李艷紅，劉 潔，吳正理

(西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

肥大細(xì)胞(mast cell, MC)是一種起源于骨髓或者其他造血組織的多功能造血干細(xì)胞，在組織中分化成熟、并能在組織中長期存活的一類炎癥效應(yīng)顆粒細(xì)胞。成熟的肥大細(xì)胞表達(dá)2種主要的表面受體：高親和力的IgE受體(high affinity IgE receptor, FcεRI)和干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF)受體c-Kit(CD117)[1-2]。肥大細(xì)胞作為一類重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，分布于各種組織、器官的表皮或黏膜上，在IgE介導(dǎo)的過敏性疾病中發(fā)揮核心作用[1]。通過膜上組成型表達(dá)的FcεRI結(jié)合并交聯(lián)抗原依賴性的IgE，可致敏、活化肥大細(xì)胞，繼而觸發(fā)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)各種炎性介質(zhì)的釋放，包括其細(xì)胞質(zhì)顆粒內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)(如組胺)，以及從頭合成的細(xì)胞因子和趨化因子[3-4]。過敏疾病是肥大細(xì)胞炎癥介質(zhì)的過度產(chǎn)生和釋放的一種表現(xiàn)[5]，在人[6-8]和養(yǎng)殖動(dòng)物[9-10]中發(fā)生的概率越來越大，而且養(yǎng)殖寵物和人之間可以相互影響產(chǎn)生過敏反應(yīng)[9, 11]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，食物源過敏事件[12-15]、疫苗過敏事件[16-17]頻發(fā)，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。為此，深入了解動(dòng)物過敏的分子機(jī)制，有利于預(yù)防和治療動(dòng)物過敏性疾病，為畜牧業(yè)的健康生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin, CaN)是一種參與多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的多功能信號(hào)酶，由催化亞基(CnA)和調(diào)節(jié)亞基(CnB)組成的異源二聚體，在許多生物學(xué)過程以及疾病的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，如在cAMP代謝、微管組裝、骨骼肌代謝、血管平滑肌細(xì)胞、T細(xì)胞的活性(活化、分化及增殖)等過程中起至關(guān)重要的作用[18]；在心肥大、骨質(zhì)疏松、骨骼肌纖維化、變態(tài)反應(yīng)和自身免疫性疾病[19-20]及神經(jīng)元生長和突觸可塑性[21]等多種疾病的免疫應(yīng)答中扮演中心角色。CaN-NFAT信號(hào)通路可通過活化T細(xì)胞而參與哮喘的整個(gè)發(fā)病過程[22-23]，同時(shí)，參與了控制免疫、神經(jīng)、心血管、骨骼系統(tǒng)發(fā)育和功能的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大調(diào)節(jié)[20]；鈣調(diào)磷酸酶還可以通過激活NFκB信號(hào)途徑刺激天然免疫反應(yīng)[24]；且受鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子NFAT[25]和NFκB[26]均參與肥大細(xì)胞的脫顆粒過程，但鈣調(diào)磷酸酶是否參與肥大細(xì)胞顆粒的形成以及脫顆粒過程，仍未見報(bào)道。本研究旨在探究鈣調(diào)磷酸酶對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的影響，以期為動(dòng)物過敏性疾病的預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

胎牛血清、培養(yǎng)基(DMEM/F12、Opti-MEM)、磷酸緩沖液(PBS)、雙抗、胰酶均購自美國Gibco公司。限制性內(nèi)切酶、嘌呤霉素、TaqDNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、BpiⅠ內(nèi)切酶、Lipofectamine 3000、DNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑購自Invitrogen公司。A23187、Carnoy固定液、HBSS緩沖液、LPS、anti-DNP IgE、DNP-BSA、甲苯胺藍(lán)、C48/80、p-NAG、NP-40、WST-1購自Sigma公司。pX459質(zhì)粒為廣西大學(xué)林文珍教授饋贈(zèng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠肥大細(xì)胞系(RBL-2H3，中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所)培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，貼壁生長，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%以上時(shí)以1∶3傳代，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 pX459-CnAβ-sgRNA載體構(gòu)建與檢測

