田青右，朱園飛，常豪，于琳，鄧強(qiáng)

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系, 教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一類有包膜的小型DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科[1]。成熟的HBV含有約3.2 kb的松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)，負(fù)鏈DNA 5′端共價(jià)連接病毒多聚酶(polymerase，Pol)。在病毒感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，rcDNA修復(fù)為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)，是HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制的原始模板[2-4]。以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄的前基因組RNA(pregenomic RNA, pgRNA)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞漿被核衣殼包裹，通過Pol反轉(zhuǎn)錄生成負(fù)鏈DNA，并合成不完全的正鏈DNA；部分雙鏈rcDNA通過成熟的核衣殼顆粒再次轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，完成HBV的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制周期[5]。另一方面, HBV核衣殼顆粒通過內(nèi)體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體機(jī)制，經(jīng)由內(nèi)體多泡體結(jié)構(gòu)完成包膜化和出芽。HBV已知的天然宿主僅限于人和黑猩猩，鈉牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(sodium taurcholate cotransport peptide, NTCP)被證明是HBV高親和力受體[6-8]，這極大地促進(jìn)了研究者對(duì)HBV從頭感染的研究。然而，HBV/NTCP感染體系依賴較高的感染復(fù)數(shù)，病毒感染和擴(kuò)增效率較低，病毒粒子表面抗原與受體結(jié)合后的細(xì)胞進(jìn)入機(jī)制仍需要深入研究。

重組病毒復(fù)制子通常在病毒基因組或亞基因組中插入外源報(bào)告基因，使其能夠支持重組病毒進(jìn)行功能性復(fù)制，具有可檢測(cè)性和量化特征，如在丙型肝炎病毒、新型冠狀病毒[9-13]RNA復(fù)制子中引入熒光素酶或熒光蛋白表達(dá)基因等，是病毒學(xué)體外研究的重要工具。值得注意的是，HBV 3.2 kb基因組高度壓縮，4個(gè)主要閱讀框相互重疊，每一個(gè)堿基都具有編碼功能和潛在的順式調(diào)控功能，因此HBV基因組難以容納外源基因，構(gòu)建重組復(fù)制子具有較大的挑戰(zhàn)性。Hong等[14]應(yīng)用包膜蛋白缺陷的HBV高復(fù)制突變株，在病毒Pol spacer編碼區(qū)插入紅色熒光蛋白(red fluorescent protein, RFP)基因，能夠支持HBV重組病毒(recombinant HBV, rHBV)的復(fù)制；Bai等[15]基于上述突變株系統(tǒng)重新設(shè)計(jì)rHBV復(fù)制子，將外源報(bào)告基因插入HBV核心蛋白(HBV core, HBc)編碼區(qū)，通過反式互補(bǔ)HBc拯救重組病毒復(fù)制。盡管如此，受限于大片段插入導(dǎo)致的低復(fù)制效率，上述系統(tǒng)并未能獲得廣泛應(yīng)用。

內(nèi)含肽(intein)可分割為氮端(IntN)和碳端(IntC)結(jié)構(gòu)域[16-18]，應(yīng)用IntN、IntC分別融合綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)氮端(GFPN)和碳端(GFPC)分裂蛋白，通過IntN和IntC高親和力相互作用、催化自身移除，介導(dǎo)GFP分裂蛋白基于肽鍵的共價(jià)連接。

鑒于此，本研究基于HBV ayw3通用基因組序列，刪除HBc第23～136氨基酸(amino acid, aa)編碼區(qū)，構(gòu)建復(fù)制缺陷的ΔHBc113載體。由于插入序列容量限制，選取intein融合的GFP作為報(bào)告基因產(chǎn)物。依據(jù)11個(gè)β-片層組成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，將增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced GFP, EGFP)分割成EGFPN1-8(aa 1～173)和EGFPC9-11(aa 174～232)；或?qū)⒊郫B綠色熒光蛋白(super folder GFP, sfGFP)拆分為sfGFPN1-10(aa 1～214)和sfGFPC11(aa 215～230)。應(yīng)用IntC融合EGFPC或sfGFPC，將其序列插入ΔHBc113載體，在HBc反式互補(bǔ)條件下實(shí)現(xiàn)重組病毒rHBV的復(fù)制，IntC-GFPC表達(dá)產(chǎn)物則能夠與共表達(dá)的IntN-GFPN高效拼接，產(chǎn)生功能性熒光蛋白。期望這一可視化的模型系統(tǒng)能為HBV高通量藥物篩選提供實(shí)驗(yàn)工具，也有助于對(duì)HBV受體和受體后病毒學(xué)特征的進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系293T細(xì)胞系、HepG2細(xì)胞系由本課題組保存。

