倪 婕,許國超,倪 曄

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

生物胺是生物體所必需的一類重要含氮化合物，其作為神經(jīng)遞質(zhì)，在細胞間信息傳輸中發(fā)揮重要作用[1]。生物胺包括多巴胺、5-羥色胺、組胺和酪胺，廣泛存在于微生物、植物和動物細胞中[2-3]。酪胺是一種天然存在的痕量單胺，具有多種用途：酪胺可作為多巴胺和章魚胺的生化前體，這些物質(zhì)是無脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑[4-6]；酪胺還可以用于制備降血脂藥物苯扎貝特，通過降低膽固醇和甘油三酯水平來降低血脂[7]；此外，Olarte等[8]發(fā)現(xiàn)，酪胺可以作為胰島素類似物刺激葡萄糖的轉(zhuǎn)運，從而有效治療Ⅱ型糖尿病。目前化學(xué)法生產(chǎn)酪胺工藝復(fù)雜，具有一定的局限性[9-10]。而生物催化法以L-酪氨酸為底物，通過酪氨酸脫羧酶直接生成產(chǎn)物酪胺，具有綠色和高效率的優(yōu)點，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。

酪氨酸脫羧酶(TDC，EC 4.1.1.25)是一種磷酸吡哆醛(PLP)依賴型氨基酸脫羧酶，負責(zé)合成生物胺和多胺化合物。Sandmeier等[11]通過序列同源性和保守結(jié)構(gòu)域的進化分析，將氨基酸脫羧酶分為4個亞組，其中酪氨酸脫羧酶與3,4-二羥基-L-苯丙氨酸(多巴)脫羧酶、谷氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶和半胱磺酸脫羧酶屬于Group Ⅱ脫羧酶。TDC可以催化L-酪氨酸和L-多巴脫羧生成酪胺和多巴胺，并釋放CO2。目前已經(jīng)從植物、昆蟲和不同的微生物中鑒定出多種TDC，包括果蠅[12]，罌粟[13]、紅景天[14]，短乳桿菌[15-16]、糞腸球菌[17]、甲烷球菌[18]、芽孢桿菌[19]等。TDC催化的反應(yīng)是多種途徑中的關(guān)鍵反應(yīng)，影響動物、昆蟲中神經(jīng)遞質(zhì)的合成以及植物中生物堿、芳香族揮發(fā)物和抗氧化劑的合成。此外，TDC還參與昆蟲卵的成熟、免疫反應(yīng)和肌肉發(fā)育。不同來源的TDC在序列上具有較大差異，而短乳桿菌來源的酪氨酸脫羧酶具有最高的比酶活。Pereira等[20]研究發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌中的TDC可以在酸性條件下合成酪胺，通過脫羧反應(yīng)中的質(zhì)子消耗產(chǎn)生質(zhì)子動力，幫助菌體對抗外界的酸性環(huán)境。目前關(guān)于TDC底物結(jié)合和影響催化活性關(guān)鍵氨基酸的報道較少。2014年，筆者所在課題組的Zhang等[15]實現(xiàn)了短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)來源TDC(LbTDC)的異源可溶性表達，該重組TDC催化L-酪氨酸及L-多巴脫羧反應(yīng)的比酶活分別為134和58.6 U/mg。2016年，Zhu等[21]通過蛋白結(jié)晶解析了LbTDC晶體結(jié)構(gòu)(PDB登錄號：5HSJ，LbTDC)。

本研究中，筆者在晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過分子對接分析底物與活性口袋氨基酸的相互作用，選取活性口袋內(nèi)重要位點進行定點突變；對突變體進行蛋白純化，分別測定突變體對L-酪氨酸和L-多巴的比活力；并結(jié)合晶體結(jié)構(gòu)和分子動力學(xué)模擬，對影響催化活性的關(guān)鍵位點進行結(jié)構(gòu)分析，以期對其他酪氨酸脫羧酶的分子改造及酶法生產(chǎn)酪胺提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

pET24a-tdc為筆者所在實驗室前期構(gòu)建，用于表達LbTDC；表達菌株EscherichiacoliBL21(DE3)，Novagen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L；pH 7.0。121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基再加入20 g/L瓊脂。