使用在線軟件CRISPR direct在大鼠CnAβ基因序列(NC_005114.4)的第一個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)3個(gè)sgRNA寡核苷酸序列。根據(jù)質(zhì)粒pX459中BpiⅠ酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，在sgRNA正義鏈寡核苷酸序列的5′端添加“CACC”，并在反義鏈寡核苷酸序列的5′端添加“AAAC”。為提高轉(zhuǎn)錄效率，若sgRNA正義鏈寡核苷酸序列的“CACC”后面的堿基不是“G”，則需要添加堿基“G”或“GG”，并在反義鏈寡核苷酸序列的3′端添加堿基“C”或“CC”，同時(shí)，設(shè)計(jì)無義DNA序列作為對(duì)照(control oligo)，序列設(shè)計(jì)結(jié)果見表1。將合成的兩條單鏈sgRNA退火形成雙鏈sgRNA，然后，經(jīng)BpiⅠ酶切再與經(jīng)BpiⅠ酶切的pX459載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，最后，進(jìn)行陽性質(zhì)粒篩選和測序驗(yàn)證。

表1 CnAβ基因的sgRNA序列

1.4 CnAβ基因敲除RBL-2H3細(xì)胞系的構(gòu)建

將重組質(zhì)?；驘o義DNA對(duì)照質(zhì)粒用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染入大鼠RBL-2H3細(xì)胞，用終濃度1 μg·mL-1嘌呤霉素對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選以構(gòu)建穩(wěn)定的CnAβ基因敲除細(xì)胞系。具體操作：取對(duì)數(shù)生長期的RBL-2H3細(xì)胞，以5×105cells·孔-1均勻鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h；用Opti-MEMTM培養(yǎng)基分別稀釋脂質(zhì)體LipofectamineTM3000和3種等量混合的pX459-CnAβ-sgRNA質(zhì)粒(敲除組/knockout，KO)或無義DNA對(duì)照pX459質(zhì)粒(MOCK)后按1∶1的比例混勻，室溫靜置15 min。將配制好的“質(zhì)粒-脂質(zhì)體”混合物緩慢加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，邊加邊搖勻。培養(yǎng)24 h后，去上清，每孔加入2 mL含1 μg·mL-1嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基；72 h后，更換含1 μg·mL-1嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基；待培養(yǎng)96 h后，觀察細(xì)胞存活量，并稀釋成單細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。最后，提取細(xì)胞DNA，以CnAβ基因引物(上游引物：5′-ACATGTAGGATGACTGGGTT-3′；下游引物：5′-AAGAGCAAAGGAAGGTGTTG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，以篩選CnAβ基因敲除的RBL-2H3細(xì)胞株。

1.5 RT-PCR驗(yàn)證CnAβ基因的表達(dá)

用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，分別對(duì)CnAβ基因和GAPDH基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測基因的表達(dá)水平。RT-PCR擴(kuò)增引物分別為CnAβ基因(上游引物：5′-ATACTTAGGCGGGAGAAAACC-3′，下游引物：5′-CCATACAAGCTTCATAGACC-3′)，GAPDH基因(上游引物：5′-ACTCCCTCAAGATTGTCAGC-3′，下游引物：5′-ACATTGGGGGTAGGAACACG-3′)。

1.6 WST-1染色測定細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，分別稀釋成0.5×105、1.0×105，或5.0×105cells·mL-1，以100 μL·孔-1接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在405 nm處測定吸光值，此時(shí)記為0 h。然后每孔分別加入10 μL WST-1，混勻，于5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72和96 h測定吸光值(A405 nm)。

1.7 甲苯胺藍(lán)染色檢測

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入滅菌蓋玻片，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞加入培養(yǎng)孔中(2×105cells·孔-1)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，制作細(xì)胞爬片。棄上清，PBS漂洗細(xì)胞后，加入含10 μmol·L-1A23187的新鮮培養(yǎng)基刺激1.5 h。棄上清，PBS漂洗細(xì)胞，取出細(xì)胞爬片，用Carnoy液固定10 min，66%乙醇脫水10 min，0.5%醋酸處理1 min。加入0.5%甲苯胺藍(lán)染色1.5 h，蒸餾水洗滌3次，室溫干燥。用中性樹脂封片，于顯微鏡(40×)下觀察。

