李 楠，張建樓，張永紅，鄭志強(qiáng)，霍珊珊，仲 飛,翟向和

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北省牛羊胚胎工程技術(shù)創(chuàng)新中心，保定 071001)

表面活性蛋白(surfactant protein，SP)是在人和動(dòng)物肺泡表面、羊水等組織中存在的一類非特異免疫防御分子[1-3]，動(dòng)物的SP有4種，即SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。SP-B和SP-C主要功能為降低肺泡表面液體張力，促進(jìn)動(dòng)物的呼吸作用[4-5]；而SP-A和SP-D則是肺泡表面的防御分子，在抵御外來(lái)病原的侵入發(fā)揮重要作用[6-7]。SP-A含有5個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)區(qū)：信號(hào)肽區(qū)，N端二硫鍵形成區(qū)(含半胱氨酸殘基)、含Gly-X-Y 3肽重復(fù)結(jié)構(gòu)的膠原樣區(qū)(collagen-like region, CLR)、疏水α-螺旋頸區(qū)和C端球狀碳水化合物識(shí)別區(qū)(carbohydrate recognition domain, CRD)(也稱凝聚素區(qū))。因其與SP-D相似都具有CLR和CRD區(qū)域，因此，同屬于膠原凝聚素家族[8-9]。在Ca2+存在的條件下，SP-A或SP-D的CRD區(qū)可識(shí)別寡糖鏈并與其結(jié)合。許多病原，如細(xì)菌、囊膜病毒、真菌等，其表面的糖類物質(zhì)均可被SP-A和SP-D識(shí)別并結(jié)合，引起病原的凝聚[10-12]，從而抑制病原對(duì)宿主細(xì)胞的入侵。此外，這兩種表面活性蛋白還有刺激單核-巨噬細(xì)胞的活性[13]，促進(jìn)其吞噬作用，增強(qiáng)其對(duì)多種病原菌的攝取，抑制病原菌的增殖。如人SP-A可抑制嗜血桿菌、綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及A型鏈球菌的增殖，顯示明顯的抗菌活性[14]。此外SP-A還可與多種病毒囊膜糖蛋白，如流感病毒的血凝素(糖蛋白)[15]、呼吸道合胞病毒的糖蛋白[16]、人類免疫缺陷病毒的gp120糖蛋白[17]等結(jié)合，介導(dǎo)吞噬細(xì)胞對(duì)病毒的識(shí)別，中和病毒，從而表現(xiàn)出抗病毒作用。

目前，關(guān)于人以及小鼠和家兔等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的SP-A研究較多，但對(duì)其他動(dòng)物的研究較少。筆者實(shí)驗(yàn)室曾就豬SP-A進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，分別制備了重組豬SP-A和分離純化了天然豬SP-A，發(fā)現(xiàn)SP-A可抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在豬巨噬細(xì)胞中的復(fù)制，抑制多種革蘭陰性/陽(yáng)性菌在體外的增殖，表明豬SP-A具有明顯的抗菌和抗病毒活性[18-19]。

然而目前尚未見(jiàn)對(duì)牛SP-A、SP-D研究的相關(guān)報(bào)道。有許多致病性細(xì)菌和病毒均可感染牛的肺部，引起肺部炎癥。存在于肺泡表面的SP-A是否對(duì)侵入肺部的病原體有抑制作用尚未見(jiàn)報(bào)道。為探討牛SP-A的抗菌和抗病毒活性，需要獲得大量牛的SP-A。為此本試驗(yàn)通過(guò)親和吸附層析法從牛肺泡灌洗液中分離純化了牛天然SP-A，并在體外對(duì)其抗菌活性進(jìn)行初步分析。

1 材料與方法

1.1 牛肺和菌株

牛肺由河北保定市保北清真肉聯(lián)廠提供。致病性大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所微生物菌種保藏管理中心。大腸桿菌DH5α和金黃色葡萄球菌分離株為本室保存的菌種。

1.2 主要試劑及緩沖液

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；Sepharose-4B為Pharmacia產(chǎn)品；山羊抗人SP-A抗體(對(duì)牛SP-A有交叉反應(yīng))及堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG(IgG-AP)購(gòu)自Santa Cruz公司；丁二烯砜(butadiene sulfone)和D-麥芽糖(maltose)購(gòu)自Sigma公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。吸附緩沖液：5 mmol·L-1CaCl2，100 mmol·L-1NaCl，50 mmol·L-1Tris-HCl，0.02% NaN3，pH 7.4；洗滌緩沖液：含1 mol·L-1NaCl的吸附緩沖液；洗脫緩沖液：50 mmol·L-1Tris-HCl, 100 mmol·L-1NaCl, 5 mmol·L-1EDTA和0.02% NaN3, pH 7.4.

