高 月，王萬林，彭俊超，蔡亞玲，廖加美，易 瓊，王 魯*

(1.西南特色藥用生物資源開發(fā)利用教育部工程研究中心，貴陽 550025；2.貴州省生化工程中心，貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴陽 550025)

在日常飼料中添加抗生素類藥物，具有防控動(dòng)物細(xì)菌性疾病和促動(dòng)物生長作用，但抗生素的濫用容易引起細(xì)菌的耐藥、畜產(chǎn)品的安全及公共衛(wèi)生等問題，而中獸藥在確保畜禽健康方面取得的成績得到了廣泛認(rèn)可，尋找新的中藥、發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢保障動(dòng)物的健康更顯突出。艾納香油是貴州地道藥材艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.提取艾片的附屬產(chǎn)品，具有廣泛的生物活性[1-6]，主要含有L-龍腦、樟腦、α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇、β-石竹烯等[7-9]化合物。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道艾納香及活性成分具有抗菌作用[10-11]，但用藥量均太大(大多數(shù)是mg·mL-1)，前期研究發(fā)現(xiàn)艾納香油對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)[12]、副豬嗜血桿菌[2]具有良好的抗菌活性，由于當(dāng)前市場上沒有艾納香油的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，不同來源的艾納香油由于化學(xué)組成差異，其活性有所不同[13]。為此，本文旨在通過體外抗菌試驗(yàn)篩選抗菌活性好的艾納香油，并篩選其活性成分，為艾納香油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供物質(zhì)基礎(chǔ)，并對艾納香油對S.aureus的抗菌作用進(jìn)行研究，為其在畜禽養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)一步的研究應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

S.aureus(ATCC 13565)、E.coli(ATCC 25922)、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonsadaceae，P.arugino.saATCC 27853)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae，GBSATCC 13813)、白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231)均購自中國藥品生物制品檢定所。SPF級昆明小白鼠，購自于解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證號：SCXK(渝)2012-0003]。艾納香油A1～A5分別購自于貴州省羅甸縣、望謨縣5個(gè)生產(chǎn)艾納香油的公司或農(nóng)戶[13]，艾納香莖葉購自于貴州省羅甸種植戶，經(jīng)貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院王華磊教授鑒定為植物艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.的莖葉，(-)-龍腦、樟腦、(-)-芳樟醇、(+)-芳樟醇、(+/-)-芳樟醇、創(chuàng)愈醇、六氫金合歡烯酰丙酮、反式-石竹烯、氧化石竹烯、(-)-β-蒎烯、(+/-)-α-蒎烯、(-)-α-蒎烯、(+)-α-蒎烯、α-葎草烯、吐溫-80分別購自于上海源葉生物科技有限公司、上海同田生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要儀器

HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀(Agilent公司)，MultiskanGo型全波段酶標(biāo)儀(Thermo Fisher scientific公司)，S-3400 N掃描電子顯微鏡(HITACHI(日立)公司)。

1.3 艾納香油制備

按中國藥典(2015年版)第四部通則揮發(fā)油測定儀器裝置，參考前期研究[14]采用正交設(shè)計(jì)提取的9個(gè)艾納香油，分別為B1～B9，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝獲得的艾納香油為T。

1.4 不同產(chǎn)源的艾納香油體外抗菌活性檢測

1.4.1 艾納香油溶液配制 不同產(chǎn)源的艾納香油(表1)與吐溫-80以1∶1比例混懸后，溶于液體培養(yǎng)基，原溶液濃度配制為7、5 mg·mL-1備用。

1.4.2 抑菌圈的測定 參照CLSI2017標(biāo)準(zhǔn)，采用瓊脂擴(kuò)散法，參考文獻(xiàn)[15]將細(xì)菌菌液調(diào)整至108CFU·mL-1、真菌菌液調(diào)整至107CFU·mL-1備用，每孔加入100 μL艾納香油溶液，細(xì)菌置37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，真菌置28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，游標(biāo)卡尺按十字交叉測量抑菌圈直徑，每試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 MIC、MBC測定 參照CLSI2017標(biāo)準(zhǔn)，采用肉湯微量稀釋法、瓊脂平板計(jì)數(shù)法[16]，按倍半稀釋法將艾納香油原溶液進(jìn)行梯度稀釋，96孔板中分別給予艾納香油溶液各100 μL，加入菌懸液各100 μL。細(xì)菌置37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，真菌28 ℃ 靜置恒溫培養(yǎng)48 h，孔內(nèi)溶液澄清無沉淀為藥物對該菌的MIC值。吸取澄清孔內(nèi)的菌液接種于瓊脂平板上，觀察菌落生長情況，菌落總數(shù)<5個(gè)為藥物對該菌的MBC值。各試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 艾納香油中抗菌活性成分檢測