1.8 DNP、C48/80和LPS誘導(dǎo)細(xì)胞脫顆粒

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞(用于DNP-BSA刺激的細(xì)胞需用1 μg·mL-1anti-DNP IgE致敏過夜)，用HBSS緩沖液重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells·mL-1。將細(xì)胞以每孔100 μL接種于96孔 板細(xì)胞培養(yǎng)板中。用HBSS緩沖液稀釋DNP-BSA、LPS和C48/80，使其終濃度分別為DNP-BSA(0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、50.00、100.00 μg·mL-1)，LPS(0.0、0.1、1.0、10.0、100.0 μg·mL-1)，C48/80(0、10、20、40、60、80、100、200 μg·mL-1)。每孔分別加入100 μL稀釋后的DNP-BSA，LPS，C48/80，空白對(duì)照加入100 μL HBSS緩沖液。置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后，于1 500 r·min-14 ℃離心10 min，取上清(細(xì)胞培養(yǎng)上清液)。加入200 μL 1% NP-40細(xì)胞裂解液于細(xì)胞沉淀中，重懸細(xì)胞，室溫靜置10 min后，3 400 r·min-14 ℃離心5 min，取上清(細(xì)胞裂解上清液)。細(xì)胞脫顆粒效率采用β-氨 基己糖苷酶(β-hexosaminidase)的釋放率來表示，分別取50 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解上清液或HBSS緩沖液(對(duì)照)于96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入50 μL 1 mmol·L-1p-NAG液，37 ℃孵育2 h；加入200 μL 0.1 mol·L-1碳酸鹽緩沖液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀中測定吸光值(A405 nm)。按照如下公式計(jì)算細(xì)胞脫顆粒效率。

脫顆粒%=(A405 nm 細(xì)胞培養(yǎng)上清液-A405 nm 對(duì)照)/(A405 nm 細(xì)胞培養(yǎng)上清液+A405 nm 細(xì)胞裂解上清液-2 A405 nm 對(duì)照)×100。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，*.P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pX459-CnAβ-sgRNA載體構(gòu)建

將成功轉(zhuǎn)化的候選單菌落大腸桿菌DH5α細(xì)胞提取質(zhì)粒，然后用BpiⅠ 酶切候選重組質(zhì)粒pX459-CnAβ-sgRNA(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3)并進(jìn)行電泳檢測(圖1A)。由于外源片段的插入破壞了質(zhì)粒BpiⅠ 的酶切位點(diǎn)，因此，不能被BpiⅠ 酶切的質(zhì)粒即插入了外源DNA片段；而能被BpiⅠ 酶切的質(zhì)粒則表示未插入外源DNA片段，如圖1A 中sgRNA1-P1、sgRNA3-P4。最后，挑取3個(gè)質(zhì)粒(sgRNA1-P5、sgRNA2-P2和sgRNA3-P3)進(jìn)行測序驗(yàn)證(圖1B)，結(jié)果表明，這3種sgRNA均成功插入pX459質(zhì)粒，可用于后續(xù)CnAβ基因敲除RBL-2H3細(xì)胞株的構(gòu)建。

2.2 CnAβ基因敲除RBL-2H3細(xì)胞系的構(gòu)建

將成功構(gòu)建的pX459-CnAβ-sgRNA質(zhì)粒載體用脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)入RBL-2H3細(xì)胞中，經(jīng)嘌呤霉素篩選出49個(gè)單克隆細(xì)胞株，通過DNA測序鑒定后顯示其中12個(gè)單克隆細(xì)胞株均有一定程度的敲除(圖2A)，其敲除效率為24.5%。筆者選擇敲除最多的6號(hào)克隆株(KO)作為進(jìn)一步研究對(duì)象，提取該細(xì)胞株基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后顯示，與野生型(WT)和無義DNA對(duì)照(MOCK)組細(xì)胞相比，KO組細(xì)胞的CnAβ基因片段明顯變短(圖2B)，測序結(jié)果顯示，已成功敲除整個(gè)外顯子1及附近的381 bp序列片段(圖3)。為進(jìn)一步了解該片段的缺失是否影響CnAβmRNA的表達(dá)，提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果顯示，DNA片段缺失后CnAβ基因不能正常表達(dá)(圖4)，而野生型細(xì)胞(WT)和無義DNA對(duì)照細(xì)胞(MOCK)均正常表達(dá)，且經(jīng)鈣離子載體A23187刺激前后其表達(dá)量無明顯變化，表明CnAβ基因?yàn)榻M成性表達(dá)，CnAβ基因敲除細(xì)胞系(KO)構(gòu)建成功。

圖3 敲除細(xì)胞與野生細(xì)胞DNA序列比對(duì)