1.1.2 質(zhì)粒pCDNA3.1、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus, CMV)-HBV1.1(由CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的1.1拷貝的HBV基因組)、pCDH-CMV-MCS-EF1-puro(由CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)、帶有多克隆位點(diǎn)和篩選標(biāo)記Puro的慢病毒載體)、pCDH-EGFP、pCDH-sfGFP均由本課題組保存。pCDNA3.1-IntC-EGFPC9-11(可表達(dá)intein碳端和EGFP碳端的融合蛋白)、pCDNA3.1-EGFPN1-8-IntN(可表達(dá)EGFP氮端和intein氮端的融合蛋白)、pCDNA3.1-IntC-sfGFPC11(可表達(dá)intein碳端和sfGFP碳端的融合蛋白)、pCDNA3.1-sfGFPN1-10-IntN(可表達(dá)sfGFP氮端和intein氮端的融合蛋白)均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.1.3 儀器和試劑主要儀器有聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀(Eppendorf公司)、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司)、熒光倒置顯微鏡(Nikon公司)、pH計(jì)(上海天達(dá)儀器有限公司)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDocXRS+(Bio-Rad公司)。主要試劑有PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa公司)、Seamless Cloning試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、凝膠DNA小量回收試劑盒(美基生物有限公司)、EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(上海李記生物科技有限公司)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)、胎牛血清(Gibco公司)、Trypsin-EDTA(Gibco公司)。所用的引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建以pCMV-HBV1.1(HBV ayw3，GenBank N°V01460)為模板，ΔHBc113-F和ΔHBc113-R為引物進(jìn)行PCR，利用Seamless Cloning試劑盒，將PCR產(chǎn)物無縫連接在pCMV-HBV1.1載體NdeⅠ和BspEⅠ酶切位點(diǎn)之間，獲得HBV1.1-ΔHBc113質(zhì)粒。

通過基因合成獲得念珠藻類(NostocpunctiformePCC73102, Npu)intein編碼序列。應(yīng)用常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得IntC-EGFPC9-11、EGFPN1-8-IntN、IntC-sfGFPC11以及sfGFPN1-10-IntN融合蛋白編碼DNA，分別克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)。以相應(yīng)質(zhì)粒為模板，應(yīng)用IntC-EGFPC9-11-F和IntC-EGFPC9-11-R，或IntC-sfGFPC11-F和IntC-sfGFPC11-R為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物連接在HBV1.1-ΔHBc113載體NdeⅠ和BspEⅠ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建質(zhì)粒分別命名為ΔHBc113/EGFPC9-11和ΔHBc113/sfGFPC11。以EGFPN1-8-IntN-F和EGFPN1-8-IntN-R，或sfGFPN1-10-IntN-F和sfGFPN1-10-IntN-R為引物，分別擴(kuò)增EGFPN1-8-IntN和sfGFPN1-10-IntN融合蛋白編碼序列，將PCR產(chǎn)物克隆至pCDH-puro載體EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)間，構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒pCDH-EGFPN1-8-IntN和pCDH-sfGFPN1-10-IntN。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染將HepG2和293T細(xì)胞置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素)。將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HepG2或293T細(xì)胞接種到六孔板中，24 h后細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。將質(zhì)粒按每孔3 μg總量加至125 μL DMEM無血清培養(yǎng)基中，另外將9 μL EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑加至125 μL DMEM無血清培養(yǎng)基中，充分混勻DNA溶液和轉(zhuǎn)染試劑溶液，靜置20 min。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，換入2 mL新鮮無血清DMEM培養(yǎng)基。將質(zhì)粒脂質(zhì)體混合液加入細(xì)胞中，輕輕混勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6～8 h后，棄掉培養(yǎng)液，加入新鮮含血清DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 熒光信號(hào)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)HepG2和293T細(xì)胞經(jīng)EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入2 mL新鮮的含血清DMEM培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光信號(hào)，拍照記錄結(jié)果。