1.5.1 GC-MS比較分析主要化學(xué)成分 參考文獻(xiàn)[13]采用GC-MS法對自制的艾納香油B5、B9及T進(jìn)行化學(xué)成分檢測分析，比較其主要化學(xué)成分含量。

1.5.2 艾納香油中部分化合物抗菌活性檢測 根據(jù)GC-MS分析結(jié)果，將(-)-龍腦、樟腦、石竹烯氧化物等化學(xué)成分與吐溫-80以1∶1比例混懸后，溶于細(xì)菌培養(yǎng)基，原溶液濃度配制為7、5 mg·mL-1備用。按“1.4.3”操作方法，測定艾納香油中部分化合物對S.aureus、P.arugino.sa的MIC、MBC值。

1.6 艾納香油T對S. aureus感染小鼠的影響

取(28±2)g小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，空白組、模型組、艾納香油T高劑量組、艾納香油T中劑量組、艾納香油T低劑量組、溶劑組，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，艾納香油T3個(gè)劑量組小鼠分別灌胃20、10、5 mg·mL-1的艾納香油T溶液0.3 mL·只-1，空白組灌胃等量生理鹽水，溶劑組灌胃等量吐溫-80，連續(xù)灌胃7次，每天1次，第7天灌胃后30 min腹腔注射S.aureus0.2 mL·只-1，攻菌量為5.0×109CFU·mL-1，空白組腹腔注射等量生理鹽水，觀察小鼠活動(dòng)，死亡的立即剖解觀察各臟器病變。試驗(yàn)觀察7 d，觀察小鼠死亡情況，7 d后沒有死亡的第8天處死小鼠，剖解觀察各臟器病變，特別注意觀察腎病變[17]情況。

1.7 艾納香油T對S. aureus 生長的影響

滅菌的肉湯培養(yǎng)基中加入艾納香油T溶液，使其藥物終濃度分別為0.25～4.00 MIC，分別加入菌懸液后于37 ℃、120 r·min-1搖床培養(yǎng)，分別于0、1、3、6、9、12、15、24、48 h取出，測其在OD600 nm時(shí)的吸光值，以時(shí)間為X軸，OD600 nm值為Y軸繪制S.aureus的生長曲線，每試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 艾納香油T對S. aureus形態(tài)的影響

培養(yǎng)至對數(shù)生長期的S.aureus中加入1、2 MBC的艾納香油T，37 ℃培養(yǎng)12 h，按照掃描電鏡常規(guī)方法制備樣品，于掃描電鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)變化情況。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，各試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，動(dòng)物死亡率及檢出率采用Χ2分析，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同產(chǎn)源艾納香油對受試菌株的抗菌效果

2.1.1 抑菌圈測定結(jié)果 表1結(jié)果顯示，不同產(chǎn)源艾納香油對受試菌株抑菌圈大小均不同，大多數(shù)艾納香油對S.aureus、P.arugino.sa的抑菌圈直徑(D)為14～24 mm。根據(jù)文獻(xiàn)[18]藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)為中介(15～19 mm)或敏感(≥20 mm)，其中，艾納香油B4、B9、T為敏感，抑菌圈直徑均>20 mm。而對E.coli、GBS、Candidaalbicans的抑菌圈直徑<4 mm，為耐藥。

表1 不同產(chǎn)源艾納香油對受試菌的抑菌圈直徑

2.1.2 MIC、MBC測定結(jié)果 根據(jù)表2結(jié)果可知，不同產(chǎn)源的艾納香油對S.aureus、P.arugino.sa的MIC值為9.77～78.13 μg·mL-1、MBC值19.54～312.50 μg·mL-1，其中，艾納香油B9、T對S.aureus的MIC值為9.77 μg·mL-1、MBC值為19.54 μg·mL-1，對P.arugino.sa的MIC值為13.68 μg·mL-1；MBC值為27.35 μg·mL-1，根據(jù)文獻(xiàn)[19]藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)為中介(8 μg·mL-1

表2 不同產(chǎn)源的艾納香油對受試菌株的MIC、MBC結(jié)果(n=3)

