趙軍蒼

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

腦出血發(fā)病率占腦卒中的15%左右，30 d內(nèi)病死率約為50%，致殘率達(dá)90%，是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的疾病之一[1]。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腦出血發(fā)生后血液滲漏到外周腦組織，繼而出現(xiàn)血腦屏障通透性升高、炎癥活性氧自由基(ROS)蓄積、炎癥反應(yīng)等引發(fā)腦水腫，是導(dǎo)致繼發(fā)性腦組織損傷、影響腦出血患者預(yù)后的重要因素[2-3]。大蒜素是一種天然存在的具有抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性的二烯丙基三硫化物[4]，既往研究發(fā)現(xiàn)其能夠通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而對(duì)缺血性腦卒中后腦組織損傷起到保護(hù)作用[5-6]。但大蒜素對(duì)腦出血后腦組織損傷影響的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備腦出血大鼠模型，探討了大蒜素對(duì)腦出血大鼠腦組織的保護(hù)作用及其可能作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)病原微生物級(jí)成年雄性SD大鼠240只，體質(zhì)量(250±20)g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004。清潔環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周[光照∶黑暗12 h∶12 h，溫度(25±1)℃]后開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物與試劑 大蒜素注射液(黑龍江迪龍制藥有限公司，規(guī)格：2 mL∶30 mg，批號(hào)：1903016)；尼莫地平注射液(山東新華制藥股份有限公司，規(guī)格：10 mL∶2mg，批號(hào)：20190427)；伊文思藍(lán)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：W20181124)；超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20190324，20190130，20190407)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：181125，190317，190112)；兔抗鼠核因子-κB(NF-κB)、β-actin單克隆抗體(武漢博士得生物工程有限公司，批號(hào)：20190413，20190328)。

1.3分組、模型制備與干預(yù) 將所有大鼠進(jìn)行數(shù)字編碼，然后按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦出血組、大蒜素5 mg/(kg·d)組、大蒜素10 mg/(kg·d)組、大蒜素20 mg/(kg·d)組、尼莫地平2 mg/(kg·d)組，每組40只。參照文獻(xiàn)[7]方法制備腦出血大鼠模型：術(shù)前12 h禁食禁水，實(shí)施麻醉后，分離右側(cè)股動(dòng)脈并抽取60 μL血液備用；然后取俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀(BN-51700型，美國(guó)Stoelting公司)，沿頭皮正中切開(kāi)頭部皮膚，剝離骨膜并暴露前囟，于前囪前0.2 mm、中線(xiàn)右旁3.5 mm處鉆孔，然后通過(guò)微量注射器于深6 mm處(腦基底節(jié)區(qū))注射50 μL股動(dòng)脈血，注射速度為10 μL/min，注射完成15 min后拔針，無(wú)菌骨蠟封閉鉆孔后縫合皮膚；假手術(shù)組大鼠鉆孔后于深6 mm處注射50 μL 0.9%氯化鈉溶液，其余操作同腦出血組。造模完成后，大蒜素各組給予相應(yīng)濃度大蒜素注射液2 mL/kg腹腔注射，尼莫地平2 mg/(kg·d)組給予尼莫地平溶液2 mL/kg腹腔注射，假手術(shù)組和腦出血組給予0.9%氯化鈉溶液2 mL/kg腹腔注射，均1次/d，連續(xù)7 d。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1神經(jīng)功能缺損情況 各組隨機(jī)取10只大鼠，采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(mNSS)，由2名經(jīng)過(guò)相關(guān)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立進(jìn)行評(píng)分，得分越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.4.2血腦屏障通透性 參照文獻(xiàn)[8]方法，采用伊文思藍(lán)滲透法測(cè)定。各組取mNSS評(píng)分完成后的10只大鼠，經(jīng)尾靜脈注入濃度2%的伊文思藍(lán)溶液(4 mL/kg)，1 h后實(shí)施麻醉，經(jīng)左心室-右心耳通路快速灌注300 mL 0.9%氯化鈉溶液至流出液澄清，斷頭取腦，稱(chēng)量右半腦質(zhì)量后研磨勻漿(JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī)，常州金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠)，加入3倍量濃度50%的甲酰胺溶液，恒溫60 ℃孵育24 h后離心(TDL-5A型離心機(jī)，常州億能實(shí)驗(yàn)儀器廠，設(shè)置轉(zhuǎn)速3 000 r/min，時(shí)間10 min)取上清液，然后通過(guò)酶標(biāo)儀(MR-96A型，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測(cè)定610 nm波長(zhǎng)處吸光度值(OD值)，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定伊文思藍(lán)含量，可反映血腦屏障通透性。

