王宗捷，張瑞雪，劉守勤, 靳亞平，林鵬飛

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

ZEN主要是由鐮刀菌屬物種經(jīng)過聚合酮途徑產(chǎn)生，常存在于霉變的谷物上。ZEN化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，因此在谷物的加工過程中不易被降解，動物常因食用污染了ZEN的霉變飼料而中毒[1]。ZEN和雌激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有相似性，因此，ZEN可以和內(nèi)源性雌激素競爭性結(jié)合雌激素受體，引起體內(nèi)生殖激素調(diào)節(jié)紊亂，導(dǎo)致雌性動物不孕、流產(chǎn)、死胎等[2]。研究顯示，低劑量的ZEN具有和雌激素相同的作用，兩者均能促進(jìn)卵泡發(fā)育，但ZEN可引起PCNA、Bcl-2及Bax基因高表達(dá)，致使ZEN誘導(dǎo)的卵泡常常表現(xiàn)異常發(fā)育狀態(tài)[3-5]。ZEN對牛、豬和小鼠卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂進(jìn)程具有抑制作用，會引起卵母細(xì)胞成熟延遲以及染色質(zhì)異常[6-8]。ZEN能夠增加小鼠胚胎的致死率[9]。近期的研究顯示，ZEN還能夠影響胚胎的植入過程[10]。

近年來，關(guān)于ZEN對哺乳動物產(chǎn)生毒性的作用機制研究也越來越多，用ZEN處理小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡形式主要是細(xì)胞凋亡[11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ZEN能夠通過多種途徑誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的凋亡，ZEN可以通過激活Fas-FasL信號通路誘導(dǎo)大鼠支持細(xì)胞凋亡，還可以通過干擾基因組的穩(wěn)定性促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡[12-13]。當(dāng)機體發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)且穩(wěn)態(tài)不能平衡時，細(xì)胞會激活內(nèi)在的凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。ERS通過以下通路介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡：1)PERK-ATF4-CHOP-Bcl-2-Bax通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；2)IRE1α-JNK-Bcl-2通路誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡；3)ATF6-CHOP-Bcl-2通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。先前的研究揭示了ZEN通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑調(diào)節(jié)大鼠睪丸支持細(xì)胞、TM4細(xì)胞以及牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡過程，表明ERS在ZEN引起的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用[16-18]。

雖然目前ZEN對動物生殖系統(tǒng)的影響已有很多報道，但是關(guān)于ZEN在母體子宮方面的報道仍不完善。子宮內(nèi)膜細(xì)胞在保護(hù)母體不受病原體侵害以及胚胎附植方面都發(fā)揮了積極的作用。因此，本試驗選用山羊ESCs作為試驗材料，探究ZEN誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)信號通路，為研究ZEN在雌性哺乳動物中引起生殖毒性的機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

玉米赤霉烯酮(Z2125)購自Sigma公司。胎牛血清(Z7186FBS-500)購自ZETA公司。RNA Trizol試劑(9109)購自TaKaRa公司。SYBR Green Master Mix定量試劑盒(Q311-02)購自諾唯贊公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG11705)購自艾科瑞公司。BCA蛋白含量檢測試劑盒(KGP902)和全蛋白提取試劑盒(KGP2100)以及細(xì)胞凋亡試劑盒(KGA1017)購自凱基生物公司。CCK-8試劑盒(C0037)購自碧云天公司。β-actin抗體(JC-PA001)購自晶彩生物。CHOP抗體(2895)購自美國CST公司。GRP78抗體(ab21685)和IRE1抗體(ab124945)購自Abcam公司。ECL發(fā)光液(32109)購自賽默飛世爾公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

永生化的山羊ESCs細(xì)胞系由本實驗室建立和保存[19]。將ESCs 細(xì)胞在37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)于 DMEM/F-12 培養(yǎng)基中(添加10%的胎牛血清)，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長融合度為80%～90%時進(jìn)行傳代。將ESCs以3×105個·孔-1的密度接種于六孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入0、10、20、30、40 μg·mL-1ZEN，處理24 h后，在倒置熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3 CCK-8

將傳代細(xì)胞消化后，用移液器重懸混勻，之后對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。ESCs以5×103個·孔-1的細(xì)胞密度接種在96孔板中，注意每個孔重復(fù)6次；培養(yǎng)24 h 后，用0、5、10、20、30、40、60 μg·mL-1的ZEN處理24 h，之后將CCK8以10 μL·孔-1的量加入到細(xì)胞中；37 ℃孵育1 h后，通過酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度值。2 μmol·L-14-PBA和10 μmol·L-1Irestatin9389 在ZEN處理前1 h加入。

1.4 細(xì)胞凋亡率檢測

用“1.2”中不同濃度的ZEN處理ESCs 24 h后，棄上清，并且用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化ESCs，輕輕吹打收集；ESCs懸液離心5 min，用冷的PBS洗滌兩次，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×104個·mL-1；將細(xì)胞重懸于50 μL結(jié)合緩沖液中，加入5 μL的7-AAD并將混合物在黑暗中靜置15 min；加入450 μL結(jié)合緩沖液和1 μL的Annexin V-PE并在黑暗中溫育15 min；在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 Real-time PCR