1.3 麥芽糖-Sepharose(MS)吸附膠粒的制備

參考本室建立的方法進(jìn)行制備[19]。首先活化Sepharose-4B膠粒：用蒸餾水潤(rùn)洗Sepharose-4B膠粒3次，在20 mL 0.5 mol·L-1Na2CO3中懸浮，在攪拌下慢慢滴加2 mL丁二烯砜(雙功能基團(tuán)試劑)，連續(xù)攪拌1 h。后用蒸餾水洗滌膠粒至中性，濾干后加入8 mL 20% D-麥芽糖溶液，攪拌30 h，使D-麥芽糖與Sepharose-4B膠粒進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。用蒸餾水洗滌，用0.5 mol·L-1NaHCO3(含β-巰基乙醇)封閉1.5～2.0 h。最后用蒸餾水充分洗滌，并懸浮于適量的蒸餾水中，即為麥芽糖-Sepharose吸附膠粒(簡(jiǎn)稱MS膠粒)。在MS膠粒中加入0.02%疊氮鈉，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 牛SP-A的粗分離

用磷酸緩沖液(PBS)灌洗牛肺，收集灌洗液，在4 ℃下離心(2 000×g)10 min，將上清轉(zhuǎn)入另一干凈的離心管中，高速離心(13 800×g)40 min，收集富含SP-A的沉淀。向沉淀中加入20 mL含尿素的吸附緩沖液，攪拌1 h，再用吸附緩沖液在4 ℃下透析過(guò)夜，使SP-A變性、復(fù)性。在4 ℃下10 000×g離心20 min，收集上清液，即獲得SP-A粗提液。

1.5 牛SP-A的純化

MS膠粒用蒸餾水潤(rùn)洗后，加4倍體積的吸附緩沖液平衡膠粒。加入等體積的上述制備的SP-A粗提液，室溫下攪拌40 min，使膠粒吸附SP-A。1 500×g離心5 min，用5倍體積的含1 mol·L-1NaCl的吸附緩沖液洗滌膠粒，膠粒裝柱后用洗脫緩沖液洗脫SP-A。

1.6 吸附緩沖液Ca2+和洗脫緩沖液EDTA對(duì)牛肺SP-A吸附和洗脫影響的分析

分別制備含不同Ca2+濃度(0、5、10、15、20、25 mmol·L-1)的吸附緩沖液和不同EDTA濃度(0、10、20、30、40、50 mmol·L-1)的洗脫緩沖液，分析Ca2+濃度對(duì)SP-A吸附的影響、EDTA濃度對(duì)SP-A洗脫的影響，以確定吸附時(shí)最適Ca2+濃度和洗脫時(shí)最適EDTA濃度。

1.7 牛SP-A純度分析及特異性鑒定

用SDS-PAGE對(duì)牛SP-A進(jìn)行純度分析，用Western blot對(duì)牛SP-A進(jìn)行特異性鑒定。主要操作過(guò)程：牛SP-A樣品先經(jīng)過(guò)12.5 %丙烯酰胺膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后用考馬斯亮藍(lán)對(duì)膠上的蛋白進(jìn)行染色，通過(guò)觀察色帶是否單一和有無(wú)雜帶評(píng)價(jià)樣品純度，根據(jù)色帶密度估計(jì)樣品的相對(duì)含量。上述牛SP-A樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將膠上的蛋白通過(guò)半干轉(zhuǎn)裝置(Bio-Rad)轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，用含5 %脫脂奶粉的TBST(20 mmol·L-1Tri-HCl，pH7.4, 150 mmol·L-1NaCl, 0.05% Tween 20)封閉過(guò)夜后，用山羊抗SP-A抗體(1∶500，一抗)和堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗山羊 IgG(IgG-AP)(1∶1 000，二抗)分別雜交后，最后用堿性磷酸酶底物，氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)(Bio-Rad公司)進(jìn)行顯色，通過(guò)拍照記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.8 牛SP-A生物活性的檢測(cè)

利用細(xì)菌凝聚試驗(yàn)檢測(cè)SP-A的生物活性。在含不同濃度SP-A(0、100、200、300 μg·mL-1)的 10 mL LB培養(yǎng)基中加入100 μL大腸桿菌DH5α(OD600 nm= 0.5)，在37 ℃下共同培養(yǎng)2 h，顯微鏡檢細(xì)菌凝聚狀態(tài)，觀察不同濃度的SP-A對(duì)細(xì)菌的凝聚作用，以評(píng)價(jià)SP-A的生物活性。

