朱道仙，吳 植，陸 江，黃 濤，劉 莉*

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院動物醫(yī)學院，泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院寵物科技學院，泰州 225300；3.江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，泰州 225300)

我國是養(yǎng)鵝大國，養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展迅速，但近年來全國范圍內(nèi)暴發(fā)了雛鵝痛風，導致雛鵝大量死亡，造成巨大經(jīng)濟損失[1]。雛鵝痛風發(fā)病機制涉及多個方面，包括尿酸(UA)合成過多[2]、分解減少[3]、排泄障礙[4]及病毒等[5]。腎是UA排泄的主要器官，雛鵝腎發(fā)育不成熟易損傷，從而阻礙UA的排泄，是形成痛風的病理基礎。因此，減少腎損傷對降低雛鵝痛風發(fā)病率具有重要意義。盡管目前研究發(fā)現(xiàn)了一些易導致鵝腎損傷的因素，如星形病毒[6]，并采取了一些補救措施，但結(jié)果并不令人滿意，亟需進一步研究。

近年研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂在糖尿病腎病、慢性腎衰竭、IgA腎病等多種腎疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，這些細菌已被證明具有原發(fā)性炎癥作用和腎毒性[7-9]。也有研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在腎損傷和炎癥中具有關鍵性作用[10]。腸道菌群或其產(chǎn)生的脂多糖(LPS)可能通過與腎固有免疫系統(tǒng)Toll樣受體(TLRs)結(jié)合而成為腎損傷的重要介質(zhì)[11]。痛風雛鵝腸道菌群也會發(fā)生改變，并且與腎損傷關系密切[12]。但其機制不甚明了。因此，本研究從臨床病例入手，通過16S rDNA測序技術(shù)，基于TLR4/MyD88/NF-κB通路，探討痛風雛鵝腸道菌群對腎損傷的作用及機制，助力探索有效的防治措施。

1 材料與方法

1.1 痛風雛鵝

2019年1—6月，于江蘇省泰州市某鵝場共收集具有內(nèi)臟型痛風特征(食欲減退，排出石灰渣樣稀糞，剖檢可見腸系膜、腹膜、胸膜、肌肉以及腹腔和胸腔后的全部內(nèi)臟器官的漿膜表面等都沉積有大量的白色尿酸鹽，腎腫大，輸尿管變粗等)的10～14日齡發(fā)病雛鵝15只，記為痛風組(Gout)。同時，根據(jù)精神活潑，叫聲清脆，飲食及排糞正常等特征選取同一鵝場同一批相同日齡的健康雛鵝15只，記為健康對照組(Control)。所有雛鵝均為籠養(yǎng)(籠長100 cm，寬100 cm，高20 cm)，每籠20只左右，采用自配雛鵝飼料(粗蛋白約為19%)飼喂，每天喂4～5次，并給予少量菜葉，自由飲食，消毒、衛(wèi)生防疫和日常管理按照規(guī)?；B(yǎng)禽場常規(guī)飼養(yǎng)方法進行。

1.2 血液生化指標測定

對所有雛鵝進行頸靜脈采血并裝入試管中，在37 ℃水浴鍋中靜置，待分層后吸取上清液于離心管中，按2 500 r·min-1離心10 min，取上清液置于4 ℃ 冰箱中保存，次日檢測。血清肌酐(Cr)用改良苦味酸法測定，血清尿酸(UA)用酶比色法測定，血清尿素氮(BUN)用脲酶-谷氨酸脫氫酶法測定。

1.3 腸道菌群16S rDNA高通量測序

1.3.1 糞便采集 將所有雛鵝處死后，無菌采取盲腸糞便分別放置于2 mL無菌管中，-80 ℃保存，并在24 h內(nèi)進行高通量測序。

1.3.2 糞便總DNA提取與PCR 稱取無菌糞便樣100 mg，采用Qiagen DNA試劑盒按說明書提取總DNA，再以獲得的細菌DNA為模板進行細菌16S rDNA的V3-V4可變區(qū)PCR擴增，上游引物F為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游引物R為5′-GGACTACGVGGGTATCTAAT-3′。反應條件：95 ℃預變性 10 min，92 ℃變性45 s，50 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，6個循環(huán)；92 ℃變性45 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；然后72 ℃擴展延伸10 min，4 ℃保存。采用生工生物工程(上海)股份有限公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對所得PCR產(chǎn)物進行純化后，用于后續(xù)操作。