用“1.2”中不同濃度的ZEN處理山羊ESCs 24 h后，棄掉上清，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。cDNA合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。在Bio-Rad CFX96 PCR儀中使用SYBR Green Master Mix進(jìn)行Real-time PCR檢測。用 2-△△Ct法進(jìn)行mRNA定量。β-actin為內(nèi)參基因。引物序列詳見表1。

表1 Real-time PCR 引物序列

1.6 Western blot

用“1.2”中不同濃度的ZEN處理山羊ESCs 24 h 后，收集樣品。棄掉上清，用PBS清洗細(xì)胞兩次后，用細(xì)胞刷收集細(xì)胞，用1 mL的PBS洗滌、收集細(xì)胞；離心棄掉PBS后，加入蛋白裂解液，提取全蛋白，根據(jù)BCA試劑盒說明書來測定總蛋白的濃度；按照每個蛋白樣本30 μg加到凝膠電泳分離泳道中；然后，將目的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用10%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h；TBTS清洗膜之后，用β-actin(1∶5 000)、phosphoIRE1(1∶1 000)、GRP78(1∶1 000)、CHOP(1∶1 000)抗體分別4 ℃孵育過夜；TBST洗滌5次，5 min·次-1；在室溫下使其與辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗共同孵育1 h，TBST洗滌5次，5 min·次-1；最后，1∶1配制ECL發(fā)光液，均勻滴加到膜上，使用凝膠成像系統(tǒng)(Tannon Biotech)檢測。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有的試驗至少重復(fù)3次。應(yīng)用GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性t檢驗和單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計分析，得到的結(jié)果用“平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 ZEN對山羊ESCs增殖和凋亡的影響

如圖1所示，隨添加ZEN濃度的升高，山羊ESCs的細(xì)胞活力逐漸下降。與對照組(0 μg·mL-1ZEN)相比，添加10 μg·mL-1ZEN顯著地抑制了山羊ESCs細(xì)胞活力(P<0.05)，而20 μg·mL-1ZEN極顯著地抑制了山羊ESCs細(xì)胞活力(P<0.01)。當(dāng)ZEN濃度大于40 μg·mL-1時，60%以上的ESCs增殖受到抑制。FCM檢測結(jié)果同樣證實，隨ZEN濃度的增加，ESCs細(xì)胞凋亡率顯著上升(表2)。40 μg·mL-1ZEN處理山羊ESCs 24 h后，50%左右ESCs發(fā)生了凋亡。

表2 ZEN對山羊ESCs細(xì)胞凋亡的FCM檢測結(jié)果

相鄰字母表示差異顯著，P<0.05；相隔兩字母表示差異極顯著，P<0.01。下同

2.2 ZEN對山羊ESCs凋亡相關(guān)基因的影響

圖2顯示，隨著ZEN濃度的升高，Caspase-9、Caspase-8和Bax/Bcl-2的mRNA水平表達(dá)量逐漸增加。30和40 μg·mL-1ZEN組顯著上調(diào)了Caspase-9 mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。當(dāng)添加10 μg·mL-1ZEN時，Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)水平即顯著增加；而30和40 μg·mL-1ZEN極顯著上調(diào)了Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)水平(P<0.01)。與對照組相比，10～30 μg·mL-1ZEN對Caspase-8 mRNA水平無顯著上調(diào)作用；當(dāng)添加30 μg·mL-1ZEN時，Caspase-8 mRNA水平顯著增加(P<0.05)。

A.Caspase-9/β-actin; B.Caspase-8/β-actin; C.Bax/Bcl-2/β-actin

2.3 ZEN對ERS通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

如圖3所示，添加30和40 μg·mL-1ZEN處理山羊ESCs 24 h后，GRP78 mRNA的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。ZEN顯著上調(diào)了CHOPmRNA表達(dá)水平且呈劑量依賴性關(guān)系，10 μg·mL-1ZEN即顯著誘導(dǎo)了CHOPmRNA表達(dá)(P<0.05)，而40 μg·mL-1ZEN極顯著上調(diào)了CHOPmRNA表達(dá)水平(P<0.01)。當(dāng)ZEN濃度大于20 μg·mL-1時，ATF6 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。10～30 μg·mL-1ZEN對PERKmRNA表達(dá)水平無顯著上調(diào)作用；當(dāng)添加40 μg·mL-1ZEN時，PERKmRNA水平顯著增加(P<0.05)。而ZEN且呈劑量依賴性的顯著上調(diào)了IRE1 mRNA表達(dá)水平。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實，添加10 μg·mL-1ZEN顯著增加了GRP78、CHOP和phosphoIRE1α蛋白表達(dá)水平(圖4，P<0.05)。