LBG培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、葡萄糖5 g/L；pH 7.0。115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

KOD-Plus-Neo高保真酶，Toyobo公司；限制性內(nèi)切酶DpnI，TaKaRa公司；DNA Marker、蛋白Marker、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，Oxoid公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素(Kan)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.4 引物

本研究用到的引物詳見表1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 突變體的構(gòu)建

以LbTDC表達質(zhì)粒pET24a-tdc為模板，使用KOD-Plus-Neo高保真酶進行全質(zhì)粒PCR。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳驗證成功后，使用限制性內(nèi)切酶DpnI消化產(chǎn)物中的模板質(zhì)粒，加10 μL已消化的樣品到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，冰浴30 min后，42 ℃水浴熱激90 s，再在冰上放置2 min后，加入800 μL的LB培養(yǎng)基，放入搖床37 ℃培養(yǎng)1 h后，將培養(yǎng)液均勻涂布于含Kan抗性的固體LB平板，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)。對長出的單菌落進行菌落PCR驗證，取驗證成功的單菌落接種至LB培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min過夜培養(yǎng)。將活化好的單菌落進行質(zhì)粒抽提并測序，測序成功的單菌落加入30%(體積分數(shù))甘油保藏。

1.2.2 培養(yǎng)方法

種子液培養(yǎng)：將測序正確的突變體接種至LB/Kan培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)10 h。

搖瓶發(fā)酵條件：將種子液以1%(體積分數(shù))接種量轉(zhuǎn)接至LBG/Kan培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)。當(dāng)OD600達到0.6～0.8時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，25 ℃培養(yǎng)8 h。

1.2.3 TDC的蛋白純化

將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液。加入適量A液，將收集菌體懸浮，超聲破碎15 min。將破碎液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心30 min得到的上清液用微孔濾膜(0.25 μm)過濾去除雜質(zhì)后，使用AKATA蛋白純化儀(His-Trap 5 mL鎳柱)進行蛋白純化。

上樣緩沖液A液。25 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑、5 mmol/Lβ-巰基乙醇、10%(體積分數(shù))甘油。

洗脫緩沖液B液。25 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、300 mmol/L NaCl、300 mmol/L 咪唑、5 mmol/Lβ-巰基乙醇、10%甘油。流速為5 mL/min，采用梯度洗脫方法進行分步洗脫。

收集洗脫液進行SDS-PAGE分析，選取純度較高的洗脫液，使用截留分子量為3.0×104的超濾管濃縮置換，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度大于10 mg/L后，將蛋白分裝并使用液氮速凍，-80 ℃冰箱保存[22]。

1.2.4 TDC酶活力的測定

酶活測定體系(1 mL)：10 μL合適濃度的酶液、40 μL PLP(2 mmol/L)、40 ℃預(yù)熱的950 μL底物(2 mmol/L，溶于0.2 mol/L pH 5.0的醋酸鈉緩沖液),40 ℃反應(yīng)10 min后100 ℃滅活10 min以終止反應(yīng)。將冷卻的反應(yīng)液在12 000 r/min條件下離心10 min，并采用微孔濾膜(0.22 μm)過濾后進行HPLC分析。

使用反相HPLC，Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm)測定酪氨酸脫羧酶的比酶活。測定TDC對L-酪氨酸和L-多巴2種底物的活力，采用Bradford方法測定蛋白質(zhì)含量。

液相檢測條件：進樣體積為10 μL，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，檢測波長220 nm。流動相為甲醇-水-冰醋酸，三者體積比為10∶ 90∶ 0.1。

