韋棟，陳詠妍，時國朝，張欣欣，王穎

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科臨床病毒研究室, 上海 200025； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院呼吸科, 上海 200025； 3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海免疫學(xué)研究所, 上海 200025

呼吸道病毒長期以來一直是呼吸道感染的主要致病原之一，其傳播給全球公共衛(wèi)生防治工作造成了巨大的負(fù)擔(dān)。近年來隨著病原體診斷技術(shù)的提高，越來越多的證據(jù)表明呼吸道病毒已經(jīng)成為社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)的最主要致病原之一[1]。由于呼吸道病毒感染所涉及的病毒種類繁多，其致病機(jī)制各不相同，所以目前臨床上缺乏使用呼吸道病毒感染的宿主標(biāo)志物作為輔助診斷的手段。近年來，大量研究證明部分干擾素刺激應(yīng)答基因的表達(dá)水平可能與病毒性感染高度相關(guān)[2-3]。干擾素刺激基因(stimulated gene, ISG)15是干擾素刺激應(yīng)答基因的一員。目前有許多證據(jù)表明ISG15與病毒感染，特別是以流感為首的呼吸道病毒感染引起的免疫防御的機(jī)制密切相關(guān)[4-6]。ISG15可在I型干擾素(interferon-I，IFN-I)刺激下被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)[7]，大量研究已經(jīng)證實(shí)ISG15可以介導(dǎo)多種抗病毒反應(yīng)，在固有免疫及干擾素調(diào)節(jié)通路中發(fā)揮重要作用[8]。ISG15可以通過結(jié)合病毒蛋白來干擾病毒蛋白功能，進(jìn)一步影響病毒的復(fù)制能力[9]；同時，ISG15也可以通過抑制病毒顆粒的釋放來干擾病毒感染[10]；除了直接影響病毒復(fù)制外，ISG15還可以通過發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用調(diào)節(jié)病毒感染期間宿主的損傷和修復(fù)反應(yīng)，間接影響病毒復(fù)制及造成的損傷，從而發(fā)揮抗病毒作用[11-14]。由于ISG15已經(jīng)被證明具有廣譜抗病毒作用，可以影響包括人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒、埃博拉病毒和肝炎病毒等多種病毒的復(fù)制，因此它在宿主感染過程中的表達(dá)變化可能具有重要的臨床價值[15]。

本研究同時收集了病毒性CAP和細(xì)菌性CAP住院患者臨床數(shù)據(jù)及外周血樣本，通過實(shí)時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR)對不同病原CAP患者的外周血ISG15 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，并在體外通過病毒刺激外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)進(jìn)行驗證。探究ISG15同CAP發(fā)病機(jī)制及疾病活動性之間的可能聯(lián)系，為臨床進(jìn)一步尋找呼吸道病毒感染的特異性宿主標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2018年11月至2019年6月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院收治的社區(qū)獲得性肺炎住院患者157例，其中呼吸道病毒感染133例，細(xì)菌性感染24例，無細(xì)菌、病毒共感染患者，同時在健康體檢人群中選取40例作為健康人對照。全部患者診斷均符合中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有入組患者入院時主訴均為近3～5 d內(nèi)出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，且無其他醫(yī)院就診經(jīng)歷，入院后均采集鼻、咽拭子進(jìn)行呼吸道病毒核酸檢測及痰液細(xì)菌培養(yǎng)以明確病原學(xué)診斷。研究入組人員標(biāo)準(zhǔn)包括：發(fā)熱、咳嗽、咳痰、伴或不伴胸痛；白細(xì)胞計數(shù)>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴核左移；胸部X線檢查或計算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)檢查顯示片狀、斑片狀浸潤陰影或間質(zhì)性改變，伴或不伴胸腔積液。所有入組患者均無腫瘤病史。相關(guān)研究通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會審核(倫理審批：2018-48)。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及ISG15 mRNA全長序列為模板設(shè)計引物。ISG15 mRNA 上游引物序列5′-ACCTGACGGT-GAAGATGCTG-3′，下游引物序列5′-TCCTCAC-CAGGATGCTCAGA-3′，產(chǎn)物長度252 bp。內(nèi)參GAPDHmRNA上游引物序列5′-CGGAGTC-AACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物序列5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′，產(chǎn)物長度307 bp。全部引物均由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。