1.2.4 提取HBc顆粒內(nèi)DNAHepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒3～4 d后，棄上清，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗2次。六孔板每孔加入400 μL裂解液，在37 ℃培養(yǎng)箱放置 30 min。將裂解液 14 000g(下同)離心5 min，棄沉淀物，收集上清液，加入4 μL 1 mol/L MgCl2和8 μL 10 mg/mL DNase Ⅰ，37 ℃水浴消化30 min。然后用100 μL 35% PEG 8 000 沉淀病毒顆粒，4 ℃過夜放置，離心10 min，沉淀用100 μL DNase Ⅰ溶液重懸，37 ℃水浴消化30 min。用蛋白酶K消化去除病毒核衣殼，37 ℃水浴消化過夜。用等體積的苯酚抽提1次，振蕩后離心10 min，取上清水相，加入 2 μL 20 mg/mL糖原、十分之一體積3 mol/L醋酸鈉(pH 5.2)溶液和等體積的異丙醇，混勻后置于 -20 ℃沉淀過夜，離心15 min棄上清，沉淀用75%乙醇洗2次并盡棄乙醇，靜置待乙醇揮發(fā)，用20 μL去離子水溶解，-80 ℃保存。

1.2.5 提取細(xì)胞上清HBc顆粒內(nèi)DNAHepG2細(xì)胞經(jīng)EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，收集培養(yǎng)上清液， 2 000g離心5 min，去除細(xì)胞碎片，用孔徑0.45 μm的濾膜過濾。加入PEG 8 000 溶液至終濃度7%，4 ℃放置過夜。取濃縮后的400 μL上清液，重復(fù) 1.2.4 步驟，提取HBc顆粒內(nèi)DNA。

1.2.6 DNA印跡法(Southern blotting)檢測(cè)rHBV載體的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制能力配制160 mL 1%瓊脂糖凝膠，加入抽提的HBV胞內(nèi)和上清DNA樣品， 80 V電泳 3 h。電泳結(jié)束后，將凝膠用變性液洗2次，每次 15 min，用去離子水潤洗后，再用中性液中和2次，每次15 min。將凝膠再次用去離子水清洗后，放入20×SSC浸泡。將尼龍膜、濾紙完全浸濕，按照吸水紙、濾紙、尼龍膜、凝膠、濾紙由下至上的順序進(jìn)行搭橋過夜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出尼龍膜，用2×SSC浸泡5 min，再置于2張濾紙之間，于80 ℃烘烤2 h。尼龍膜放入雜交管，用10 mL預(yù)雜交液浸潤，在雜交爐42 ℃預(yù)雜交30 min。倒出預(yù)雜交液，將預(yù)熱好的探針放入雜交管中，42 ℃旋轉(zhuǎn)過夜孵育?；厥仗结?，尼龍膜用10 mL高鹽溶液常溫洗2次，每次15 min，接著用預(yù)熱的68 ℃低鹽溶液洗2次，每次15 min。洗液潤洗尼龍膜2 min后用吸水紙吸干，加入封閉液室溫孵育30 min，再用anti-DIG antibody溶液室溫孵育30 min。洗液室溫潤洗尼龍膜3次，每次10 min。先用顯色液室溫平衡膜2～5 min，加入CSPD顯色液避光常溫孵育5 min后，用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀器檢測(cè)，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 基于HBV1.1-ΔHBc113載體的重組病毒復(fù)制子的構(gòu)建

基于HBV ayw基因型通用序列，設(shè)計(jì)構(gòu)建HBc缺失的HBV復(fù)制子載體HBV1.1-ΔHBc113(圖1A)。在HBc表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染條件下，HBV1.1-ΔHBc113載體顯示出良好的HBV DNA細(xì)胞內(nèi)復(fù)制信號(hào)(圖1B)。由于HBV1.1-ΔHBc113載體HBc部分序列被刪除，所以與野生型相比，HBV1.1-ΔHBc113復(fù)制子形成的rcDNA和雙鏈線性DNA(double-stranded linear DNA, dslDNA)條帶更靠前?；谏鲜鲚d體進(jìn)一步構(gòu)建攜帶外源報(bào)告基因的重組復(fù)制子(圖1C)，由獨(dú)立的ATG位點(diǎn)翻譯起始外源基因的表達(dá)，3′端則設(shè)計(jì)T2A斷裂肽引導(dǎo)HBV Pol蛋白的表達(dá)。然而，引入全長(zhǎng)GFP、RFP以及熒光素酶等報(bào)告基因，都未能有效支持重組病毒復(fù)制。