TDC酶活力定義：在上述活力測定條件下，1 min生成1 μmol酪胺所需的酶量。

1.2.5 TDC與底物的分子對接

使用Discovery Studio 4.0將LbTDC(PDB登錄號：5HSJ)與底物L(fēng)-酪氨酸的分子對接。首先，刪除晶體結(jié)構(gòu)中的PLP分子作為蛋白受體，繪制外部醛亞胺(L-酪氨酸與PLP復(fù)合物)分子結(jié)構(gòu)并使用Prepare Ligand工具處理、利用Prepare、Protein功能對受體LbTDC模型結(jié)構(gòu)進行預(yù)處理；然后，用Receptor-Ligand Interaction模塊下Define and Edit Binding Site工具，通過空腔定義受體中可能的結(jié)合部位，選擇重要催化殘基His241、Asp328、Lys392所在空腔為對接部位，并將自動生成的活性部位球體半徑修改為1.0 nm；最后，使用CDOCKER工具進行分子對接操作。根據(jù)酪氨酸脫羧酶的催化反應(yīng)機制及CDOCKER_ENERGY得分對所獲得的構(gòu)象進行篩選評價，選擇符合催化機制且得分最高的構(gòu)象為最佳對接構(gòu)象。

1.2.6 TDC與底物的分子動力學(xué)模擬

以分子對接獲得的結(jié)果為輸入構(gòu)象進行分子動力學(xué)模擬：使用Antechamber添加小分子GAFF力場；通過PBD2PQR在線工具使蛋白所有氨基酸側(cè)鏈處于pH 5.0下質(zhì)子化狀態(tài)，并對蛋白質(zhì)施加AMBER99SB力場；使用GROMACS 5.1.4軟件對蛋白和小分子復(fù)合物進行分子動力學(xué)模擬，獲得蛋白質(zhì)運動軌跡。

在分子動力學(xué)(MD)模擬中，采取周期性邊界，粒子網(wǎng)格Ewald(PME)方法用于評估長程靜電相互作用。模擬步長2.0 fs，靜電與范德華力截斷值取1.2 nm。將小分子與蛋白的復(fù)合物置于八面體盒子中，加入TIP3P水分子模型，使水溶液密度為1.0 g/L。蛋白質(zhì)與盒子邊界最小距離設(shè)定為1.0 nm，加入Na+中和系統(tǒng)電荷。通過1 000步最陡下降法與9 000步的共軛梯度最小化，實現(xiàn)系統(tǒng)能量最小化，得到正確的起始模擬結(jié)構(gòu)。保持系統(tǒng)粒子數(shù)目，體系溫度與體積恒定，在313.15 K下平衡100 ps，再保持系統(tǒng)粒子數(shù)目，體系溫度與壓力恒定，在0.1 MPa氣壓下平衡100 ps。體系處于需要的溫度和壓力后，放開位置限制運行成品模擬并收集數(shù)據(jù)，收集3組10 ns的軌跡用于進一步的分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變位點的選擇

為了進一步闡明底物與TDC活性位點的相互作用，筆者選擇已經(jīng)得到的LbTDC/PLP復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，刪除結(jié)構(gòu)中的PLP分子作為蛋白受體，對L-酪氨酸進行分子對接，得到酶與底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)。獲得的活性位點由H98、M99、N100、N120、K240、H241、V294、G296、S297、T298、A330、Y331、K392、D398、H391、V396、P397和Y398等氨基酸組成。通過Discovery Studio軟件分析底物與活性中心氨基酸的相互作用，結(jié)果見圖1。由圖1可知：與其他來源的TDC相似，保守的H241的咪唑環(huán)與PLP的吡啶環(huán)形成π-π堆積作用；D328中帶負電荷的氧原子(O3)與PLP帶正電荷的吡啶氮(N1)形成鹽橋[23]；M99與L-酪氨酸的苯環(huán)形成π-sulfur相互作用；H98、Y331和Y398與底物復(fù)合物形成碳氫鍵作用。LbTDC的最適pH為5.0，與Huang等[24]的研究結(jié)果類似，在pH 5.0條件下，底物口袋表面所帶的正電荷有助于L-酪氨酸的正確結(jié)合。