1.2.2 外周血收集及總RNA提取取患者及健康人乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝血1.5 mL，分裝后-80 ℃保存，采用TRIzol試劑(天根生化科技有限公司)進(jìn)行后續(xù)的總RNA提取。將200 μL外周血樣本與600 μL TRIzol試劑充分混合，室溫靜置5 min。加入120 μL氯仿，振蕩混勻后室溫放置3 min，4 ℃ 13 400×g離心15 min，取上層水相層轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積異丙醇后混勻，室溫靜置 10 min。4 ℃ 13 400×g離心10 min，棄去上清液后加入 600 μL 75%乙醇洗滌。4 ℃ 12 000×g離心5 min，完全棄去液體。置室溫空氣中干燥后加入60 μL去RNA酶水，充分溶解RNA。使用Nanodrop 2000超微量分光光度計(Thermo Fisher公司，美國)進(jìn)行RNA定量，同時檢測其A260/A280比值，當(dāng)RNA濃度≥10 ng/μL，A260/A280比值≥2時方可進(jìn)行后續(xù)real-time RT-PCR并分析。

1.2.3 實(shí)時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)采用HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾維贊生物科技有限公司)檢測提取合格的RNA中的目的基因表達(dá)，反應(yīng)體系如下：2×One Step SYBR Green Mix 10 μL，One Step SYBR Green Enzyme Mix 1 μL, 上下游引物各1 μL，RNA模板2 μL，加去RNA酶水補(bǔ)齊至總體積 20 μL。采用Light Cycler熒光定量核酸擴(kuò)增儀(Roche公司，瑞士)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：50 ℃ 15 min(逆轉(zhuǎn)錄)，95 ℃預(yù)變性 5 min，(95 ℃ 15 s，60 ℃退火30 s)×40個循環(huán)。ISG15 mRNA的表達(dá)水平按照ΔRn值[2-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)]進(jìn)行計算獲得。

1.2.4 PBMC分離及體外感染實(shí)驗所使用PBMC來自3位健康志愿者。采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離抗凝全血，獲得的PBMCs經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次后，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。待細(xì)胞濃度達(dá)到6×105/mL，分別使用感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為0.2、0.02及0.002的甲型流感病毒H1N1病毒株及人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)病毒株(HRV-A)進(jìn)行感染，于37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后進(jìn)行real-time RT-PCR檢測病毒載量和PBMCs中ISG15 mRNA表達(dá)水平，每組條件設(shè)3孔平行試驗。病毒載量檢測使用羅氏TIB公司呼吸道病毒系列檢測試劑盒(Roche公司，瑞士)，并嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組樣本間比較使用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，對ISG15 mRNA的ΔRn值與白細(xì)胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗，P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。受試者操作特征 (receiver operator characteristic，ROC) 曲線根據(jù)陽性率(sensitivity)和假陽性比例 (1-specificity)進(jìn)行繪制，曲線下面積(area under ROC curve，AUC)值根據(jù)95% 可信區(qū)間計算獲得。

2 結(jié)果

2.1 患者基本特征

共收集了157例CAP住院患者(CAP組)外周血樣本及40例健康人(健康對照組)外周血樣本。157例患者中呼吸道病毒感染患者133例，細(xì)菌性感染患者24例。呼吸道病毒感染中甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)32例， HRV 23例，呼吸道合胞病毒(respiratory syncy-tial virus, RSV)28例，人偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)15例，副流感病毒3型(parainfluenza virus 3, PIV3)14例，冠狀病毒(coronavirus, CoV)21例。24例細(xì)菌性感染患者痰液樣本經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)后均為陽性，其中肺炎克雷伯菌13例、流感嗜血桿菌6例、肺炎鏈球菌4例、鮑曼不動桿菌1例，全部細(xì)菌性感染患者均排除院內(nèi)感染可能。男性118例(CAP組94例，健康對照組24例)，女性79例(CAP組63例，健康對照組16例)，年齡分布為62.2±21.6歲。CAP組內(nèi)各類病原體感染者性別和年齡構(gòu)成均無顯著性差異。進(jìn)一步比較呼吸道病毒感染與細(xì)菌性感染患者的各項臨床特征，包括年齡、性別、白細(xì)胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白及降鈣素原水平差異，結(jié)果提示呼吸道病毒感染與細(xì)菌性感染患者在年齡、性別方面均無顯著性差異，白細(xì)胞計數(shù)與降鈣素原水平差異較大，但C反應(yīng)蛋白差異并不明顯。具體情況見表1。