A: Schematic representation of HBV1.1 replicon and ΔHBc113 mutant. B: Southern blotting of HBV intracellular replication. ΔHBc113 vector was transfected with or without pCMV-HBc in HepG2 cells. HBV1.1 replicon was served as a positive control. C: Schematic diagram of rHBV construct bearing a reporter gene. The foreign gene is initiated from an optimized Kozak signal. An in-frame T2A coding sequence is designed to facilitate HBV Pol gene expression.

2.2 EGFPC9-11/EGFPN1-8分裂肽在intein作用下形成完整GFP

Intein分割為IntC和IntN， IntC和IntN側(cè)翼分別融合GFPN和GFPC分裂蛋白，通過IntN和IntC高親和力相互作用、催化自身移除，介導(dǎo)GFP分裂蛋白基于肽鍵的共價(jià)連接(圖2A)。首先將EGFP分成aa 1～173(EGFPN1-8)和aa 174～232(EGFPC9-11)兩部分(圖2A)，基于pCDNA3.1和pCDH-puro質(zhì)粒，設(shè)計(jì)構(gòu)建EGFPC9-11-IntC和EGFPN1-8-IntN真核表達(dá)載體。結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)的293T細(xì)胞中，單獨(dú)轉(zhuǎn)染EGFPC9-11-IntC或EGFPN1-8-IntN質(zhì)粒未能觀察到綠色熒光；當(dāng)共轉(zhuǎn)染2個(gè)互補(bǔ)質(zhì)粒時(shí)，則能夠觀察到顯著的綠色熒光信號(hào)，但弱于完整EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(圖2B)。在缺乏intein基序融合時(shí)，EGFPC9-11/EGFPN1-8表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，同樣能夠誘導(dǎo)GFP產(chǎn)生，但熒光強(qiáng)度顯著減弱(圖2C)。

A: Schematic diagram of split-GFP through intein trans-splicing pathway and consecutive β-strand numbering was shown in the EGFP structure diagram. Arrow indicates the split site (between aa 173 and 174). B: 293T cells transfected with pcDNA3.1/pCDNA3.1-IntC-EGFPC9-11, pcDNA3.1/pCDH-EGFPN1-8-IntN, or pCDNA3.1-IntC-EGFPC9-11/pCDH-EGFPN1-8-IntN, respectively. pCDH-EGFP was served as control. Scale bars, 400 μm (the same below). C: Green fluorescence signals reduced greatly in split-EGFPN1-8/C9-11 system in the absence of intein-mediated splicing.

2.3 sfGFPC11/sfGFPN1-10分裂肽在intein作用下形成完整GFP

為獲得較短的GFP碳端分裂肽，本研究嘗試應(yīng)用sfGFP，即所謂精良折疊版本的GFP(其對(duì)融合蛋白結(jié)構(gòu)具有更好的耐受性)。將sfGFP拆分為aa 1～214(sfGFPN1-10，214 aa)和aa 215～230(sfGFPC11，16 aa)(圖3A)，共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示sfGFPC11-IntC與sfGFPN1-10-IntN具有良好的匹配，能夠誘導(dǎo)高效拼接并產(chǎn)生高亮度熒光蛋白(圖3B)。同樣，sfGFPC11-IntC與sfGFPN1-10-IntN質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染均不能產(chǎn)生熒光信號(hào)，sfGFPC11/sfGFPN1-10的拼接效率顯著弱于sfGFPC11-IntC/sfGFPN1-10-IntN(數(shù)據(jù)未展示)。

A: Schematic representation of split-sfGFP system. B: 293T cells transfected with pcDNA3.1/pCDNA3.1-IntC-sfGFPC11, pcDNA3.1/pCDH-sfGFPN1-10-IntN, or pCDNA3.1-IntC-sfGFPC11/pCDH-sfGFPN1-10-IntN, respectively. pCDH-sfGFP was served as control. Scale bars, 400 μm.

