翟云云，李佳佳，張 爽，任子昱，金前躍，杜永坤*，萬 博*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物免疫學(xué)國際聯(lián)合研究中心，鄭州 450002；2.河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

豬偽狂犬病(porcine pseudorabies, PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)引起的以仔豬神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和高死亡率、育肥豬呼吸障礙和生長緩慢以及母豬繁殖障礙等為主要特征的病毒性傳染病[1]。PRV屬于皰疹病毒科，為雙鏈DNA病毒。先天免疫作為宿主防御病原體入侵的第一道防線，通過激活宿主的模式識別受體(PRR)，識別大批病原體中保守的分子結(jié)構(gòu)，即所謂的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)。識別后，PRR被觸發(fā)，激活Ⅰ型干擾素(IFN)、IFN刺激基因(ISG)和炎性細(xì)胞因子，從而抑制病原體的復(fù)制并促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[2]。同時(shí)病毒也有一套逃逸宿主天然免疫的機(jī)制，有研究表明，PRV在感染初期可以抑制大多數(shù)具有有效抗病毒作用的IFN-β刺激基因的表達(dá)[3-4]，以便于逃避天然免疫。但是自2011年以后，以HeN1株為代表的PRV變異株在全國多個(gè)地區(qū)暴發(fā)流行，原有疫苗對豬群保護(hù)效率不足[5]，因此偽狂犬病已經(jīng)成為當(dāng)前我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要威脅[6]。

凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)含熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain, PYD)和半胱天冬酶募集域(caspase recruitment domain，CARD)，2個(gè)結(jié)構(gòu)域均相對保守，都含有疏水性氨基酸，且都含有6個(gè)保守的α-螺旋，可以實(shí)現(xiàn)自身的寡聚化，并招募一些含有同源結(jié)構(gòu)域的蛋白，共同參與炎癥反應(yīng)[7]。ASC參與多種炎癥小體的形成，如NLR蛋白或AIM2等，可作為共有的接頭蛋白與半胱天冬酶-1(caspase-1)共同激活下游炎癥因子的產(chǎn)生[8]。

近年來，對ASC在病毒感染過程中引發(fā)的天然免疫方面的作用有越來越多的研究。黏液瘤病毒(myxoma virus)編碼的M13L蛋白可與ASC互作，抑制caspase-1的激活，進(jìn)而阻止炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9]。HSV-1和腺病毒DNA感染通過激活典型炎癥小體NLRP3、ASC和caspase-1通路導(dǎo)致IL-1β、IL-18的產(chǎn)生[10-11]。活化的ASC與STING相互作用并阻止TBK1和STING之間的締合，從而抑制了Ⅰ型IFN的誘導(dǎo)[12]。dsDNA病毒在豬細(xì)胞系中以STING依賴性方式激活I(lǐng)FN-β[13]，促進(jìn)IFN-β的表達(dá)來抵御病毒的入侵。由于ASC與STING的相互作用從而抑制了具有抗病毒作用的IFN-β的表達(dá)，而ASC對PRV感染過程中IFN-β的表達(dá)是否存在調(diào)節(jié)作用還未見報(bào)道。為了更為全面地了解ASC在抗病毒天然免疫的作用，以及是否參與PRV逃逸宿主天然免疫的過程，首先通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建豬ASC基因敲除PK-15胞，利用PRV-GFP模式病毒和PRV-QXX毒株檢測ASC基因敲除對PRV增殖的調(diào)節(jié)作用，以期為進(jìn)一步研究偽狂犬病病毒逃逸宿主免疫應(yīng)答機(jī)制提供新思路，同時(shí)，為豬偽狂犬病的防治提供新的研究策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

PK-15(豬腎上皮細(xì)胞)、Vero(非洲綠猴腎上皮細(xì)胞)和HEK293T/17(人胚腎上皮細(xì)胞衍生細(xì)胞系)購自美國ATCC；豬偽狂犬病病毒(PRV-QXX)為本實(shí)驗(yàn)室保存。豬偽狂犬病重組熒光病毒(PRV-GFP)由中國科學(xué)院武漢病毒所饋贈(zèng)；E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞購自北京鼎國昌盛公司；LentiCRISPR v2(Addgene Plasmid 49535)、pMD2.G和pSPAX2購自美國Addgene公司；Q5高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和T7 E1酶購自美國NEB公司；Puromycin和細(xì)胞培養(yǎng)耗材均購自美國Thermo公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑、DNA Marker均購自大連寶生物公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參照美國國家生物技術(shù)中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫已公布的豬ASC基因組序列(GenBank登錄號NC_010445.4)設(shè)計(jì)sgRNA和PCR擴(kuò)增引物(表1)；通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢需要檢測的基因mRNA序列，通過Primer7.0軟件設(shè)計(jì)Q-PCR引物(表1)。