A.GRP78/β-actin; B.CHOP/β-actin; C.ATF6/β-actin; D.PERK/β-actin; E.IRE/β-actin

A.Western blot; B.GRP78; C.CHOP; D.phosphoIRE1

2.4 ERS對ZEN誘導(dǎo)ESCs凋亡中的調(diào)節(jié)作用

為了進(jìn)一步分析ERS在ZEN引起的ESCs凋亡過程中的調(diào)控作用，首先采用ERS特異性抑制劑4-PBA和IRE1特異性抑制劑Irestatin9389預(yù)處理ESCs 1 h，添加30 μg·mL-1ZEN作用24 h后，CCK-8分析ESCs的增殖情況。圖5所示，添加4-PBA和Irestatin9389均顯著地挽救了ZEN對ESCs增殖的抑制作用(P<0.05)。

圖5 ERS特異性抑制劑對ZEN抑制ESCs增殖的調(diào)節(jié)作用

3 討 論

越來越多的研究表明，ZEN對雌性動物生殖系統(tǒng)具有顯著的毒性作用，ZEN可誘發(fā)斷奶小母豬子宮內(nèi)膜和肌層增厚、腺體數(shù)量增多，導(dǎo)致子宮形態(tài)發(fā)生改變[20]。ZEN還增加了大鼠患多囊卵巢綜合征的風(fēng)險[21]。還有研究證實，ZEN對小鼠的胎盤發(fā)育會產(chǎn)生不利的影響，還可導(dǎo)致胚胎早期附植失敗[22-23]。近期研究表明，ZEN可誘導(dǎo)不同時期小鼠子宮細(xì)胞發(fā)生凋亡，顯著上調(diào)凋亡關(guān)鍵基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9以及Bcl-2的表達(dá)[24]。ZEN可以通過激活JNK/Drp1途徑刺激線粒體裂變從而降低人ESCs的存活和遷移活性[25]。目前，有關(guān)ZEN對反芻動物生殖毒性的報道較少，本試驗通過分析ZEN對山羊ESCs增殖和凋亡的影響，以期為揭示ZEN對山羊胚胎附植和妊娠的生殖毒性作用奠定基礎(chǔ)。

現(xiàn)已證實，ZEN可通過引起細(xì)胞凋亡進(jìn)而引發(fā)生殖障礙。ZEN可通過激活JAK2/STAT3信號通路和抑制抗凋亡相關(guān)lncRNAs表達(dá)誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡[26-27]。ZEN能夠通過激活線粒體途徑誘導(dǎo)大鼠睪丸支持細(xì)胞發(fā)生凋亡[28]。本試驗發(fā)現(xiàn)，ZEN對山羊ESCs的毒性作用呈現(xiàn)劑量依賴性的關(guān)系并能顯著誘發(fā)山羊ESCs凋亡；同時，凋亡基因Caspase-8、Caspase-9和Bax/Bcl-2 mRNA水平均被顯著上調(diào)。

先前的研究發(fā)現(xiàn)，ZEN可以通過內(nèi)源性凋亡通路和線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26,29]。本實驗室前期研究表明，ZEN可以通過ERS通路誘導(dǎo)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡[30-31]。采用ERS抑制劑預(yù)處理細(xì)胞可顯著減輕ZEN誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞凋亡和自噬[32]。當(dāng)發(fā)生ERS時，機體會啟動一些反應(yīng)來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，當(dāng)ERS超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)修復(fù)能力時就會啟動細(xì)胞凋亡機制。本研究發(fā)現(xiàn)，ZEN可以顯著上調(diào)ERS標(biāo)志基因GRP78和CHOPmRNA和蛋白表達(dá)水平，并呈劑量依賴性。同時，ERS三條通路關(guān)鍵基因ATF6、PERK和IRE1的表達(dá)水平均顯著增加，尤其是IRE1通路上調(diào)最為顯著。添加ERS特異性抑制劑4-PBA以及IRE1特異性抑制劑Irestatin9389的結(jié)果進(jìn)一步表明，ZEN可以通過ERS通路誘導(dǎo)ESCs發(fā)生凋亡。另外，ZEN具有類雌激素的毒性，它可以和內(nèi)源性雌激素競爭性結(jié)合雌激素受體[33]。先前的研究表明，ZEN可以通過雌激素受體激活Wnt-1/β-catenin通路促進(jìn)卵巢的發(fā)育[4]。ZEN可以通過調(diào)節(jié)雌激素受體信號和核受體Nur77的表達(dá)來抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中睪酮的生物合成[34]。山羊ESCs細(xì)胞中存在雌激素受體，ZEN是否通過雌激素受體對山羊ESCs產(chǎn)生毒性作用需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

ZEN對山羊ESCs有顯著毒性作用，可劑量依賴性地抑制ESCs增殖和誘導(dǎo)ESCs凋亡；ZEN可以通過激活ERS通路誘導(dǎo)ESCs凋亡，且以IRE1通路最為顯著。