1.3.3 高通量測序及處理 使用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后, 使用Illumina Miseq PE 300平臺進行Paired-end測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)QIIME(version 1.9.1)進行去除接頭序列、低復雜度序列和低質(zhì)量序列的處理，得到高通量原始堿基序列，用RDF分類器將相似性大于97%的序列劃分為一個分類操作單元(OTUs)，與GreenGene數(shù)據(jù)庫進行比對，得到注釋結(jié)果。

1.3.4 生物信息學分析 用QIIME1.9.1[13]分析菌群α多樣性(Chao1、Shannon)，運用Canoco5[14]進行主成分分析(PCA)β多樣性，組間差異菌群用LEfSe分析[15]，運用PICRUSt[16]預測菌群基因組功能，與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，計算KEGG通路后進行STAMP差異分析。

1.4 RT-qPCR測定腎組織TLR4/MyD88/NF-κB通路中相關分子的mRNA表達量

采集新鮮腎組織，液氮速凍，-80 ℃保存待測。TRIzol法提取腎組織總RNA，測定其OD260 nm/OD280 nm均為1.8～2.0，然后，在37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴增條件：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，循環(huán)35次。登錄NCBI數(shù)據(jù)庫查找相應基因序列，用Primer-BLAST進行引物設計及特異性檢驗，最后由上海生工合成，見表1。以β-actin為內(nèi)參，基因表達量用2-ΔΔCt法計算。

表1 引物信息

1.5 Western blot測定腎組織TLR4/MyD88/NF-κB通路中相關分子蛋白表達

在低溫條件下，將腎組織研磨破碎，加RIPA裂解液后，用超聲法提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品加到10%的SDS-PAGE電泳膠上進行電泳分離，再轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后分別和TLR4(1∶1 000)、MyD88(1∶5 000)、NF-κB(1∶500)、IL-1β(1∶1 000)、TNF-ɑ(1∶1 000)、IL-6(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體在4 ℃搖床中孵育過夜。次日，加辣根過氧化物酶標記兔抗鵝Ⅱ抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h, TBST洗膜3次，每次5 min，化學發(fā)光成像儀中顯影成像。所有抗體均購于福因德科技(武漢)有限公司。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J分析軟件對各組條帶的光密度值進行分析。目標蛋白的相對表達水平=目標蛋白條帶的灰度值/GAPDH條帶的灰度值，并以對照組做標準化。試驗重復3次，取平均值。

1.6 糞菌移植無菌小鼠試驗

參考ZHAO等[17]的方法進行試驗。在無氧室中，隨機無菌選取痛風組3個糞便樣本，并充分混勻，得到痛風糞便混合樣本(gout group)，同樣方法得到健康對照組混合糞便樣本(control group)。分別取每個混合糞便樣本0.5 g，加入25 mL無菌Ringer’s緩沖液稀釋，充分攪勻后，靜置5 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，并添加等量的20%脫脂乳，制成糞菌液。試驗當天制備新鮮糞菌液并使用，其余的保存在-80 ℃下，備用。將15只斷奶的無菌C57BL/6 J雄性小鼠(由揚州大學實驗動物中心提供)在12 h光周期下飼養(yǎng)于無菌的柔性薄膜塑料隔離器中，喂食消毒過的飼料與水，在糞菌移植前定期收集糞便、食物、水和填料等樣本進行細菌學檢查來監(jiān)測細菌污染。在7周齡時，隨機等分為3組(每組單獨隔離)：M-Control組、M-Gout組和M-Gout+TAK-242組。試驗開始時，M-Control組小鼠口服(灌胃)100 μL Control group的糞菌液，M-Gout組和M-Gout+TAK-242組口服100 μL Gout group的糞菌液，并于第2天各組分別加強口服相同糞菌液1次；M-Gout+TAK-242組每天腹腔注射TAK-242(3 mg·kg-1)，其他兩組每日注射等劑量的生理鹽水，試驗期20 d，試驗在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院實驗動物飼養(yǎng)房進行。試驗結(jié)束后，空腹收集各組小鼠血液用于Scr、BUN、UA和腎損傷因子-1(KIM-1，ELISA法)的檢測，同時，采集糞便進行16S rDNA測序，方法同上。將小鼠致死后，采集腎組織，部分用于TLR4、MyD88及NF-κB的mRNA表達量測定，方法同“1.3”；部分用于制作組織切片，觀察病理變化。