表1 引物序列表

1.3 p-ASC-sgRNA載體構(gòu)建

將兩對sgRNA引物先進(jìn)行退火雜交，退火條件95 ℃ 5 min。將LentiCRISPR v2質(zhì)粒用BsmbⅠ酶37 ℃ 酶切3 h，將目的片段進(jìn)行回收。將退火雜交的引物與酶切后回收的目的片段用T4 DNA連接酶在4 ℃條件下連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，加入1 mL的無抗LB液體培養(yǎng)基，放入37 ℃搖床中，220 r·min-11 h。將培養(yǎng)后菌液均勻涂布在含有Amp的固體LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行基因測序鑒定。用QIAGEN質(zhì)粒中提試劑盒提取測序正確的質(zhì)粒，分別命名為p-ASC-sgRNA1、p-ASC-sgRNA2。

1.4 ASC敲除細(xì)胞系的構(gòu)建

利用慢病毒包裝質(zhì)粒(pMD2.G、pSPAX2)與構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T/17細(xì)胞，于48 h回收慢病毒，并取1 mL病毒液感染PK-15細(xì)胞。感染48 h后，用含有8 μg·mL-1Puromycin的10% FBS/DMEM篩選細(xì)胞。待對照組細(xì)胞全部死亡時(shí)，將感染組換為3 μg·mL-1Puromycin的10% FBS/DMEM并將多克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。取多克隆細(xì)胞提取基因組并進(jìn)行T7酶切檢測，通過有限稀釋法將編輯效率高的多克隆細(xì)胞進(jìn)行單克隆細(xì)胞系篩選。通過對測序結(jié)果進(jìn)行比對，將敲除單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 T7核酸內(nèi)切酶檢測

以提取的基因組為模板，利用p-ASC-F/p-ASC-R PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳并回收PCR產(chǎn)物。取200 ng進(jìn)行退火雜交，取0.6 μL T7核酸內(nèi)切酶酶切1 h。用DNA PAGE膠電泳后用含有SYBR Green核酸染料的1×TBE溶液中染色1 h，通過在凝膠成像儀中對染色的DNA PAGE膠拍照來檢測T7酶切結(jié)果，再利用ImageJ v1.8.0 2對編輯效果進(jìn)行分析。

1.6 細(xì)胞增殖試劑盒(CCK-8)檢測

以每孔1×104個(gè)細(xì)胞在96孔板中接種PK-15和PK15-ASC-/-細(xì)胞，各6孔。于不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、12、24、36、48 h)，在培養(yǎng)孔中加入10 μL CCK-8溶液37 ℃孵育2 h，450 nm波長檢測培養(yǎng)液吸光度。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測

將PK-15和PK15-ASC-/-細(xì)胞以3×104個(gè)·孔-1接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)到40%，空白細(xì)胞計(jì)數(shù)后以PRV-GFP MOI=0.01感染細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱中吸附 1 h后棄去原培養(yǎng)基，PBS清洗2遍后加入維持培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、6、12、24、36、48 h進(jìn)行流式檢測分析。

1.8 Real-time quantitative PCR檢測

以每孔3×105個(gè)細(xì)胞在35 mm培養(yǎng)皿中接種PK-15和PK15-ASC-/-細(xì)胞。以MOI=1 感染PRV-QXX后0、6、12、24、36、48 h收取RNA。Trizol裂解法提取細(xì)胞總RNA并通過去除染色質(zhì)DNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，每個(gè)模板做3個(gè)重復(fù)孔，進(jìn)行RT-qPCR檢測。利用T-test對Q-PCR結(jié)果進(jìn)行分析檢驗(yàn)。

1.9 Western blot檢測PRV-gE蛋白的表達(dá)

將PK-15和PK15-ASC-/-細(xì)胞按照6×105個(gè)接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞密度達(dá)到60%，以MOI=1 PRV-QXX感染細(xì)胞。分別于0、6、12、24、36 h不同時(shí)間點(diǎn)后收獲細(xì)胞，用90 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)裂解后用BCA方法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h。PRV-gE單克隆抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃過夜孵育，1×TBST以10、10、5、5 min的時(shí)間洗膜4次，然后室溫孵育山羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000)2 h。1× TBST以10、10、5、5 min的時(shí)間洗膜4次后進(jìn)行顯影，試驗(yàn)以β-actin作為參照基因。