圖1 底物與活性位點氨基酸之間作用力Fig.1 Interactions between L-tyrosine and LbTDC

由于LbTDC的高度靈活性，活性中心的loop區(qū)域在催化中發(fā)揮重要作用，選取LbTDC活性口袋中底物側(cè)H98～E102的loop區(qū)域(圖2)，對這5個位點進行定點突變，將這些氨基酸突變?yōu)槠渌煌愋偷拇戆被?，包括?cè)鏈較小的非極性氨基酸Ala、極性不帶電氨基酸Asn、帶負電荷氨基酸Asp、非極性氨基酸Leu、芳香族氨基酸Phe、帶正電荷氨基酸Lys和側(cè)鏈較小的極性不帶電荷氨基酸Ser，以探究其在催化中的具體作用。酪氨酸作為重要的催化氨基酸，其獨特的苯環(huán)與酚羥基可能在催化中發(fā)揮重要作用。因此選取Y331和Y398這2個位點，將酪氨酸突變?yōu)闃O性氨基酸，以探究這些位點在脫羧反應(yīng)中的具體作用。

圖2 關(guān)鍵活性位點在LbTDC中的位置Fig.2 Structure of key residues in thecatalytic center of LbTDC

2.2 loop區(qū)域突變體的構(gòu)建及比酶活分析

按照1.2.1節(jié)的方法成功擴增所有突變體，并將重組質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，選取測序正確的突變體進行搖瓶培養(yǎng)。前期研究發(fā)現(xiàn)，在LB培養(yǎng)基中加入5 g/L葡萄糖可以改善LbTDC包涵體現(xiàn)象，實現(xiàn)可溶性表達[15]。本研究在此基礎(chǔ)上，將表達的突變體進行蛋白純化。以H98位點為例，突變體的SDS-PAGE分析結(jié)果見圖3。根據(jù)圖3結(jié)果，選取純度大于90%的純酶進行比酶活測定。

M—標準蛋白質(zhì)；1—H98A；2—H98N；3—H98D；4—H98L；5—H98F；6—H98K；7—H98S圖3 H98位點突變體SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE analysis of variants of H98

野生型LbTDC對L-酪氨酸和L-多巴的比酶活設(shè)定為100%;L—酪氨酸,L—多巴圖4 H98-E102位點突變體對L-酪氨酸和L-多巴的相對比酶活Fig.4 Relative activities of site-directed mutagenesis mutants on H98,M99,N100,S101 and E102

H98～E102位點突變體相對活力測定結(jié)果見圖4。由圖4可知：H98位點突變體H98A和H98N對L-酪氨酸殘留酶活力均小于5%，天冬酰胺是極性氨基酸，其側(cè)鏈酰胺基團在pH 5.0下帶電荷，因此H98N殘存少量脫羧活力；H98D、H98L、H98F、H98S和H98K則完全喪失對L-酪氨酸和L-多巴的脫羧活力；與H98相似，當(dāng)M99與N100突變?yōu)槠渌愋桶被岷?，僅M99A、N100D、N100S保留小于10%的比酶活；S101與E102突變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)相似的氨基酸時保留較高的酶活力，S101A對L-酪氨酸和L-多巴的比酶活分別為29.1和19.7 U/mg，分別保留66.9%和74.2%的酶活力。Ser和Ala具有相似的較小側(cè)鏈基團，因此突變?yōu)锳la后僅喪失少量比酶活，S101位點其他突變體除S101N外幾乎全部失活；E102D對L-酪氨酸和L-多巴的比酶活分別為30.1和16.2 U/mg，分別保留69.1%和61.3%的酶活力，Asp和Glu均為帶負電的酸性氨基酸，相似的側(cè)鏈性質(zhì)使E102D保留較高活力，E102位點其他突變體殘余比酶活均小于野生菌株(WT)的10%。