表1 呼吸道病毒感染患者與細(xì)菌性感染患者臨床特征比較

2.2 不同致病原CAP患者的外周血ISG15 mRNA表達(dá)水平分析

采用real-time RT-PCR測定CAP組不同致病原患者外周血中ISG15 mRNA的表達(dá)水平，與健康對照組相比，ISG15 mRNA在呼吸道病毒感染組中平均表達(dá)水平顯著增高，不論是同健康對照組相比或是同細(xì)菌感染組相比均有顯著差異(見圖1A)；而細(xì)菌感染組外周血中ISG15 mRNA的水平顯著低于病毒感染組，與健康對照組相比差異并不明顯(圖1B)，提示不同病原體感染可以導(dǎo)致外周血ISG15 mRNA的差異性改變。

進(jìn)一步將各類呼吸道病毒感染患者進(jìn)行分組，對其ISG15 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IAV、RSV、MPV及PIV3感染組患者外周血ISG15 mRNA表達(dá)水平較健康對照組顯著增高，其中IAV組與RSV組表達(dá)水平增高最為顯著(見圖1C—1F)，而HRV及CoV感染患者ISG15 mRNA表達(dá)水平與健康對照組相比無顯著差異(見圖1G—1H)。

A: Respiratory virus infection group and healthy control group. B: Respiratory virus infection group and bacterial infection group. C—H: In order as follows: influenza A virus infection group (IAV), respiratory syncytial virus infection group (RSV), parainfluenza virus infection group (PIV), human metapneumovirus infection group (MPV), human rhinovirus infection group (HRV), coronavirus infection group (CoV). The different ISG15 mRNA expression levels in peripheral blood of patients with different respiratory infections compared with healthy control. *** P< 0.005

2.3 外周血ISG15 mRNA水平在呼吸道病毒感染診斷中的價值

分別對成人CAP患者中呼吸道病毒感染與細(xì)菌性感染、呼吸道感染與健康對照組的外周血ISG15 mRNA進(jìn)行ROC曲線繪制。結(jié)果顯示外周血ISG15 mRNA用于區(qū)分CAP組患者呼吸道病毒感染的ROC曲線下面積可達(dá)73%(P=0.002，見圖2A)，而包括健康對照組在內(nèi)的全部人群中，外周血ISG15 mRNA診斷呼吸道病毒感染的ROC曲線下面積可達(dá)到77.5%(P=0.03，見圖2B)。上述結(jié)果表明，外周血ISG15 mRNA在成人CAP患者呼吸道病毒感染與細(xì)菌性感染的鑒別診斷中具有較好的潛在應(yīng)用價值。

2.4 外周血ISG15 mRNA水平在病毒性感染不同階段的動態(tài)表達(dá)特征

為了進(jìn)一步研究外周血ISG15 mRNA表達(dá)在呼吸道病毒感染期間是否會隨宿主病程變化而發(fā)生改變，選取12例IAV患者、8例RSV患者、5例MPV患者及3例PIV3患者，分別收集其入院時、入院3 d及治愈出院時3個時間點(diǎn)的外周血樣本，對其外周血ISG15 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行動態(tài)檢測。結(jié)果顯示，呼吸道病毒感染患者在感染早期至恢復(fù)期間，外周血中ISG15 mRNA表達(dá)水平變化較為恒定，至患者出院時，其外周血ISG15 mRNA表達(dá)依舊維持在較高水平(見圖3)。這提示CAP患者發(fā)病后，其外周血ISG15 mRNA表達(dá)將在相當(dāng)長的時間內(nèi)維持高水平，包括患者痊愈后。

A: Influenza A virus infection. B: Respiratory syncytial virus infection. C: Human metapneumovirus infection. D: Parainfluenza virus infection.

