車巧林，胡 芳，沈曉紅，董彥鵬，靳蒙蒙

（江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司，江蘇 江陰 214400）

豬肺炎支原體（mycoplasma hyopneumoniae）可引起豬地方流行性肺炎，俗稱氣喘病。該病以咳嗽和氣喘為主要臨診癥狀，不同年齡豬群均易感染[1]，剖檢變化為肺的尖葉、心葉和隔葉呈對稱性的蝦肉樣病變。豬肺炎支原體感染導致豬的生長受阻，飼料轉化率降低，機體免疫能力降低，導致免疫抑制[2]。

豬肺炎支原體的抗原主要由蛋白質與脂質組成，其中蛋白是產(chǎn)生免疫反應的主要免疫原之一[3]。P46是豬肺炎支原體的細胞膜表面抗原蛋白，可引起宿主早期免疫應答反應。P46在種內保守性高。熊焰等[4]對MY99株進行連讀的人工傳代后，發(fā)現(xiàn)P46仍然具有很好的穩(wěn)定性和免疫原性。P46蛋白與豬鼻支原體、豬滑液支原體和豬絮狀支原體等病原體之間無交叉反應，且能在豬肺炎支原體感染后兩周內檢測到相應的抗體[5]。因此，P46常常被用在診斷試劑的開發(fā)研究中。Bouh等[6]利用p46蛋白制備的單克隆抗體建立用于檢測豬肺炎支原體的ELISA方法，該方法具有良好的特異性和敏感性。本研究應用P46單抗作為“探針”抗體先建立豬肺炎支原體不同CCU含量的蛋白免疫印跡（Western blot，WB）圖譜，然后測定不同批次的豬肺炎支原體抗原CCU含量，并與WB圖譜測定的CCU進行比較，以建立一種豬肺炎支原體抗原含量快速測定的方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

豬肺炎支原體HN0613株由江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司鑒定和保存。

1.2 試劑及儀器

Friis基礎液、Friis培養(yǎng)基由江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司自制；2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA）購自Sigma Aldrich公司；無水硫代硫酸鈉購自Alfa Aesar公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、5×上樣緩沖液購自碧云天公司；預染Marker、顯色底物液購自THERMO公司；麗春紅購自Sigma公司；HRP-羊抗鼠IgG購自武漢博士德公司。

MiniPROTEANTetra Cell電泳儀、VE-186轉印儀購自Bio-Rad公司；5200化學發(fā)光儀購自Tanon公司；5810 R高速離心機購自Eppendorf公司；JN-02C高壓均質破碎儀購自廣州聚能JNBIO公司；硝酸纖維素膜（NC膜）購自GE Healthcare公司。

1.3 豬肺炎支原體菌液的制備

豬肺炎支原體HN0613株F6代凍干菌種用2 mL Friis培養(yǎng)基溶解，以10%比例接種于含20 mL Friis培養(yǎng)基的100 mL鹽水瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)至pH值6.7～6.8時收獲。收獲的菌液以5%比例接種傳代2次，120 r/min、37℃恒溫振蕩培養(yǎng)，pH值降至6.7～6.8時收獲，收獲菌液進行純粹檢驗及CCU測定。

1.4 豬肺炎支原體抗原含量CCU測定

將待檢菌液用Friis液體培養(yǎng)基作10倍系列稀釋，即0.2 mL待檢菌液加入裝有1.8 mL Friis液體培養(yǎng)基的西林瓶中混勻，連續(xù)稀釋成10-1至10-12，并設培養(yǎng)基對照，每個待檢樣品的各稀釋度分別做2個重復。37 ℃培養(yǎng)2周，每日觀察培養(yǎng)基顏色變化，在培養(yǎng)基對照顏色不變的條件下，記錄待檢稀釋菌液顏色變黃的最高稀釋度，取2個重復的平均值為CCU滴度。

1.5 不同CCU含量的豬肺炎支原體抗原蛋白免疫印跡

1.5.1 豬肺炎支原體抗原蛋白處理

豬肺炎支原體抗原300 mL（可以是活抗原，也可以是滅活抗原）10 000 r/min、4 ℃離心1 h，棄上清，用1/15 mol/L、pH值7.2的PBS重懸沉淀，10 000 r/min、4 ℃離心1 h，棄上清，用30 mL、1/15 mol/L、pH值7.2的PBS重懸沉淀。重懸抗原用高壓均質破碎儀在1 000 W功率下連續(xù)破碎2～3次至破碎液澄清透亮，破碎液10 000 r/min離心15 min，取上清備用。根據(jù)CCU測定結果將10倍濃縮的抗原蛋白分別稀釋為1×1010、5×109、1×109、5×108、1×108、5×107、1×107、1×106CCU/mL。

1.5.2 SDS-PAGE

采用垂直板型不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)，分離膠為10%，濃縮膠為5%制備2塊凝膠。取100 μL不同CCU滴度的抗原蛋白，加入25 μL 5×上樣緩沖液，混勻，沸水煮10 min，25 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液進行SDS-PAGE。電壓調至90 V，電泳25 min，待蛋白條帶跑至分離膠時，將電壓調至120 V直至電泳結束。取一塊凝膠進行考馬斯亮藍R250染色檢測，另一塊凝膠不染色進行轉膜。