1.7 數(shù)據(jù)處理

連續(xù)性數(shù)據(jù)用表示, 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件ANOVA程序單因素方差分析進行比較，腸道菌群豐度比較采用Kruskal-Wallis檢驗，用Spearman分析相關性。P<0.05表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 痛風雛鵝血液生化指標及腸道菌群多樣性的變化

從圖1可以看出，痛風雛鵝血液中的UA、Cr及BUN均極顯著高于健康對照組(P<0.01，圖1A)。將腸道菌群16S rDNA測序結(jié)果按97%相似性聚類所得的操作分類單元(OTUs)進行比較，發(fā)現(xiàn)痛風雛鵝的OTUs數(shù)量極顯著低于健康對照(P<0.01)，有67個OTUs顯著下調(diào)，81個OTUs顯著上調(diào)(圖1B)；反映菌群α多樣性的Chao 1指數(shù)及Shannon指數(shù)均極顯著低于健康對照(P<0.01)，PCA分析發(fā)現(xiàn)，在腸道菌群各樣本中，組內(nèi)樣本間離散程度較小，組間樣本較為分散(圖1C)，說明雛鵝發(fā)生痛風時伴有腸道菌群多樣性的改變。

A.血液生化指標(尿酸、肌酐、尿素氮)；B.OTUs數(shù)量的變化；C.腸道菌群多樣性變化(Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、PCA分析)；**.P<0.01

2.2 痛風雛鵝腸道菌群結(jié)構(gòu)、差異菌群及基因功能預測分析

在門水平上，雛鵝腸道菌群主要由5大優(yōu)勢菌門組成，分別是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)，且痛風雛鵝的變形菌門相對豐度升高(圖2A)。在屬水平上，兩組豐度前20位菌屬無顯著變化，擬桿菌屬(Bacteroides)、梭菌屬(Clostridium)、艾克曼菌屬(Akkermansia)等為優(yōu)勢菌屬(圖2B)。為了進一步分析痛風雛鵝盲腸菌群結(jié)構(gòu)特征，將兩組菌群豐度進行LEfSe分析(LDA>2)，發(fā)現(xiàn)痛風雛鵝盲腸中富集大量的埃希菌屬(Escherichia)、變形菌屬(Proteus)及腸球菌屬(Enterococcus)等細菌，而梭菌屬(Clostridium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)及假單胞菌屬(Pseudomonas)等細菌低于健康對照組(圖2C)。運用PICRUSt分析對腸道菌群的基因功能進行預測，在KEGG L2水平，痛風雛鵝腸道菌群在免疫系統(tǒng)(immune system)、細菌感染(infectious disease: bacterial)、膜傳輸(membrane transport)及核苷酸代謝(nucleotide metabolism)等代謝途徑參與度較高(圖2D)。

A.門水平的相對豐度；B.屬水平的相對豐度；C.LEfSe分析(綠色表示在痛風雛鵝中豐度較高物種，紅色表示在健康對照雛鵝中豐度較高的物種)；D.KEGG代謝通路富集分析(水平2)