1.9 牛SP-A抗菌活性的檢測(cè)

參考張永紅等[19]測(cè)定豬SP-A抗菌活性的檢測(cè)方法，在含不同濃度牛SP-A(0、50、100、150、200、250 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基(10 mL)中，分別接種50 μL已經(jīng)活化的金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和致病性大腸桿菌(OD600 nm= 0.25)，在37 ℃下，搖床培養(yǎng)6 h，測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液的OD600 nm值，評(píng)價(jià)牛SP-A對(duì)不同細(xì)菌的抗菌活性。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用SPSS18.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以t檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本均數(shù)差異顯著性分析。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著, NS表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SP-A的分離純化及鑒定

從牛肺收集的肺泡液經(jīng)高速離心后得到富含有SP-A的沉淀，即牛SP-A的粗制品(圖1 A)。將SP-A溶于PBS中，用MS膠粒吸附SP-A粗制品溶液中的SP-A，得到牛SP-A的純品(圖1 A)。制備的SP-A純品經(jīng)SDS-PAGE電泳后在相對(duì)分子質(zhì)量為30和60 ku處出現(xiàn)2條帶，純度達(dá)95%以上(圖1A-2)，而未經(jīng)MS膠粒吸附的SP-A粗制品則呈現(xiàn)多個(gè)條帶，說(shuō)明SP-A粗制品中含有其他雜蛋白(圖1A-1)。SP-A純品經(jīng)Western blot檢測(cè)，分別在相對(duì)分子質(zhì)量為30和60 ku處出現(xiàn)2條雜交帶(圖1B)，該結(jié)果與SDS-PAGE分析的結(jié)果一致，證實(shí)牛肺泡液中的SP-A以兩種形式存在，分別為SP-A單體蛋白和SP-A二聚體蛋白。上述結(jié)果也表明，本試驗(yàn)制備的MS膠粒可以特異地吸附SP-A蛋白。上述的SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)結(jié)果均顯示，單體SP-A的相對(duì)分子質(zhì)量為30 ku，這與牛SP-A相對(duì)分子質(zhì)量的理論計(jì)算值(25 ku)有明顯差異，這可能是SP-A分子中含有保守的N-糖基化位點(diǎn)(N178YT)，在合成過(guò)程中發(fā)生糖基化，致使SP-A在SDS-PAGE電泳時(shí)蛋白的泳動(dòng)速度變慢，從而出現(xiàn)SP-A分子量偏高的現(xiàn)象。

A.牛SP-A 蛋白的SDS-PAGE鑒定(M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.肺泡洗出液樣品；2.分離純化的牛SP-A蛋白)；B.牛SP-A蛋白的Western blot鑒定(M.預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.牛SP-A蛋白)

2.2 不同純化條件對(duì)SP-A純化效果的影響

2.2.1 吸附緩沖液Ca2+濃度對(duì)MS膠粒吸附牛SP-A的影響 為了確定吸附緩沖液中最適的Ca2+濃度，用含不同Ca2+濃度(0、5、10、15、20、25 mmol·L-1)的吸附緩沖液分別吸附牛肺泡液中的SP-A，分析每克濕重MS膠粒吸附SP-A的質(zhì)量(mg)。由圖2A所示，在一定范圍內(nèi)(5～20 mmol·L-1)，隨著Ca2+濃度的增加，MS膠粒吸附SP-A的能力也隨之增加。當(dāng)Ca2+濃度超過(guò)20 mmol·L-1后，吸附能力上升趨緩，所以20 mmol·L-1的Ca2+濃度為最適Ca2+濃度。

2.2.2 洗脫緩沖液EDTA濃度對(duì)牛SP-A從MS膠粒上洗脫的影響 為了確定洗脫緩沖液中最適的EDTA濃度，用含不同EDTA濃度(0、10、20、30、40、50 mmol·L-1)的洗脫緩沖液分別洗脫MS膠粒吸附的牛SP-A，分析其洗脫效果。圖2B數(shù)據(jù)顯示，在較低的EDTA濃度范圍內(nèi)，隨著洗脫緩沖液EDTA濃度的增加，洗脫后洗脫液中牛SP-A含量不斷增加，當(dāng)EDTA濃度在30 mmol·L-1時(shí)，SP-A的回收率達(dá)到85%。當(dāng)EDTA濃度超過(guò)30 mmol·L-1后，洗脫液的SP-A含量增加不明顯，因此，選擇30 mmol·L-1濃度為洗脫緩沖液中EDTA的最適用量。