2.3 Y331及Y398位點比酶活分析

Y331和Y398位點突變體比酶活測定見圖5。由圖5可知，Y398位點突變?yōu)闃O性氨基酸后，Y398N對L-酪氨酸和L-多巴的比酶活分別為5.44和1.08 U/mg，分別保留12.5%和4.6%的酶活力；Y398S和Y398T保留低于5%的酶活力；而當(dāng)398位點的Tyr突變?yōu)闃O性氨基酸His、Lys、Arg、Glu和Asp后，所有突變體完全失活。331位點的Tyr在催化過程中發(fā)揮無可替代的作用，Y331位點突變?yōu)锳sn、Ser和His后，突變體僅保留2%～10%的酶活力。

圖5 Y398和Y331位點突變體對L-酪氨酸和L-多巴的相對活力Fig.5 Relative activities of site-directed mutagenesis mutants on Y398 and Y331

2.4 突變位點的作用分析

通過對MD模擬軌跡進行聚類分析，得到模擬過程中底物與蛋白復(fù)合物的代表性構(gòu)象，并對該構(gòu)象進行結(jié)構(gòu)分析。M99與E102形成的loop區(qū)域與底物作用力分析，結(jié)果見圖6。由圖6可知，H98側(cè)鏈吡啶環(huán)氮原子與酪氨酸的羧基形成重要氫鍵(N—O，0.27 nm)，M99側(cè)鏈的硫原子與L-酪氨酸的酚環(huán)形成π-sulfur相互作用，N100的側(cè)鏈氨基與L-酪氨酸的酚氧形成氫鍵(N—O，0.31 nm)。組氨酸是蛋白活性位點和結(jié)合位點中最常見的極性氨基酸，其側(cè)鏈pKa約為6.5，最接近生理pH，這意味著組氨酸側(cè)鏈容易得到或失去質(zhì)子[25]。而LbTDC中H98通過氫鍵作用固定底物羧基位置，使L-酪氨酸的羧基垂直于PLP的共軛π平面，這種構(gòu)象有利于高效脫羧反應(yīng)的進行。

圖6 LbTDC中底物與周圍活性位點的相互作用Fig.6 Interactions between L-tyrosine andactive site in LbTDC

甲硫氨酸作為一種非極性氨基酸，在疏水底物(如L-酪氨酸)的結(jié)合與識別中發(fā)揮重要作用。而天冬酰胺的極性側(cè)鏈有助于與其他極性或帶電原子的相互作用[26]。因此當(dāng)L-酪氨酸進入活性口袋后，M99與N100位點通過一系列相互作用進一步穩(wěn)定底物空間構(gòu)象，在底物識別與結(jié)合中發(fā)揮關(guān)鍵作用。101位點絲氨酸較小的側(cè)鏈可以減小底物與周圍氨基酸的空間位阻效應(yīng)，因此當(dāng)S101突變?yōu)檩^小的丙氨酸后，仍然保留60%以上的活力，這些具有較小位阻的氨基酸側(cè)鏈為底物酚環(huán)提供空間。

H98與E102形成的loop區(qū)域在底物的識別與結(jié)合中起著至關(guān)重要的作用，通過氫鍵及范德華力等相互作用，使底物羧基處于有利脫羧的構(gòu)象，L-酪氨酸的羧基垂直于PLP的吡啶環(huán)共軛平面。根據(jù)Dunathan假說，這種構(gòu)象是脫羧反應(yīng)發(fā)生的先決條件[27]。

將豬腎來源DDC結(jié)構(gòu)與LbTDC結(jié)構(gòu)的疊加表明，LbTDC中的Y398位點在DDC中為苯丙氨酸[17]。但Y398F突變體對L-多巴和L-酪氨酸分別殘留9.8%和12%的比活力，這說明Y398位點的酚羥基在底物識別上發(fā)揮重要作用。當(dāng)Y398突變?yōu)楸奖彼崾?cè)鏈酚羥基后，蛋白將無法快速識別底物，導(dǎo)致酶活力急劇下降。酪氨酸的苯環(huán)易與其他芳香族側(cè)鏈形成π-π堆積作用，從結(jié)構(gòu)可以看出，Y331的側(cè)鏈與底物L(fēng)-酪氨酸的苯環(huán)形成T-型π-π堆積作用，與H98和E102形成的loop區(qū)域一起穩(wěn)定底物構(gòu)象。