2.3 痛風雛鵝腎組織TLR4/MyD88/NF-κB通路中相關分子的表達情況及與腸道菌群相關性分析

與健康對照組相比，痛風雛鵝腎組織中TLR4(P<0.01)、MyD88(P<0.01)及NF-κB(P<0.01)的mRNA表達量升高(圖3A)，且TLR4/MyD88/NF-κB通路下游產(chǎn)物IL-1β(P<0.05)、TNF-α(P<0.01)及IL-6(P<0.05)的mRNA表達量亦升高(圖3B)。相關性分析發(fā)現(xiàn)，這些分子的表達與腎功能指標UA、Cr及BUN呈正相關關系(圖3C)，與埃希菌屬(Escherichia)、變形菌屬(Proteus)及腸球菌屬(Enterococcus)等菌屬呈強正相關，與梭菌屬(Clostridium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)及丁酸球菌屬(Butyicicoccus)等菌屬呈負相關(圖3D)。與對照組比較，痛風雛鵝腎組織中LTR4、TNF-α及IL-6蛋白相對表達上調(diào)極顯著(P<0.01)，MyD88、NF-κB及IL-1β蛋白相對表達顯著上調(diào)(P<0.05)。

A.TLR4、MyD88及NF-κB的mRNA表達(**，P<0.01)；B.下游產(chǎn)物IL-1β、TNF-α及IL-6的mRNA表達(*，P<0.01，**，P<0.01)；C.TLR4/MyD88/NF-κB通路中相關分子與腎功能指標相關系數(shù)熱圖(+.P<0.05; ++.P<0.01)；D.腸道菌群與TLR4/MyD88/NF-κB通路中相關分子及腎功能指標相關系數(shù)熱圖(+.P<0.05; ++.P<0.01)。E.腎組織TLR4/MyD88/NF-κB通路中相關分子的蛋白表達(*.P<0.01；**.P<0.01)

2.4 痛風雛鵝糞菌移植對無菌小鼠腎損傷的作用

為了確定痛風雛鵝腸道菌群通過TLR4/MyD88/NF-κB通路引發(fā)腎損傷作用，分別將痛風組與健康對照組腸道菌群移植了到無菌C57BL/6 J小鼠體內(nèi)，并且使用TLR4抑制劑TAK-242進行干預。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M-Gout組和M-Gout+TAK-242組小鼠腸道菌群與痛風雛鵝相似，M-Control組小鼠腸道菌群與健康雛鵝相似(圖4A)；與M-Gout+TAK-242組和M-Control組比較，M-Gout組小鼠腎組織中TLR4、MyD88及NF-κB分子mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.05，圖4B)，血中Cr、BUN、KIM-1及UA均顯著升高(P<0.05，圖4C)；M-Gout組小鼠的腎小管發(fā)生變性，管腔變窄，有少量炎性細胞浸潤，M-Gout+TAK-242組小鼠的腎組織結(jié)構(gòu)變化不明顯(圖4D)。

A.各樣本腸道菌群在屬水平的聚類熱圖；B.TLR4、MyD88及NF-κB分子mRNA表達量；C.腎功能指標的變化(肌酐、尿素氮、腎臟損傷因子-1和尿酸)；D.腎組織結(jié)構(gòu)的變化(HE染色，400×)。移植痛風雛鵝糞菌液組：M-Gout；移植痛風雛鵝糞菌液組+TAK-242組：M-Gout+TAK-242；移植健康雛鵝糞菌液組：M-Control；痛風糞菌液供體：Gout group；健康糞菌液供體：Control group。#表示與其他兩組比較P<0.05

3 討 論

動物胃腸道中有1013～1014個微生物，這些微生物參與宿主的各種生理活動，如新陳代謝、免疫反應及發(fā)揮腸道屏障作用等[18]。如果這種微生態(tài)平衡遭到破壞可使宿主發(fā)生疾病。近年來，已經(jīng)證明腸道微生物群與宿主的腎健康和痛風發(fā)生風險有關[19]。在一些研究中，觀察到痛風患者的腸道菌群與健康人的腸道菌群具有較大差異，表明腸道菌群與痛風有關[20]。在本研究中，根據(jù)PCA分析發(fā)現(xiàn)，痛風雛鵝的腸道菌群與對照雛鵝存在差異，表現(xiàn)為菌群多樣性顯著降低，變形菌門豐度顯著增加，病鵝腸道中富集大量腸球菌屬、埃希菌屬和變形菌屬，KEGG代謝通路預測分析顯示病鵝免疫系統(tǒng)活躍且存在細菌感染。因此，推測上述菌群可能是痛風雛鵝腸道菌群的主要特征，提示腸道菌群與雛鵝痛風的發(fā)生有關。