2.4 編碼GFP分裂肽的重組ΔHBc113載體能夠在HBc互補(bǔ)條件下有效復(fù)制

將IntC-EGFPC9-11或IntC-sfGFPC11編碼序列分別插入ΔHBc113載體，基于圖1 C構(gòu)建ΔHBc113/EGFPC9-11和ΔHBc113/sfGFPC11兩種rHBV復(fù)制子。如圖4A所示，在肝腫瘤細(xì)胞來源的HepG2細(xì)胞中，應(yīng)用兩種rHBV復(fù)制子載體與相應(yīng)的EGFPN1-8-IntN或sfGFPN1-10-IntN表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，觀察到了熒光，證明成功誘導(dǎo)了功能性GFP的拼接。

在HepG2轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，應(yīng)用Southern blotting驗(yàn)證兩種rHBV載體的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制能力。如圖4B所示，單獨(dú)轉(zhuǎn)染ΔHBc113/EGFPC9-11或ΔHBc113/sfGFPC11質(zhì)粒均不能誘導(dǎo)重組病毒細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。在共轉(zhuǎn)染HBc表達(dá)質(zhì)粒的條件下，ΔHBc113/EGFPC9-11僅顯示非常弱的病毒DNA復(fù)制中間體信號(hào)，外源基因較短的ΔHBc113/sfGFPC11病毒復(fù)制信號(hào)則顯著增加，但仍弱于ΔHBc113空載體。進(jìn)一步用酶切方式驗(yàn)證重組病毒復(fù)制中間體，如圖4B所示，由于rcDNA部分雙鏈序列中含有EcoRⅠ限制酶切位點(diǎn)，酶切處理后形成3.2 kb (電泳位置)的線性DNA，提示ΔHBc113/sfGFPC11載體具有可靠的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制能力。

將ΔHBc113/sfGFPC11和pCMV-HBc共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，通過PEG 8000沉淀、濃縮培養(yǎng)細(xì)胞上清。將pCMV-HBV1.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清作為陽性對(duì)照，單獨(dú)轉(zhuǎn)染ΔHBc113/sfGFPC11載體作為陰性對(duì)照，Southern blotting證實(shí)ΔHBc113/sfGFPC11重組復(fù)制子能夠在HBc回補(bǔ)條件下產(chǎn)生子代病毒粒子(圖4C)。

A: Fluorescence analysis of HepG2 cells co-transfected with ΔHBc113/EGFPC9-11 or ΔHBc113/sfGFPC11, and their counterpart plasmids as indicated, respectively. Scale bars, 400 μm. B: Southern blotting of HepG2 cells transfected with ΔHBc113/EGFPC9-11or ΔHBc113/sfGFPC11, with or without pCMV-HBc co-transfection. rHBV DNA intermediates were validated by EcoR Ⅰ digestion. C: HepG2 cells were transfected with indicated plasmids. Virions concentrated from cell culture supernatants were subjected to Southern blotting.

3 討論

本研究實(shí)際包含兩個(gè)層次的蛋白分裂系統(tǒng)，即GFP分裂系統(tǒng)和intein分裂系統(tǒng)?；贕FP突變衍生的EGFP和sfGFP由11個(gè)圍繞中心α-螺旋的反平行β-折疊組成，可應(yīng)用于分裂蛋白的研究[19, 22]。GFPN和GFPC依賴內(nèi)在相互作用，非共價(jià)結(jié)合形成功能性GFP復(fù)合物，使得GFP分割位置有較大限制，嚴(yán)格依賴兩端分裂肽的構(gòu)象可塑性和親和力。我們依據(jù)GFP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的11個(gè)β-片層結(jié)構(gòu)，嘗試了多種分割方案，GFPC9-11是其中最短的碳端分裂肽(數(shù)據(jù)未展示)。Zhao等[9]最近應(yīng)用intein系統(tǒng)，獲得IntN和IntC之間高親和力連接EGFP分裂肽(N1-7/C8-11, aa 1～157/aa 158～238)，顯示了高效的拼接效率，且拼接后intein可自身移除。參考上述研究，本研究將intein分裂系統(tǒng)引入EGFPN1-8/C9-11，證實(shí)其能夠顯著增加EGFP分裂蛋白的拼接效率。進(jìn)一步嘗試應(yīng)用intein策略分割EGFPN1-10/C11，但并未獲成功，推測(cè)與EGFPN1-10構(gòu)象可塑性較弱有關(guān)。因此，本研究嘗試應(yīng)用具有改良折疊構(gòu)象的sfGFP，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)sfGFPN1-10/C11分裂肽能夠互補(bǔ)形成功能性熒光蛋白，但效率較低，與早先報(bào)道一致[19, 20, 23]。非常有意思的是，引入intein分裂系統(tǒng)顯著增加了sfGFPN1-10/C11分裂肽的功能性拼接(圖3B)，推測(cè)sfGFPN1-10/C11分裂肽具有較好的構(gòu)象可塑性，能夠穩(wěn)定表達(dá)，融合intein分裂肽則能顯著增加它們之間的親和力。