WT.野生細(xì)胞；KO.CnAβ基因敲除細(xì)胞; MOCK.無義DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞；0、1、3.A23187 刺激時(shí)間(h)

2.3 CnAβ基因?qū)BL-2H3生長的影響

為了研究CnAβ基因缺失后是否影響RBL-2H3細(xì)胞的生長，采用WST-1檢測細(xì)胞的增殖。結(jié)果如圖5所示，3種細(xì)胞以不同濃度(0.5×105、1.0×105或5.0×105cells·mL-1)接種后，細(xì)胞增殖均無顯著性差異，在24 h內(nèi)均可到達(dá)生長平穩(wěn)期。結(jié)果表明，敲除CnAβ基因?qū)BL-2H3細(xì)胞生長無影響。

A.0.5×105 cells·mL-1；B.1.0×105 cells·mL-1；C.5.0×105 cells·mL-1; WT.野生細(xì)胞；KO.CnAβ基因敲除細(xì)胞; MOCK.無義DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞

2.4 CnAβ基因?qū)BL-2H3細(xì)胞顆粒含量的影響

為了研究CnAβ基因缺失對(duì)RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)顆粒形成的影響，本試驗(yàn)首先通過制作細(xì)胞爬片，利用鈣離子載體A23187刺激細(xì)胞1.5 h后經(jīng)甲苯胺藍(lán)試劑染色觀察(圖6)。結(jié)果顯示，3種細(xì)胞在靜息狀態(tài)下均較飽滿，邊緣整齊，染色較深，且3種細(xì)胞沒有明顯差異；當(dāng)細(xì)胞脫顆粒后，細(xì)胞變大、變圓，細(xì)胞膜邊緣不整齊，細(xì)胞質(zhì)變得稀疏，染色變淺，并出現(xiàn)很多空泡結(jié)構(gòu)，但3種細(xì)胞結(jié)構(gòu)無明顯差異。進(jìn)一步檢測經(jīng)A23187刺激后細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)釋放率(圖7)，結(jié)果顯示，3種細(xì)胞β-氨基己糖苷酶釋放率無顯著差異。上述結(jié)果表明，CnAβ基因缺失不影響RBL-2H3細(xì)胞顆粒的形成和顆粒的含量。

圖6 A23187誘導(dǎo)前后3種細(xì)胞的形態(tài)(40×)

圖7 10 μmol·L-1 A23187刺激細(xì)胞脫顆粒

2.5 CnAβ基因?qū)BL-2H3細(xì)胞脫顆粒的影響

由于A23187是鈣離子載體，其作用原理是在增加細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度從而激活細(xì)胞，而不是通過細(xì)胞表面的受體信號(hào)調(diào)節(jié)。因此，為了進(jìn)一步研究CnAβ基因?qū)BL-2H3細(xì)胞表面受體調(diào)節(jié)細(xì)胞脫顆粒的影響，筆者選擇了C48/80、IgE/DNP-BSA和LPS作為刺激物檢測細(xì)胞表面受體信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞脫顆粒的影響。結(jié)果顯示，C48/80、IgE/DNP-BSA和LPS刺激RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒效應(yīng)均存在劑量效應(yīng)(圖8A、C、E)，且C48/80的最佳刺激濃度為100 μg·mL-1(圖8A)，DNP-BSA的最佳刺激濃度為10.00 μg·mL-1(圖8C)，LPS的最佳刺激濃度為1.0 μg·mL-1(圖8E)。LPS刺激RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒效應(yīng)顯著低于C48/80和IgE/DNP-BSA刺激。3種刺激因子分別刺激3種細(xì)胞，野生型細(xì)胞(WT)和無義DNA突變細(xì)胞(MOCK)脫顆粒效應(yīng)無顯著差異，但均顯著高于CnAβ基因缺失細(xì)胞(KO)的脫顆粒效應(yīng)。進(jìn)一步檢測了3種刺激因子在最佳刺激濃度下的刺激時(shí)間效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)3種刺激因子均存在刺激時(shí)間依賴性，刺激60 min后，細(xì)胞脫顆粒效應(yīng)均達(dá)到峰值(圖8B、D、F)；與劑量效應(yīng)類似，野生型細(xì)胞(WT)和無義DNA突變細(xì)胞(MOCK)脫顆粒效應(yīng)無顯著差異，但均顯著高于CnAβ基因缺失細(xì)胞(KO)的脫顆粒效應(yīng)。綜上表明，CnAβ基因缺失顯著抑制了RBL-2H3細(xì)胞表面受體信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞脫顆粒效應(yīng)。