2.5 PBMCs經(jīng)體外刺激后病毒載量與ISG15 mRNA表達(dá)水平的變化趨勢

基于臨床患者在不同呼吸道病毒感染后外周血ISG15 mRNA表達(dá)水平并不一致，其中IAV、RSV、PIV3及MPV感染后ISG15 mRNA表達(dá)顯著高于HRV及CoV感染，因此分別選擇IAV及HRV為代表，在體外感染PBMCs后觀察病毒載量和ISG15 mRNA表達(dá)水平的變化情況。使用不同MOI(0.2，0.02與0.002)的IAV H1N1亞型病毒株及HRV-A型病毒株感染來自健康志愿者的PBMCs，分別在感染后12 h、24 h、48 h與72 h時檢測病毒RNA載量及ISG15 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明，IAV感染PBMCs后，PBMCs中的ISG15 mRNA表達(dá)水平與IAV病毒復(fù)制水平呈正相關(guān)(見圖4A—4B)，該結(jié)果與臨床數(shù)據(jù)一致。但用HRV感染細(xì)胞時，高M(jìn)OI(0.2與0.02)HRV-A毒株感染PBMCs后其ISG15 mRNA表達(dá)水平可隨HRV RNA復(fù)制水平增高而輕度增高，但在低MOI(0.002)HRV-A毒株感染細(xì)胞后，ISG15 mRNA表達(dá)水平并未出現(xiàn)明顯增高(圖4C—4D)。

A: Influenza A virus RNA replication. B: ISG15 mRNA expression in PBMCs after infected by IAV. C: Rhinovirus (HRV) RNA replication. D: ISG15 mRNA expression in PBMCs after infected by rhinovirus

3 討論

本研究探究了不同病原體感染情況下CAP患者外周血ISG15 mRNA的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌性和病毒性CAP患者之間其外周血ISG15 mRNA表達(dá)差異顯著，這表明外周血ISG15 mRNA可能具有作為部分病毒性感染特異性標(biāo)志物的潛在應(yīng)用價值。進(jìn)一步分析結(jié)果表明，部分RNA病毒(IAV、RSV、MPV及PIV3)感染與外周血ISG15 mRNA表達(dá)水平相關(guān)性更高，而細(xì)菌性感染患者及健康人群外周血中ISG15 mRNA表達(dá)基本不發(fā)生變化，提示至少在部分病毒所導(dǎo)致的成人CAP感染中，外周血中ISG15 mRNA表達(dá)水平可特異性增高，ROC曲線分析也證明檢測外周血ISG15 mRNA表達(dá)水平對于呼吸道病毒感染具有相當(dāng)高的診斷效率。這一結(jié)果也與ISG15在既往研究中所表現(xiàn)出的廣譜抗病毒作用相吻合，與部分國際研究結(jié)果一致，同時也證實(shí)了病毒性感染和細(xì)菌性感染所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的特征是不同的[16]。病毒感染可導(dǎo)致免疫細(xì)胞分泌大量IFN-Ⅰ，進(jìn)而誘導(dǎo)ISG基因表達(dá)，從而在患者免疫細(xì)胞中可檢測到大量ISG基因表達(dá)上調(diào)；而細(xì)菌感染主要誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生，所以外周血免疫細(xì)胞中上調(diào)的基因表達(dá)譜與病毒感染的不同。因此在CAP患者中可利用此不同類型的基因應(yīng)答譜，制訂臨床上病原體鑒別診斷的新策略。這也進(jìn)一步證明ISG15的作用及調(diào)控機(jī)制同病毒感染高度相關(guān)[17]。