1.10 PRV子代病毒滴度測定

以每孔3×105個(gè)細(xì)胞在35 mm培養(yǎng)皿中接種PK-15和PK15-ASC-/-細(xì)胞，每種細(xì)胞各種6個(gè)培養(yǎng)皿。培養(yǎng)細(xì)胞融合度至約40%，空白細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照MOI=0.01 PRV-QXX感染細(xì)胞，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附1 h，吸附結(jié)束后，用PBS清洗1遍，換成維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。按照0、6、12、24、36、48 h不同時(shí)間點(diǎn)收取樣品，將病毒懸液反復(fù)凍融3次，離心取上清。以每孔1×104接種Vero細(xì)胞于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，以10倍遞次稀釋將病毒液進(jìn)行稀釋，分別加入相對應(yīng)的孔板中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附1 h，結(jié)束后換成維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)5～6 d，在顯微鏡下對病變孔進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后利用Reed-Muench法計(jì)算PRV子代病毒滴度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各試驗(yàn)均平行重復(fù)3次，通過GraphPad 8.0軟件將3次試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖。

2 結(jié) 果

2.1 Cas9/sgRNA載體的構(gòu)建

用BsmbⅠ對LentiCRISPR v2載體單酶切。37 ℃酶切3 h后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果顯示,在13 000和1 873 bp位置出現(xiàn)兩個(gè)特異性條帶，通過DNA膠回收試劑盒對13 000 bp目的片段進(jìn)行膠回收后與sgRNA引物退火產(chǎn)物進(jìn)行連接，通過轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行DNA測序。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒p-ASC-sgRNA構(gòu)建成功(圖1A、B)，提取質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)。

A.ASC-sgRNA1測序結(jié)果；B.ASC-sgRNA2測序結(jié)果；框內(nèi)為sgRNA序列

2.2 PK-15敲除ASC基因單克隆細(xì)胞系的構(gòu)建

T7酶切檢測顯示sgRNA1、sgRNA2均能有效對ASC基因進(jìn)行編輯(圖2A、B)。選取編輯效率較高的ASC-sgRNA2多克隆細(xì)胞進(jìn)一步篩選PK15-ASC-/-單克隆細(xì)胞株，最終測序比對得到靶位點(diǎn)處插入了1個(gè)T堿基，并引起ASC后續(xù)密碼子移碼突變的8號單克隆細(xì)胞(圖2C)，并命名為PK15-ASC-/-。

A.T7酶切鑒定ASC-sgRNA編輯效率(indel.Insert、Dellet、Mutation的縮寫)；B、C.敲除ASC基因的單克隆細(xì)胞系測序結(jié)果；D.Western blot鑒定ASC基因敲除的單克隆細(xì)胞

2.3 ASC基因敲除對PK-15細(xì)胞增殖的影響

通過CCK-8檢測敲除ASC基因后，是否會(huì)影響細(xì)胞增殖活性。結(jié)果表明，敲除ASC基因后PK15-ASC-/-細(xì)胞與對照組相比OD450 nm波長吸光度值差異不顯著，結(jié)果表明，ASC基因的敲除對PK15細(xì)胞的增殖無影響(圖3)。

ns.P>0.05

2.4 敲除ASC基因在PK-15細(xì)胞中對PRV-GFP增殖的影響

用PRV-GFP(MOI=1)感染PK-15和PK15-ASC-/-細(xì)胞，分別在0、6、12、24、36、48 h后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中GFP熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明PK-15細(xì)胞中GFP熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加顯著升高，而PK15-ASC-/-細(xì)胞中GFP熒光強(qiáng)度與PK-15細(xì)胞中GFP熒光強(qiáng)度相比則顯著減弱，表明敲除ASC基因后顯著抑制PRV-GFP的增殖(圖4)。

A.PRV-GFP流式檢測結(jié)果；B.流式結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析(ns.P>0.05；*.P<0.05；**.P<0.001；***.P<0.000 1)

2.5 ASC基因敲除對PRV-gB mRNA表達(dá)的影響

按MOI=1 PRV-QXX感染PK-15和PK15-ASC-/-細(xì)胞，RT-qPCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)PRV-gBmRNA表達(dá)量。隨著PRV復(fù)制，PRV-gBmRNA表達(dá)量遞增。敲除ASC后PRV-gBmRNA水平顯著低于對照組(圖5)，結(jié)果進(jìn)一步表明PK15-ASC-/-細(xì)胞相比于PK-15細(xì)胞可以顯著抑制PRV基因轉(zhuǎn)錄。