A.吸附緩沖液Ca2+濃度對(duì)SP-A純化效果的影響；B.洗脫緩沖液EDTA濃度對(duì)SP-A純化效果的影響

2.3 牛SP-A凝聚細(xì)菌活性的分析

動(dòng)物SP-A均具有凝聚細(xì)菌和囊膜病毒的作用，所以對(duì)菌體或囊膜病毒的凝聚活性常用于評(píng)價(jià)SP-A是否具有生物活性。為確定制備的牛SP-A是否具有凝聚細(xì)菌的作用，利用大腸桿菌DH5α分析了牛SP-A的細(xì)菌凝聚活性。圖3結(jié)果顯示，與對(duì)照組(圖3A)相比，分離純化的牛SP-A可以使大腸桿菌發(fā)生凝聚(圖3B～D)，并且隨著牛SP-A濃度的增高，凝聚作用不斷增強(qiáng)，呈劑量依賴性?？梢?jiàn)本研究制備的牛SP-A具有促進(jìn)細(xì)菌凝聚作用，表明制備的牛SP-A具有生物學(xué)活性。

A.BSA(300 μg·mL-1)處理后大腸桿菌的狀態(tài)；B、C、D.用不同濃度牛SP-A(100、200、300 μg·mL-1)分別處理后大腸桿菌的狀態(tài)

2.4 牛SP-A抗菌活性的分析

為了確定制備的牛SP-A是否具有抗菌活性，本試驗(yàn)在體外分別分析了SP-A對(duì)金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和致病性大腸桿菌增殖的影響。用不同濃度(0、50、100、150、200、250 μg·mL-1)的SP-A分別與已活化的不同細(xì)菌進(jìn)行共培養(yǎng)，6 h后測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液的OD600 nm值，分析牛SP-A對(duì)不同菌的抗菌活性。圖4結(jié)果顯示，隨著SP-A濃度的增加，3種被試細(xì)菌菌液的OD600 nm值均隨之降低，即SP-A對(duì)細(xì)菌增殖的抑制作用隨濃度的增加而增加(圖4A～D)。但SP-A對(duì)不同細(xì)菌的抑菌程度有所不同。當(dāng)SP-A達(dá)到150 μg·mL-1時(shí)，對(duì)致病性大腸桿菌的抑菌程度已超過(guò)50%；而對(duì)于金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌(革蘭陽(yáng)性菌)則需更高濃度才能達(dá)到相同的抑菌效果。上述結(jié)果說(shuō)明，牛SP-A對(duì)金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和致病性大腸桿菌均有明顯的抑菌活性，且對(duì)革蘭陰性菌的抑菌效果高于革蘭陽(yáng)性菌。

A.金黃色葡萄球菌；B.無(wú)乳鏈球菌；C.致病性大腸桿菌；*.P<0.05; **.P<0.01

3 討 論

本試驗(yàn)利用共價(jià)交聯(lián)法將麥芽糖連接在Sepharose膠粒-4B上，制備成能夠特異吸附SP-A的MS膠粒。然后利用制備的MS膠粒從牛肺泡洗出液中吸附牛的SP-A蛋白。結(jié)果表明，制備的MS膠粒可以特異地與SP-A結(jié)合，由此制備的SP-A純度高達(dá)95% 以上。研究顯示，牛SP-A蛋白在自然條件下以兩種形式存在，即單體SP-A和二聚體SP-A。制備的SP-A具有凝聚細(xì)菌的能力，表明SP-A具有生物活性?？咕钚詸z測(cè)結(jié)果顯示，牛SP-A在體外對(duì)革蘭陰性菌(致病性大腸桿菌)和革蘭陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌)的增殖均有明顯的抑制作用，表明牛SP-A具有抗菌活性。這項(xiàng)研究不僅為進(jìn)一步研究牛SP-A的生物學(xué)特性及抗菌活性提供了必要的條件，同時(shí)，為奶牛及肉牛生產(chǎn)研發(fā)潛在的抗菌制劑開(kāi)辟了新的思路。