HBV 3.2 kb基因組高度壓縮，每一個(gè)堿基都具有病毒蛋白編碼功能以及可能的順式調(diào)控功能，后者涉及HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、負(fù)鏈DNA合成中的蛋白引物轉(zhuǎn)位以及rcDNA形成過程中正鏈DNA的延伸和轉(zhuǎn)位等。另一方面，HBc富含精氨酸的碳端結(jié)構(gòu)域精確調(diào)控病毒RNA基因組的包裝，過長(zhǎng)的病毒基因組則易造成核衣殼不穩(wěn)定[24-25]。rHBV復(fù)制子通常依賴反向遺傳學(xué)策略，刪除已知的、非順式調(diào)控區(qū)的部分序列，并插入大小合適的外源報(bào)告基因，刪除的基因可通過反式互補(bǔ)而拯救重組病毒復(fù)制。本研究在HBV RNA加尾信號(hào)下游刪除約339 bp的HBc蛋白編碼序列，構(gòu)建了HBV1.1-ΔHBc113載體。ΔHBc113載體實(shí)際上代表了一種HBc缺陷的病毒基因組，由于大片段缺失(339 bp)，病毒Pol編碼基因閱讀框向5′端大幅前移，更加接近轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。該載體在HBc互補(bǔ)條件下，能夠在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中形成高效的病毒DNA復(fù)制(圖1B)。在ΔHBc113載體中插入可用的報(bào)告基因則復(fù)雜得多，本研究首先在病毒Pol基因上游融合T2A編碼序列，使得Pol與上游外源基因融合，通過斷裂肽獲得獨(dú)立表達(dá)。盡管如此，大片段插入完整的熒光素酶或GFP序列使得ΔHBc113融合載體完全失去復(fù)制能力。有意思的是，當(dāng)插入小片段(約<360 bp)GFP部分編碼序列，Southern blotting顯示明顯的單鏈DNA(single-stranded DNA, ssRNA)形成(數(shù)據(jù)未展示)。這些結(jié)果提示，外源基因容量是rHBV細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的重要限制因素。

本研究利用intein/GFP分裂系統(tǒng)尋求功能性的GFP分裂短肽，以構(gòu)建可視化的rHBV復(fù)制子。結(jié)果表明，ΔHBc113/sfGFPC11攜帶的外源序列僅編碼IntC(39 aa)融合的sfGFPC11(16 aa)以及下游的T2A(21 aa)，在HBc互補(bǔ)條件下能支持細(xì)胞內(nèi)重組病毒的功能性復(fù)制(ssRNA + rcDNA)，并產(chǎn)生子代病毒粒子(圖4)。應(yīng)該指出的是，ΔHBc113/sfGFPC11熒光強(qiáng)度弱于野生病毒復(fù)制子，故仍有較大的改進(jìn)空間。綜上所述，本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種GFPC分裂蛋白融合的rHBV復(fù)制子，能夠在共表達(dá)HBc以及GFPN的細(xì)胞中建立病毒復(fù)制，并產(chǎn)生功能性熒光蛋白。未來的工作將基于ΔHBc113/sfGFPC11子代病毒粒子從頭感染sfGFPN1-10表達(dá)細(xì)胞，建立HBV可視化細(xì)胞培養(yǎng)模型，期望可用于進(jìn)一步深入研究HBV復(fù)制機(jī)制以及抗病毒藥物篩選。