，融合酶EcUP-L4-AmPNP合成克拉屈濱的產(chǎn)率較高，可達(dá)70.4%(圖6)。可能是由于雙酶融合表達(dá)，酶與酶分子之間產(chǎn)生了一定臨近效應(yīng)，形成了底物通道效應(yīng)，從而提高了其催化合成嘌呤核苷產(chǎn)物的產(chǎn)率[16]。

圖6 雙酶游離酶與融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成幾種嘌呤核苷類產(chǎn)物的比較Fig.6 Biosynthesizing yield of several purine nucleoside products by free dual enzyme and fusion enzyme EcUP-L4-AmPNP

3 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了不同的連接肽(Linker)將E.coli來源的嘧啶核苷磷酸化酶EcUP和AneurinibacillusmigulanusAM007來源的嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP進(jìn)行融合表達(dá)。不同特性(剛性、柔性)的連接肽對(duì)這兩個(gè)酶融合時(shí)的可溶性表達(dá)有著較大影響，使用剛性短肽連接起來的融合酶EcUP-L4-AmPNP可溶性表達(dá)水平較高，并實(shí)現(xiàn)了其對(duì)嘧啶類和嘌呤類核苷底物均具有的水解活性，且嘌呤核苷的水解率遠(yuǎn)小于嘧啶核苷，有利于融合酶高效催化合成嘌呤核苷產(chǎn)物。相較于分別添加酶EcUP和酶AmPNP的游離雙酶反應(yīng)體系，利用融合酶EcUP-L4-AmPNP作為生物催化劑合成2,6-二氨基嘌呤核苷、克拉屈濱等嘌呤核苷類產(chǎn)物的產(chǎn)率顯著提高，融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產(chǎn)物的產(chǎn)率最高可以達(dá)到98.4%，融合酶EcUP-L4-AmPNP合成克拉屈濱的產(chǎn)率可達(dá)70.4%。融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成嘌呤核苷類產(chǎn)物的產(chǎn)率可達(dá)85.6%～98.3%，比分別加入酶EcUP和AmPNP的游離雙酶體系提高了約1.5～1.8倍。融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2′脫氧嘌呤核苷類產(chǎn)物的產(chǎn)率為70.4%～96.5%，比分別加入酶EcUP和AmPNP的雙酶游離酶體系提高了約1.6～2.0倍，可能是酶EcUP與酶AmPNP融合后在微觀空間上更加接近，酶分子之間可能形成了底物通道效應(yīng)，從而使得嘌呤核苷產(chǎn)物的合成產(chǎn)率提高。雙酶的融合表達(dá)設(shè)計(jì)有助于實(shí)現(xiàn)雙酶的高效協(xié)同催化，對(duì)于雙酶催化反應(yīng)的優(yōu)化設(shè)計(jì)具有重要的意義。