1.4.3腦組織含水量 各組隨機(jī)取10只大鼠，實(shí)施麻醉后迅速斷頭取腦，切取右側(cè)大腦組織稱(chēng)質(zhì)量(W1)，置恒溫110 ℃烘烤箱24 h至恒重后稱(chēng)質(zhì)量(W2)，腦組織含水量(%)=(W1-W2)/W1×100%。

1.4.4腦組織病理學(xué)表現(xiàn) 各組隨機(jī)取10只大鼠，麻醉后開(kāi)胸、暴露心臟，經(jīng)左心室-右心耳通路快速灌注300 mL 0.9%氯化鈉溶液至流出液澄清，灌注4%多聚甲醛溶液實(shí)施組織固定，斷頭取腦，置4%多聚甲醛溶液繼續(xù)固定72 h，然后依次行石蠟包埋、切片(CUT 4050型，德國(guó)Leica公司)、梯度乙醇脫蠟后行HE染色，封片后通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡(IX71型，日本Olympus公司)觀察腦組織病理學(xué)改變。

1.4.5腦組織細(xì)胞凋亡情況 取1.4.4中制備的腦組織切片，經(jīng)梯度乙醇行脫蠟處理后，按照TUNEL試劑盒操作說(shuō)明依步處理，然后通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡(IX71型，日本Olympus公司)觀察，細(xì)胞核黃褐色為陽(yáng)性著色。凋亡指數(shù)計(jì)算：各組大鼠隨機(jī)取5張切片，每張切片隨機(jī)取8個(gè)互不重疊的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，取平均值，凋亡指數(shù)=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.4.6腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥細(xì)胞因子含量 取各組剩余10只大鼠，麻醉后迅速斷頭取腦，切取右側(cè)大腦組織，加入9倍量冷裂解液研磨勻漿(JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī)，常州金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠)，離心(Allegra 21R型低溫離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，時(shí)間10 min)取上清液，然后黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，高錳酸鉀滴定法測(cè)定CAT活性，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，通過(guò)酶標(biāo)儀(MR-96A型，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)按照各ELISA試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.4.7腦組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平 采用Western blot法測(cè)定。取1.4.6中制備的腦組織勻漿液，4 ℃低溫離心(Allegra 21R型低溫離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，時(shí)間15 min)取上清，按照總蛋白提取試劑盒操作提取蛋白并按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒操作測(cè)定總蛋白含量，然后依次行凝膠電泳(DYCZ-24DN型電泳儀，北京六一生物科技有限公司)、轉(zhuǎn)PVDF膜(DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀，北京六一生物科技有限公司)，經(jīng)5%脫脂奶粉恒37 ℃封閉1 h后，滴加兔抗鼠NF-κB、β-actin單抗后4 ℃孵育12 h，PBS溶液洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗，37 ℃振蕩孵育1 h，PBS洗膜后滴加ECL顯色發(fā)光獲得條帶；然后以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值半定量目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度、血腦屏障通透性、腦含水量比較 腦出血組大鼠mNSS評(píng)分、腦組織伊文思藍(lán)含量、腦組織含水量均顯著高于假手術(shù)組(P均<0.05)；大蒜素5 mg/(kg·d)組mNSS評(píng)分顯著低于腦出血組(P<0.05)，腦組織伊文思藍(lán)含量、腦組織含水量與腦出血組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；大蒜素10 mg/(kg·d)組、大蒜素20 mg/(kg·d)組和尼莫地平2 mg/(kg·d)組mNSS評(píng)分、腦組織伊文思藍(lán)含量、腦組織含水量均顯著低于腦出血組(P均<0.05)，且大蒜素20 mg/(kg·d)組mNSS評(píng)分、腦組織伊文思藍(lán)含量均顯著低于尼莫地平2 mg/(kg·d)組(P均<0.05)，腦組織含水量與尼莫地平2 mg/(kg·d)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠腦組織病理學(xué)表現(xiàn) 假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則有序；腦出血組腦組織明顯水腫，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、間隙增大，排列無(wú)序，胞體皺縮，胞核固縮；大蒜素各組和尼莫地平2 mg/(kg·d)組腦組織病理學(xué)改變較腦出血組明顯減輕，以大蒜素20 mg/(kg·d)組減輕最為顯著。見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、血腦屏障通透性和腦組織含水量比較