2.5 TDC底物結(jié)合位點的進化分析

盡管PLP依賴型氨基酸脫羧酶具有極為相似的三級折疊構(gòu)象，但在進化過程中，每個脫羧酶通過進化獲得與其底物特異性相關(guān)的獨特結(jié)構(gòu)元件[28]，LbTDC也已進化出獨特的底物識別區(qū)域。在LbTDC中，底物結(jié)合位點被深埋在活性位點空腔中，并延伸至PLP吡啶環(huán)的Si-面下。從PDB數(shù)據(jù)庫中選取不同來源的Group Ⅱ脫羧酶晶體結(jié)構(gòu)進行三級結(jié)構(gòu)比對，包括人類來源組氨酸脫羧酶(PDB登錄號：4E1O)、人類來源多巴脫羧酶(PDB登錄號：1JS3)、果蠅來源多巴脫羧酶(PDB登錄號：3K40)、短乳桿菌來源酪氨酸脫羧酶(PDB登錄號：5HSJ)、人類來源谷氨酸脫羧酶(PDB登錄號：2OKJ)和人類來源半胱亞磺酸脫羧酶(PDB登錄號：2JIS)。比對結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，Group Ⅱ脫羧酶三級序列較為保守，且都存在H98～E102的loop區(qū)域。這段loop區(qū)域延伸至活性位點空腔中，并位于底物一側(cè)，不同類型脫羧酶的loop區(qū)域存在較大差異。這種差異使酶可以結(jié)合不同結(jié)構(gòu)的底物，當(dāng)?shù)孜镞M入活性口袋后，loop區(qū)域的氨基酸與底物發(fā)生相互作用，使底物脫去羧基轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的胺產(chǎn)物。

圖7 Group Ⅱ脫羧酶loop區(qū)域比較Fig.7 Comparison of the loop region between group Ⅱ decarboxylases

此外，在NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中選取與LbTDC同源性大于40%的酪氨酸脫羧酶序列，將這500個蛋白序列使用Bioedit軟件進行多序列比對，并對結(jié)果進行保守性分析，結(jié)果見圖8。由圖8可知，H98與E102形成的loop區(qū)域氨基酸在酪氨酸脫羧酶中高度保守，H98與S101位點在部分酪氨酸脫羧酶中分別為結(jié)構(gòu)相似的Gln或Ala。為了驗證保守性分析結(jié)果，構(gòu)建H98Q突變體并測定其酶活力。H98Q對L-酪氨酸和L-多巴的比酶活分別為23.6和11.3 U/mg，分別保留53.8%和50.1%的酶活力。H98Q與S101A突變體保留較高比酶活與保守性分析結(jié)果相一致，這也證明了TDC關(guān)鍵活性位點在進化過程中的高度保守性。

字母大小表示在保守性分析中，該氨基酸在此位點所占比例對應(yīng)縱坐標的概率圖8 H98～E102間形成的loop區(qū)域保守性分析Fig.8 Conservative analysis of H98-E102 loop

3 結(jié)語

在蛋白晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，使用Discovery Studio軟件進行分子對接，得到酶與底物復(fù)合物結(jié)合結(jié)構(gòu)。通過作用力分析獲得與底物結(jié)合和催化相關(guān)的重要位點，并對這些位點進行定點突變。當(dāng)這些位點突變?yōu)槠渌愋桶被岷?，酶活力大幅度下降。結(jié)構(gòu)與進化分析確定了H98～E102間形成的loop區(qū)域、Y398和Y331位點在底物識別與特異性結(jié)合中的重要作用。通過氫鍵及π-π堆積作用固定底物構(gòu)象，促進高效脫羧反應(yīng)的發(fā)生。本研究為TDC的分子改造和生物催化法合成酪胺提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和指導(dǎo)意義。