血清中的肌酐及尿素氮是衡量腎臟功能的重要指標，腎損傷時二者含量急劇升高。本研究中，痛風雛鵝血清肌酐及尿素氮顯著高于對照組，說明痛風雛鵝伴有腎損傷過程。Toll樣受體4(toll-like receptor，TLR4)是在天然免疫過程中發(fā)揮重要作用的一類蛋白質(zhì)分子，與LPS結(jié)合后，可激活TLR4/MyD88/NF-κB通路，使其下游產(chǎn)物IL-1β和TNF-α等促炎因子的表達上調(diào)，促進炎癥的發(fā)生。大量研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB通路活化在腎損傷中扮演者重要角色[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，痛風雛鵝腎組織中TLR4、MyD88、NF-κB以及其下游產(chǎn)物IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表達量及蛋白表達量均顯著高于對照組，且這些分子mRNA表達量與Cr、BUN及UA呈正相關。提示TLR4/MyD88/NF-κB通路在痛風雛鵝腎損傷中也發(fā)揮著重要作用。為了闡明痛風雛鵝腸道菌群與腎損傷的潛在機制，本研究對腸道菌群、TLR4/MyD88/NF-κB通路中相關分子表達及腎功能指標之間進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)腸球菌屬、埃希菌屬及變形菌屬等菌群豐度與TLR4、MyD88、NF-κB的基因表達量以及Cr、BUN水平呈正相關。因此，推測痛風雛鵝腸道菌群可能通過激活TLR4/MyD88/NF-κB通路引起腎損傷。

將發(fā)病動物腸道菌群移植給無菌小鼠，觀察小鼠是否會出現(xiàn)相同病癥或病理過程，是驗證腸道菌群與疾病之間因果關系的一種重要方法。Zhao等[17]通過腸道菌群移植，證明由膳食纖維調(diào)節(jié)的腸道微生物群對改善2型糖尿病患者的葡萄糖穩(wěn)態(tài)有因果作用。為了進一步驗證本研究的假設，將雛鵝腸道菌群移植到無菌小鼠體內(nèi)，聚類分析發(fā)現(xiàn),小鼠菌群與供體雛鵝菌群具有高度相似性，且M-Gout組小鼠腎小管上皮細胞發(fā)生變性，血清中Cr、BUN及KIM-1水平均顯著高于移植健康雛鵝菌群的小鼠。KIM-1是腎小管損傷的一種重要的標志物，在腎小管受損后急劇升高[23]。M-Gout+TAK-242組小鼠盡管菌群與供體雛鵝菌群具有高度相似性，但小鼠腎小管組織結(jié)構(gòu)未見異常變化，血清Cr、BUN及KIM-1水平與M-Control組小鼠無顯著差別，顯著低于M-Gout組小鼠，這說明抑制小鼠TLR4表達可以減輕痛風雛鵝腸道菌群誘導小鼠發(fā)生腎損傷。由此可以推斷，痛風雛鵝腸道菌群可以通過TLR4/MyD88/NF-κB通路促進腎損傷的發(fā)生。

4 結(jié) 論

痛風雛鵝腸道菌群多樣性降低，變形菌門、腸球菌屬、埃希菌屬及變形菌屬等細菌豐度增加，而且這種腸道菌群的改變可以通過TLR4/MyD88/NF-κB通路促進雛鵝腎損傷，加劇痛風的發(fā)展。因此，腸道菌群可作為雛鵝痛風防治的潛在新靶點。