奶牛乳腺炎是奶牛的常見(jiàn)病和多發(fā)病，不僅影響奶牛的健康，同時(shí)嚴(yán)重影響奶牛的產(chǎn)奶量和奶的質(zhì)量，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[20-22]。金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌等是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌[23-24]，目前，常采用抗生素藥物對(duì)牛乳腺炎進(jìn)行治療，抗生素在奶牛業(yè)中濫用不僅引起病菌的耐藥性問(wèn)題，同時(shí)，也會(huì)引起藥物在牛體內(nèi)和牛乳中的殘留, 給人類的食品安全帶來(lái)一定的隱患[25]。為此，本研究初步分析了牛SP-A對(duì)引起牛乳腺炎的3種常見(jiàn)病菌的抗菌活性，旨在為未來(lái)研發(fā)牛SP-A制劑用于防治奶牛乳腺炎提供依據(jù)。

牛肺泡液中含有多種蛋白，包括4種肺泡表面活性蛋白(SP),不同的SP蛋白理化性質(zhì)有所不同[26-27]，SP-A和SP-D均屬于膠凝素家族成員，其分子中含有1個(gè)依賴鈣離子的糖識(shí)別區(qū)域(CRD)，所以在鈣離子存在的條件下，SP-A和SP-D可以識(shí)別多種糖類并與之結(jié)合[28-30]。利用這一特點(diǎn)，本試驗(yàn)運(yùn)用共價(jià)交聯(lián)法制備了麥芽糖(糖類)與Sepharose膠粒共價(jià)交聯(lián)的MS膠粒，使其能夠與牛肺泡液中的SP-A或SP-D蛋白進(jìn)行特異結(jié)合，從而分離純化出牛的天然SP-A或SP-D。然而SP-B和SP-C分子中不含有CRD區(qū)域，所以不能被MS膠粒吸附。使人感興趣是盡管SP-A和SP-D均能被MS膠粒特異吸附，但由于兩者的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)有不同之處，兩者的密度也有較大的差異，所以通過(guò)高速(13 800×g)離心法就可以將二者分開(kāi)[26-27]，離心后的沉淀部分富含SP-A，而上清部分富含有SP-D。所以如果欲純化牛的SP-D蛋白，也可用MS膠粒從上清中吸附SP-D。

利用MS膠粒純化牛的SP-A，吸附緩沖液的Ca2+濃度和洗脫液的EDTA的濃度直接影響SP-A的純化效果，為優(yōu)化SP-A純化條件，本研究分析了吸附緩沖液Ca2+濃度和洗脫緩沖液EDTA濃度對(duì)SP-A純化效果的影響，結(jié)果顯示，吸附緩沖液Ca2+濃度為20 mmol·L-1和洗脫液EDTA濃度為30 mmol·L-1，可獲得良好的分離純化效果。

動(dòng)物SP-A的抗菌作用是通過(guò)多種途徑實(shí)現(xiàn)的，但主要是SP-A對(duì)病原菌或病毒的凝聚作用，當(dāng)病原菌或病毒侵入肺時(shí)，存在于肺泡表面的SP-A以及SP-D就會(huì)使病原菌或病毒發(fā)生凝聚，防止它們侵入到肺細(xì)胞。同時(shí)，被SP-A和SP-D凝聚的病原菌或病毒容易被存在于肺泡表面的肺泡巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞所吞噬，進(jìn)而達(dá)到徹底清除病原菌或病毒的目的，所以SP-A和SP-D對(duì)肺吞噬細(xì)胞針對(duì)病原的吞噬有調(diào)理作用[31-32]。有研究證實(shí)，SP-A和SP-D凝聚細(xì)菌后，還可通過(guò)增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性抑制細(xì)菌的增殖[14]。本試驗(yàn)在體外分析的SP-A對(duì)3種病菌表現(xiàn)的抗菌活性，推測(cè)主要是通過(guò)SP-A對(duì)細(xì)菌的凝聚作用和增加病菌細(xì)胞膜的通透性使細(xì)菌的增殖受到抑制所致。

這項(xiàng)研究為今后對(duì)牛SP-A的生物學(xué)特性及抗菌活性的研究提供了重要的試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)，為SP-A抗菌制劑的研發(fā)提供了新的思路。在試驗(yàn)中，筆者僅通過(guò)牛SP-A對(duì)引起牛乳腺炎的3種常見(jiàn)病菌的抗菌活性進(jìn)行了初步分析，有關(guān)牛SP-A對(duì)其他病菌的抗菌活性、以及抗病毒、抗真菌的活性有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

通過(guò)制備麥芽糖與Sepharose-4B凝膠共價(jià)交聯(lián)的MS膠粒，成功地從牛肺泡洗出液中分離純化出牛SP-A蛋白，純化的牛SP-A蛋白不僅具有凝聚細(xì)菌的生物活性，同時(shí)對(duì)多種病菌表現(xiàn)較強(qiáng)的抗菌活性。