A.C48/80刺激細(xì)胞脫顆粒的濃度效應(yīng); B.100 μg·mL-1 C48/80刺激細(xì)胞脫顆粒的時(shí)間效應(yīng); C.DNP刺激細(xì)胞脫顆粒的濃度效應(yīng); D.10 μg·mL-1 DNP刺激細(xì)胞脫顆粒的時(shí)間效應(yīng); E.LPS刺激細(xì)胞脫顆粒的濃度效應(yīng); F.1 μg·mL-1 LPS刺激細(xì)胞脫顆粒的時(shí)間效應(yīng).*.P<0.05; **.P<0.01

3 討 論

本研究成功構(gòu)建了CnAβ基因缺失的RBL-2H3細(xì)胞株，CnAβ基因的缺失并不影響RBL-2H3細(xì)胞的生長繁殖、細(xì)胞顆粒的形成和顆粒的含量，但顯著抑制了細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的細(xì)胞脫顆粒效應(yīng)。這表明，CnAβ基因在細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒效應(yīng)的信號(hào)通路中起著關(guān)鍵作用，為肥大細(xì)胞脫顆粒的分子機(jī)制研究提供了研究基礎(chǔ)，同時(shí)，為過敏性疾病的防治提供了研究靶點(diǎn)。

利用CRISPR/Cas9質(zhì)粒構(gòu)建基因缺失型細(xì)胞株已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[27]，但應(yīng)用在免疫細(xì)胞的基因突變還比較少。本文利用CRISPR/Cas9質(zhì)粒對(duì)RBL-2H3細(xì)胞進(jìn)行CnAβ基因的敲除，但敲除效率較低，僅24.5%。這可能是由于免疫細(xì)胞具有自我保護(hù)機(jī)制，外源物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)更容易被降解。

鈣調(diào)磷酸酶是一種參與多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的多功能信號(hào)酶，主要通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NFAT和NF-κB的活性參與到細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[20]。但鈣調(diào)磷酸酶是否參與肥大細(xì)胞脫顆粒過程并不清楚。本研究結(jié)果說明,CnAβ基因不參與肥大細(xì)胞顆粒的形成，但廣泛參與由細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒過程。肥大細(xì)胞激活有IgE依賴性和IgE非依賴性兩種模式。IgE通過與其受體FcεRI特異性結(jié)合發(fā)揮作用，是肥大細(xì)胞最常見的一種激活方式，同時(shí)也是IgE介導(dǎo)過敏反應(yīng)的基礎(chǔ)[28]。C48/80(Compound 48/80)是N-甲基-對(duì)甲氧基苯乙胺和甲醛縮合產(chǎn)生的多聚體混合物，可激發(fā)Gi-蛋白依賴的肥大細(xì)胞脫顆粒，有效地活化肥大細(xì)胞[29]。研究表明，對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射C48/80或直接刺激RBL-2H3細(xì)胞可引起大鼠肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺和β-氨基己糖苷酶[30-31]。脂多糖(LPS)是一種存在于革蘭陰性菌胞壁的多糖，研究發(fā)現(xiàn)，LPS可通過結(jié)合細(xì)胞表面受體TLR(toll like receptor)免疫刺激后可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺和β-氨基己糖苷酶，以及炎性因子IL-1、1L-6和TNF-α等[5, 32]。β-氨基己糖苷酶是肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒后釋放的一種預(yù)合成物質(zhì)。只有機(jī)體過敏時(shí)才會(huì)引發(fā)血漿中β-氨基己糖苷酶的含量明顯升高，可以作為肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象的標(biāo)志物[33]。本研究通過檢查β-氨基己糖苷酶的釋放率，證明了CnAβ基因參與調(diào)控FcεRI、Gi-蛋白和TLR介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒過程，也表明CnAβ基因在一定程度上調(diào)節(jié)了機(jī)體的免疫反應(yīng)。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建了CnAβ基因敲除RBL-2H3細(xì)胞系，CnAβ基因缺失不影響肥大細(xì)胞的生長、細(xì)胞內(nèi)顆粒的形成和顆粒的含量，但CnAβ基因缺失嚴(yán)重抑制了經(jīng)細(xì)胞表面受體信號(hào)誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒效應(yīng)，表明CnAβ基因參與調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞的脫顆粒過程。