然而，通過對臨床數(shù)據(jù)的研究，發(fā)現(xiàn)HRV與CoV感染患者外周血ISG15 mRNA表達(dá)水平無顯著變化。本研究中所涉及的6種病毒均為RNA病毒，其中流感病毒分屬正黏病毒科，副流感病毒、呼吸道合胞病毒及偏肺病毒均屬副黏病毒科，而鼻病毒與冠狀病毒分屬小RNA病毒科及冠狀病毒科。外周血中ISG15 mRNA在不同病毒感染之間的表達(dá)差異可能是由于各類病毒種屬間差異所導(dǎo)致的宿主免疫識別機(jī)制的差異所造成。雖然本研究未測定這些病毒感染后IFN以及其他細(xì)胞因子的表達(dá)水平是否存在差異，但是不能排除ISG15 mRNA的表達(dá)在不同病毒感染下的調(diào)控機(jī)制存在差異。有研究表明胞內(nèi)ISG15不僅作為干擾素的應(yīng)答基因參與抗病毒應(yīng)答，同時也是負(fù)反饋調(diào)控干擾素表達(dá)的重要機(jī)制之一，它可以通過USP18促進(jìn)I型干擾素信號通路的衰減，從而避免應(yīng)答過強(qiáng)[8]。本研究中HRV與CoV在臨床感染患者外周血中表現(xiàn)出的低水平ISG15 mRNA表達(dá)可能與此兩種病毒感染對IFN通路的低刺激所導(dǎo)致的較弱的負(fù)反饋表現(xiàn)有關(guān)，但該假設(shè)需要進(jìn)一步的體外實(shí)驗數(shù)據(jù)支持。值得注意的是，在體外感染PBMCs模型中，ISG15 mRNA表達(dá)水平在高M(jìn)OI的HRV感染情況下同樣增高，這一結(jié)果與之前的臨床數(shù)據(jù)并不完全一致，但在低MOI刺激下，PBMCs的ISG15表達(dá)確實(shí)無明顯變化。此外，近期有研究同樣發(fā)現(xiàn)，在新型冠狀病毒感染患者的漿細(xì)胞中ISG15 mRNA表達(dá)水平同樣發(fā)生了顯著上調(diào)[18]。由于HRV與CoV在臨床上的致病性顯著低于其他4種病毒，因此，我們推測造成臨床HRV與CoV感染患者外周血中ISG15 mRNA表達(dá)水平無顯著變化的原因也可能與其感染后的致病情況相關(guān)：呼吸道病毒感染后所造成的宿主損傷越嚴(yán)重，免疫反應(yīng)越強(qiáng)烈，其ISG15表達(dá)水平的上調(diào)便越顯著。

本研究還探討了外周血中ISG15 mRNA表達(dá)是否會隨患者的病程變化而動態(tài)波動。通過對不同時間點(diǎn)CAP住院患者外周血ISG15 mRNA的檢測發(fā)現(xiàn)，患者感染初期ISG15 mRNA表達(dá)升高后便會持續(xù)性地維持在較高水平，直至患者治愈出院時也未見回落。上述結(jié)果也表明宿主免疫系統(tǒng)一旦感知外源性病毒感染后，可以維持相當(dāng)一段時間的免疫應(yīng)答水平特征。其中的機(jī)制包括轉(zhuǎn)錄水平的改變，還有可能通過表觀遺傳學(xué)或是代謝調(diào)控維持相關(guān)基因的開放，從而維持應(yīng)答基因的水平[7]。

近年來，大量研究闡明了ISG15在急性和潛伏性感染中的抗病毒機(jī)制，這進(jìn)一步提高了人們對ISG15在病毒感染中如何發(fā)揮免疫防御功能的理解，包括描述ISG15如何改變疾病發(fā)病機(jī)制，限制組織損傷和調(diào)節(jié)IFN-I信號通路的能力[19-21]。此外，最近對ISG15缺失患者的研究以及隨后對ISG15調(diào)控IFN-I信號的總結(jié)，揭示了這一途徑的復(fù)雜性，提示需要重新評估ISG15在抗病毒過程中的作用[8, 22-23]。本研究結(jié)果表明，外周血ISG15 mRNA高水平表達(dá)與呼吸道病毒感染相關(guān)，在呼吸道病毒和細(xì)菌所誘導(dǎo)的CAP的鑒別診斷中具有潛在的應(yīng)用價值；結(jié)合ISG15在病毒性感染患者中的表達(dá)特征，可為了解ISG15的抗病毒機(jī)制，深入解析ISG15及其他ISG家族蛋白在抗病毒免疫調(diào)節(jié)中的作用提供重要線索；也為呼吸道病毒感染的臨床診療提供了新的思路。