2.2 艾納香油中活性成分檢測

2.2.1 艾納香油化學(xué)成分分析結(jié)果 選取艾納香油B5、B9、T進(jìn)行GC-MS聯(lián)用分析，主要化學(xué)成分如表3所示，所測試樣本中化學(xué)成分大致相同，共檢測出(-)-龍腦、氧化石竹烯、γ-桉葉油醇、反式-石竹烯、α-桉葉油醇、β-桉葉油醇、樟腦、別香橙烯等36個(gè)化合物為共有化學(xué)成分，但各油中的主要化學(xué)成分百分含量相對占比各不相同。

表3 GC-MS分析B5、B9、T主要化學(xué)成分

2.2.2 抗菌化學(xué)成分篩選結(jié)果 從表4可知，艾納香油中單體化合物對S.aureus、P.arugino.sa表現(xiàn)出不同的抑菌效果。其中，含量較低的α-葎草烯對S.aureus、P.arugino.sa的MIC值分別為19.54、39.07 μg·mL-1，蒎烯類化合物的MIC值均為78.13～156.25 μg·mL-1。芳樟醇類化合物對S.aureus、P.arugino.sa的MIC值均為156.25～312.50 μg·mL-1，MBC值均為625.00～875.00 μg·mL-1；而含量較高的(-)-龍腦等化學(xué)成分的MIC值均>1 000 μg·mL-1

表4 化學(xué)成分對受試菌株的MIC、MBC結(jié)果(n=3)

2.3 艾納香油T對S. aureus感染小鼠的保護(hù)性試驗(yàn)

與空白組相比，溶劑組、模型組小鼠感染S.aureus后精神萎靡，活動(dòng)減少、行動(dòng)緩慢，身體顫抖，試驗(yàn)期間小鼠死亡率均達(dá)60%(P<0.05)，無論是試驗(yàn)期間還是第8天處死的小鼠，腎病變檢出率、脾體積均明顯增加，差異極顯著(P<0.01)；艾納香油T溶液低、中、高劑量組對小鼠感染S.aureus后活動(dòng)及精神狀況均有所改善，小鼠死亡率呈濃度依賴性減少分別為50%、40%、20%，脾腫大和腎病變檢出率與模型組相比據(jù)其濃度不同也有不同程度減少，差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果詳見表5、圖1。

表5 艾納香油T抗S.aureus感染小鼠影響的結(jié)果

K.空白組；M.模型組；T-80.溶劑對照組；A.20 mg·mL-1 T組；B.10 mg·mL-1T組；C.5 mg·mL-1T組

2.4 艾納香油T對S. aureus生長的影響

如圖2可知，溶劑組菌株的生長趨勢與對照組相同，在6 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，具有完整的生長周期。當(dāng)T溶液濃度為0.25、0.5 MIC作用S.aureus后，菌株在9 h內(nèi)無明顯增殖現(xiàn)象。當(dāng)T溶液濃度達(dá)1MIC時(shí)，菌株在24 h內(nèi)處于抑制狀態(tài)，無增殖現(xiàn)象，24 h后變化明顯；而當(dāng)T溶液濃度達(dá)到2MIC或更高時(shí)，S.aureus在48 h內(nèi)生長曲線幾乎維持在水平狀態(tài)，均無增殖現(xiàn)象。

圖2 艾納香油T對S.aureus生長的影響

2.5 艾納香油T對S. aureus形態(tài)的影響

掃描電鏡下觀察結(jié)果如圖3可知，對照組S.aureus呈葡萄串狀，菌體和表面完整光滑且外觀飽滿。與對照組相比，艾納香油T溶液作用S.aureus后，當(dāng)濃度為1 MBC時(shí)，菌體表現(xiàn)出嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)破壞，菌體分散，表面明顯出現(xiàn)褶皺，有不規(guī)則凸出及凹陷結(jié)構(gòu)；當(dāng)濃度為2 MBC時(shí)，菌體遭到破壞，表面褶皺、變形嚴(yán)重，出現(xiàn)大規(guī)模破碎等現(xiàn)象。