RT-qPCR檢測感染PRV-QXX不同時(shí)間PRV-gB基因拷貝數(shù)；ns.P>0.05；***.P<0.000 1；****.P<0.000 09

2.6 ASC基因敲除對IFN-β、ISG15和IL-1β mRNA水平的影響

RT-qPCR檢測PK-15和PK15-ASC-/-細(xì)胞感染PRV-QXX后細(xì)胞內(nèi)IFN-β、ISG15 和IL-1βmRNA表達(dá)水平。如圖6所示，PK-15與PK15-ASC-/-細(xì)胞內(nèi)IFN-β、ISG15 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，并與PRV感染時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)，同時(shí)IL-1βmRNA的表達(dá)水平下調(diào)。且PK15-ASC-/-細(xì)胞與PK-15細(xì)胞相比組間差異顯著。結(jié)果顯示，敲除ASC基因抑制了IL-1βmRNA的表達(dá)，促進(jìn)了IFN-βmRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)干擾素刺激因子的生成，抑制病毒感染。

PRV-QXX感染不同時(shí)間點(diǎn)RT-qPCR檢測基因拷貝數(shù)；A.IFN-β；B.ISG15；C.IL-1β；ns.P>0.05；*.P<0.05；***.P<0.000 1；****.P<0.000 09

2.7 ASC基因敲除對PRV-gE蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果(圖7)顯示PK-15細(xì)胞感染PRV 24 h后可以檢測到PRV-gE蛋白，36 h后表達(dá)量最高。雖然PK15-ASC-/-細(xì)胞在24 h也可以檢測到PRV-gE蛋白，但在24、36 h的組間灰度分析結(jié)果顯示PK15-ASC-/-細(xì)胞中PRV-gE蛋白表達(dá)顯著低于PK-15細(xì)胞。結(jié)果表明，PK15-ASC-/-細(xì)胞相比于PK-15細(xì)胞顯著抑制PRV-gE蛋白的翻譯。

A.Western blot結(jié)果；B.灰度值分析結(jié)果；****.P<0.000 09

2.8 ASC基因敲除對PRV-QXX子代病毒滴度的影響

用PRV-QXX(MOI=1)感染PK-15和PK15-ASC-/-細(xì)胞，分別在0、6、12、24、36、48 h后收取子代病毒，利用TCID50法進(jìn)行病毒滴度測定。結(jié)果表明PK15-ASC-/-細(xì)胞中子代病毒滴度與PK-15細(xì)胞中子代病毒滴度相比顯著減弱，表明敲除ASC基因抑制PRV-QXX子代病毒的產(chǎn)生。

3 討 論

ASC具有PYD和CARD 2個(gè)結(jié)構(gòu)域，可分別結(jié)合NLRP3和caspase-1，形成炎性小體。ASC作為接頭蛋白連接pro-caspase-1，使pro-caspase-1自分裂、活化，促進(jìn)IL-1β和IL-18的分化成熟，同時(shí)誘導(dǎo)黏附分子、趨化因子等炎癥細(xì)胞因子的合成，放大局部炎癥反應(yīng)[14]。有研究表明，ASC參與多種宿主抗病毒天然免疫過程。流感病毒的NS1蛋白與NLRP3相互作用并抑制了ASC誘導(dǎo)的炎性小體完全活化所需的單斑點(diǎn)形成，從而抑制NLRP3炎性小體介導(dǎo)的IL-1β分泌[15]；ASC能夠協(xié)調(diào)炎癥小體依賴性和非依賴性免疫反應(yīng)，以有效控制西尼羅河病毒(WNV)感染[16]；ASC和STING之間的相互作用可以抑制STING及其下游分子TBK1的激活，最終抑制IFN-β的表達(dá)[12]；而在缺乏ASC的巨噬細(xì)胞中poly(dA-dT)可以引起較高水平的IFN-β的表達(dá)[17]。