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)HE染色表現(xiàn)(×200)

2.3各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況比較 鏡下觀察，假手術(shù)組大鼠腦組織僅可見(jiàn)極少量凋亡細(xì)胞，腦出血組血腫周?chē)X組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，大蒜素各組和尼莫地平2 mg/(kg·d)組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，以大蒜素20 mg/(kg·d)組減少最為顯著，見(jiàn)圖2。假手術(shù)組、腦出血組、大蒜素5 mg/(kg·d)組、大蒜素10 mg/(kg·d)組、大蒜素20 mg/(kg·d)組、尼莫地平2 mg/(kg·d)組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(3.41±0.63)%、(47.25±6.09)%、(41.67±5.34)%、(32.81±4.76)%、(22.63±4.08)%、(27.59±4.22)%，腦出血組顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，大蒜素各組和尼莫地平2 mg/(kg·d)組均顯著低于腦出血組(P均<0.05)，且大蒜素20 mg/(kg·d)組顯著低于尼莫地平2 mg/(kg·d)組(P<0.05)。

2.4各組大鼠腦組織中SOD、CAT活性和MDA含量比較 腦出血組SOD、CAT活性顯著低于假手術(shù)組(P均<0.05),MDA含量顯著高于假手術(shù)組(P均<0.05)；大蒜素10 mg/(kg·d)組、大蒜素20 mg/(kg·d)組和尼莫地平2 mg/(kg·d)組SOD、CAT活性顯著高于腦出血組(P均<0.05),MDA含量顯著低于腦出血組(P均<0.05)；且大蒜素20 mg/(kg·d)組SOD活性顯著高于尼莫地平2 mg/(kg·d)組(P<0.05),MDA含量顯著低于尼莫地平2 mg/(kg·d)組(P<0.05)，2組間CAT活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

圖2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×200)

表2 各組大鼠腦組織中SOD、CAT活性和MDA含量比較

2.5各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 腦出血組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著高于假手術(shù)組(P均<0.05)；大蒜素10 mg/(kg·d)組、大蒜素20 mg/(kg·d)組和尼莫地平2 mg/(kg·d)組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著低于腦出血組(P均<0.05)；大蒜素20 mg/(kg·d)組TNF-α含量顯著低于尼莫地平2 mg/(kg·d)組(P<0.05)，2組間IL-1β、IL-6含量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3。

2.6各組大鼠腦組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 假手術(shù)組、腦出血組、大蒜素5 mg/(kg·d)組、大蒜素10 mg/(kg·d)組、大蒜素20 mg/(kg·d)組、尼莫地平2 mg/(kg·d)組NF-κB蛋白表達(dá)水平分別為0.21±0.04，1.15±0.13，1.04±0.12，0.92±0.10，0.36±0.07，0.45±0.08。腦出血組NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，大蒜素10mg/(kg·d)組、大蒜素20mg/(kg·d)組、尼莫地平2mg/(kg·d)組均顯著低于腦出血組(P均<0.05)，且大蒜素20 mg/(kg·d)組顯著低于尼莫地平2mg/(kg·d)組(P<0.05)。

表3 各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較

見(jiàn)圖3。

A為假手術(shù)組；B為腦出血組；C為大蒜素5 mg/(kg·d)組；D為大蒜素10 mg/(kg·d)組；E為大蒜素20 mg/(kg·d)組；F為尼莫地平2 mg/(kg·d)組圖3 各組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達(dá)情況