圖3 艾納香油T對S.aureus菌形態(tài)的影響

3 討 論

由于人們越來越重視動(dòng)物源性食品的安全衛(wèi)生，許多國家已先后作出了限用和禁用在飼料中添加抗生素的決定，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2019年7月10日發(fā)布194號公告中明確指出“退出除中藥外所有促生長類藥物飼料的添加劑品種”，如何做到不使用抗生素，確保畜禽的健康，使得尋找新的中藥、發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢以保障動(dòng)物的健康更顯突出。本文參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的西藥體外藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[18-19]，對貴州不同產(chǎn)源的艾納香油進(jìn)行抗菌活性的篩選，篩選出艾納香油B9、T抗菌效果最好，S.aureus和P.arugino.sa對艾納香油B9、T敏感或中介。艾納香油(T)是最佳提取方法獲取的艾納香油，且抗菌效果較強(qiáng)，可作為后續(xù)抗菌活性研究開發(fā)的試驗(yàn)材料。

艾納香油對蠟樣芽胞桿菌的MIC為0.15 mg·mL-1，對S.aureus和白色念珠菌的MIC為1.2 mg·mL-1[20]；艾納香油對黃曲霉、黑曲霉等MIC值均為0.625 mg·mL-1，對S.aureus、E.coli、綠膿桿菌的MIC值分別為1.25、2.50、2.50 mg·mL-1[21]；艾納香中L-龍腦對S.aureus、E.coli、李斯特菌、沙門菌等菌的MIC值均為1.00 mg·mL-1，對紅色毛癬菌、假絲酵母菌MIC值均為0.25 mg·mL-1，對黑曲霉MIC值為0.50 mg·mL-1[10]。從這些數(shù)據(jù)看，艾納香油用藥量均太大(大多數(shù)是mg·mL-1)，而本研究的用量是μg·mL-1級，且研究結(jié)果是通過反復(fù)驗(yàn)證過的，說明艾納香油抗菌活性是確定的。

目前，中獸藥抗菌物質(zhì)不清楚，抗菌效果不穩(wěn)定，使用劑量過大，作用機(jī)制不明確成為畜牧業(yè)上應(yīng)用的“瓶頸”問題。為尋找艾納香油中的抗菌活性物質(zhì)，對艾納香油B5、B9、T進(jìn)行GC-MS聯(lián)用檢測分析出共有化學(xué)成分36種，且各百分含量均不相同，其中艾納香油中含量均較高的(-)-龍腦、氧化石竹烯、創(chuàng)愈醇、六氫金合歡烯酰丙酮等化合物無明顯抗菌效果。而含量較低的α-葎草烯、蒎烯及芳樟醇類化合物具有一定的抑菌活性，其中，α-葎草烯抑菌效果較好。至于尋找艾納香油中具有良好抗菌活性的其他化合物或組合，需引入現(xiàn)代更先進(jìn)的科學(xué)方法和技術(shù)以獲取其抗菌物質(zhì)。

體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，動(dòng)物模型中腎病理變化與文獻(xiàn)報(bào)道病變[22-23]一致，艾納香油對S.aureus感染小鼠有保護(hù)作用，且具有濃度依賴性特點(diǎn)，隨濃度的升高能預(yù)防S.aureus感染小鼠后引起的腎、脾病變的發(fā)生。通過不同濃度艾納香油T溶液作用S.aureus后能不同程度抑制菌株生長，與其他抗菌類藥物[24-26]的生長曲線一致。當(dāng)艾納香油T溶液濃度≥2 MIC時(shí)，菌體形態(tài)發(fā)生改變，菌體完整性遭到破壞而導(dǎo)致菌株死亡，這將為進(jìn)一步抗菌作用機(jī)制的研究提供試驗(yàn)條件。但具體是通過破壞菌細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致內(nèi)容物釋放，還是靶向作用菌株后抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、抑制核酸的復(fù)制與修復(fù)、抑制蛋白質(zhì)合成而破壞細(xì)菌的生長而發(fā)揮作用，還有待于進(jìn)一步地深入研究。

4 結(jié) 論

艾納香油對S.aureus和P.arugino.sa具有良好的抗菌活性，篩選出艾納香油B9、T抗菌效果最好，S.aureus和P.arugino.sa對艾納香油B9、T敏感或中介。不同產(chǎn)源的艾納香油抗菌活性略有差異，其化學(xué)成分大致相同，但主要化學(xué)成分的相對占比各不相同，其中，α-葎草烯、蒎烯和芳樟醇類化合物可能是抑菌關(guān)鍵物質(zhì)。艾納香油T對S.aureus感染小鼠有保護(hù)作用，呈濃度依賴性抑制S.aureus的生長，可通過壞菌體的完整性，影響細(xì)菌生長。