*.P<0.05; ***.P<0.000 1

PRV是一種重要的動(dòng)物病原，其感染過程復(fù)雜，可以在靶細(xì)胞核內(nèi)完成基因組裝，然后通過出芽在細(xì)胞核膜內(nèi)側(cè)達(dá)到最終的成熟，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。同時(shí)，病毒組裝可以通過二次出芽進(jìn)入高爾基體網(wǎng)的囊泡中形成最終的病毒粒子，通過囊泡質(zhì)膜的融合最終完成成熟的PRV病毒粒子的釋放。干擾素(IFN)是宿主先天性免疫系統(tǒng)是針對病毒感染的主要防御策略[18-20]。在PRV感染的早期階段宿主細(xì)胞ISG15被上調(diào)，而體外試驗(yàn)中證實(shí)過表達(dá)ISG15增加IFN-β的表達(dá)，降低PRV的病毒滴度和mRNA水平，從而有效地抑制PRV復(fù)制[21]。外核苷酸焦磷酸酶磷酸二酯酶1(ENPP1)通過水解cGAMP，抑制IRF3磷酸化，減少IFN-β的分泌。過表達(dá)ENPP1抑制IFN-β表達(dá)從而增強(qiáng)PRV感染，而ENPP1的沉默使PRV感染減弱[22]。PRV感染，內(nèi)化的病毒DNA以STING依賴性方式激活I(lǐng)FN-β，激活宿主體內(nèi)的天然免疫抵抗病毒感染[13]。筆者的研究結(jié)果顯示，與正常PK-15細(xì)胞相比，感染PRV后PK15-ASC-/-細(xì)胞IL-1β的表達(dá)顯著降低，同時(shí)IFN-β的表達(dá)顯著升高，試驗(yàn)首次證實(shí)ASC對PRV感染有顯著調(diào)節(jié)作用。有研究報(bào)道PRV通過STING信號通路激活宿主體內(nèi)的IFNs刺激因子的大量表達(dá)[13]，而ASC可以與STING互作抑制其信號通路下游分子IFNs的表達(dá)[12]，但是ASC是否會(huì)通過調(diào)節(jié)STING從而影響IFN-β的表達(dá)，需要更為深入的探究。同時(shí)，有研究表明，IFNs天然免疫與炎性小體信號通路間存在拮抗效應(yīng)，Ⅰ型干擾素抑制炎性小體活性和IL-1β的產(chǎn)生[23-24]，而炎性小體信號通路也可以負(fù)調(diào)控IFNs天然免疫信號通路激活，各種NLR(如NLRX1[25]、NLRP4[26]、NLRP6[27])對IFNs有負(fù)調(diào)控作用。本試驗(yàn)的研究結(jié)果也證實(shí)了敲除ASC抑制炎性小體信號通路同時(shí)能夠激活I(lǐng)FNs天然免疫信號傳導(dǎo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，抑制炎性小體信號通路可以更好地抑制PRV的感染，但ASC在IFNs天然免疫信號通路具體的作用有待進(jìn)一步研究。

本次試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對豬ASC基因進(jìn)行成功敲除后，研究ASC對PRV感染的影響。本研究選擇遞送效率更高的慢病毒載體系統(tǒng)，將Cas9和sgRNA導(dǎo)入到PK-15細(xì)胞系中，能大大提高ASC基因編輯效率。PRV體外感染試驗(yàn)結(jié)果表明敲除ASC基因能夠顯著抑制PRV感染。試驗(yàn)通過多種方法證實(shí)敲除ASC基因能夠顯著抑制PRV感染，首先通過流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測表明PK15-ASC-/-細(xì)胞中GFP熒光強(qiáng)度顯著低于PK-15細(xì)胞；通過TCID50測定表明PK15-ASC-/-細(xì)胞中子代病毒滴度顯著低于PK-15細(xì)胞；通過Western blot檢測表明PK15-ASC-/-細(xì)胞中g(shù)E蛋白表達(dá)顯著低于PK-15細(xì)胞；通過Q-PCR檢測表明PK15-ASC-/-細(xì)胞中PRV-gBmRNA表達(dá)顯著低于PK-15細(xì)胞。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，敲除ASC基因能夠顯著促進(jìn)IFN-βmRNA和ISG15 mRNA表達(dá)。大多數(shù)ISGs表達(dá)后能夠作用于病毒的整個(gè)生活周期(吸附、進(jìn)入、組裝和釋放)，抑制病毒進(jìn)一步感染。但ASC在PRV生活周期發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的具體階段還需要進(jìn)一步詳細(xì)研究。

本試驗(yàn)為PRV致病機(jī)制的研究提供了新的思路，為PRV防控策略的制定提供了新的數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié) 論

利用慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得PK15-ASC-/-單克隆細(xì)胞系，通過流式細(xì)胞儀、病毒滴度測定、Western blot和RT-qPCR檢測了PRV感染情況，結(jié)果表明，敲除ASC基因促進(jìn)IFN-βmRNA的表達(dá)，從而抑制PRV感染。