3 討 論

腦出血發(fā)生后，腦組織血氧供應(yīng)不足導(dǎo)致ROS大量生成、炎癥細(xì)胞因子釋放而引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，細(xì)胞凋亡，破壞血腦屏障并繼發(fā)腦組織水腫[9-12]，在多種病理通路作用下致使腦組織細(xì)胞不可逆性損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損、致殘甚至致死。所以，減輕出血早期腦組織損傷對(duì)于降低病死率、改善預(yù)后具有重要意義。

百合科蔥屬植物大蒜不僅可做日常食材，其鱗莖可入藥，性溫、味辛甘，具有消腫止痛、解毒殺蟲(chóng)之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素是大蒜的主要有效成分，具有良好的抗炎抗氧化[4]、抑制缺血組織細(xì)胞凋亡[13]等生物活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)自體血注射法制備腦出血大鼠模型并造模成功后立即腹腔注射大蒜素進(jìn)行干預(yù)，研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)7 d后腦出血大鼠mNSS評(píng)分明顯降低，腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)病變減輕，提示大蒜素對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能和腦組織結(jié)構(gòu)均具有保護(hù)作用。

生理狀態(tài)下伊文思藍(lán)在血管內(nèi)與蛋白結(jié)合，只有血腦屏障結(jié)構(gòu)受損通透性升高后伊文思藍(lán)才能夠通過(guò)血腦屏障而進(jìn)入腦組織，所以腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)含量能夠反映血腦屏障通透性狀態(tài)。血腦屏障通透性升高是血管源性腦水腫的主要原因，而腦組織水腫是腦出血后致殘、致死的重要病理基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血大鼠血腦屏障通透性和腦組織含水量明顯升高，與顧云鶴等[14]研究報(bào)道一致；經(jīng)大蒜素干預(yù)7 d后，腦出血大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量、腦組織含水量均明顯降低，提示大蒜素具有降低腦出血大鼠血腦屏障通透性、抑制腦組織水腫的作用。

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在腦出血病理進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。腦出血后，腦供血供氧不足導(dǎo)致線(xiàn)粒體呼吸鏈?zhǔn)茏瓒纱罅康腞OS，以ROS為底物的抗氧化還原酶SOD、CAT過(guò)度消耗，導(dǎo)致ROS代謝失衡而過(guò)剩，ROS攻擊脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等大分子，其終產(chǎn)物為MDA；此外，ROS可攻擊細(xì)胞膜而破壞細(xì)胞骨架，破壞構(gòu)成血腦屏障的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)緊密連接蛋白復(fù)合體(TJPs)，從而破壞血腦屏障完整性[15]；ROS還能夠激活NF-κB而使凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡能夠?qū)е陆M織損傷進(jìn)一步加重，抑制細(xì)胞凋亡能夠挽救瀕死細(xì)胞而減輕腦出血損傷[16]。另外炎癥反應(yīng)貫穿于腦出血損傷的各個(gè)階段，腦出血后病理性刺激炎癥細(xì)胞因子大量釋放，其中TNF-α、IL-1β是觸發(fā)機(jī)體炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要介質(zhì)[17]，二者作為趨化因子能夠進(jìn)一步促進(jìn)自身及IL-6表達(dá)上調(diào)[18]；此外，TNF-α、IL-1β、IL-6能夠直接破壞TJPs結(jié)構(gòu)，激活NF-κB而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)上調(diào)，與內(nèi)皮細(xì)胞黏附而增加血腦屏障通透性[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素干預(yù)7 d后，腦出血大鼠腦組織SOD、CAT活性明顯升高，MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示大蒜素具有抑制腦出血大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用，并間接說(shuō)明大蒜素具有保護(hù)腦出血大鼠血腦屏障的作用。

綜上所述，大蒜素對(duì)腦出血大鼠腦組織損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡、降低血腦屏障通透性有關(guān)。

利益沖突：作者聲明不存在利益沖突。