1.5.3 轉印

將未染色的凝膠、裁減好的NC膜夾于濾紙之間，按照負極-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-正極的順序放入裝有電轉液的電泳槽，200 mA恒流轉印80 min。轉印結束后，放入麗春紅染色液中染色1～2 min，用鉛筆標記出泳道和Marker條帶大小，PBS洗去麗春紅染液。

1.5.4 Western blot

NC膜清洗干凈后，放入5%脫脂乳PBS中4 ℃過夜封閉，TBST洗滌2次，5 min/次。加入1∶1 000稀釋的豬肺炎支原體P46單抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌5次，再加入1∶2 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，化學發(fā)光試劑盒顯色10～60 s，化學發(fā)光儀顯影0.1～10 s，拍照。

1.6 豬肺炎支原體抗原滅活前后Western blot對比

100 mL豬肺炎支原體菌液經(jīng)終濃度0.4 mmol/L的BEI滅活24 h，10 mmol/L硫代硫酸鈉終止1 h，滅活檢驗合格后，滅活菌液和未滅活菌液高速離心后，沉淀用1/15 mol/L、pH值7.2的PBS洗滌1次，然后用原體積量的PBS重懸，高壓均質破碎后離心取上清備用。滅活菌液、未滅活菌液和 1×108、5×108、1×109、5×109CCU/mL的豬肺炎支原體標準抗原蛋白同時進行Western blot分析。

1.7 豬肺炎支原體抗原CCU測定與Western blot測定的比較

50、100和500 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的多批次豬肺炎支原體抗原用CCU法和Western blot法分別測定CCU。為減少誤差，CCU法測定時每批次抗原測定4個重復，最后取4個重復的平均值為最終CCU；Western blot法測定CCU時根據(jù)標準蛋白對應的CCU進行判定。

2 結果與分析

2.1 不同CCU含量的豬肺炎支原體抗原蛋白免疫印跡

豬肺炎支原體抗原含量測定結果為109CCU/mL。菌液經(jīng)10倍濃縮、洗滌、高壓均質破碎，用PBS稀釋為不同CCU含量的豬肺炎支原體抗原蛋白，經(jīng)SDSPAGE分離后，5×109CCU/mL以上的抗原蛋白在電泳圖譜上可以顯示出條帶，約11條帶，相對分子質量范圍在15～130 kD，電泳圖譜見圖1。

不同CCU含量的豬肺炎支原體抗原蛋白免疫印跡圖譜見圖2。由圖2可知，曝光3 s，5×107CCU/mL含量以上的抗原在46 kD處有條帶，且條帶粗細、明暗程度隨著CCU含量的增高而增高；107CCU/mL的抗原蛋白顯示不出條帶，說明抗原含量太低，免疫印跡檢測不到。

2.2 豬肺炎支原體抗原滅活前后Western blot對比（見圖3）

由圖3可知，在46 kD處均有一條帶。這兩條帶粗細一樣，且與109CCU/mL的豬肺炎支原體標準抗原蛋白條帶粗細一樣，說明Western blot可用于測定豬肺炎支原體滅活抗原的含量，且不受滅活劑BEI的影響。

2.3 豬肺炎支原體抗原含量CCU測定與Western blot測定結果的比較（見表1、圖4）

由表1可知，7批抗原中有3批抗原（50L-009、100L-009、500L-009）2種方法測定的CCU結果一致；2批抗原（100L-007、500L-007）測定的CCU結果基本吻合；2批抗原（100L-010、500L-010）測定的CCU結果有差異，但差值在1.5～5.0倍，可能是由于培養(yǎng)時間長導致的。CCU法測定的是活菌的含量，WB法測定的是包括活菌和死菌在內所有菌的含量，因此如果豬肺炎支原體培養(yǎng)時間過長，導致部分支原體死亡，WB法測定的抗原含量要比CCU法測定的結果高。

表1 豬肺炎支原體抗原含量CCU法和WB法測定結果的比較Tab.1 Comparison of the results of CCU method and WB method for the content of M. hyopneumoniae antigen

3 討論

支原體抗原含量測定通常采用顏色改變單位法（color change unite，CCU）或菌落形成單位（colonyforming units，CFU），由于支原體的培養(yǎng)條件要求相比細菌要嚴格得多，大部分種類在固體培養(yǎng)基上很難形成典型菌落。即便形成菌落，菌落也很微小，難于統(tǒng)計，因此CCU成為最常用的支原體活菌滴度測定指標。半數(shù)變色單位CCU50測定方法可以提高支原體含量測定的準確性。該方法最早由Masover等[7]使用，但描述非常簡略。隨后Robertson等[8]對該方法的具體稀釋進行詳細描述，之后Robertson等[9]和Stemke等[10]使用人型支原體和解脲支原體對CFU和CCU50的測定結果與核酸濃度進行相關性比較，發(fā)現(xiàn)CCU50與核酸濃度相關性更好。沈青春等[11]在Masover等使用的CCU50基礎上，借鑒病毒滴度TCID50的標準測定方法，將其改進后用于支原體的活菌滴度測定，重復性良好，具有較強的敏感性和適用性。CCU和CCU50法測定周期長，容易受到培養(yǎng)基、器皿潔凈度、操作中人為因素的影響。因此，出現(xiàn)利用活細胞含有一定量ATP，死亡細胞ATP很快分解消失的特性測定的ATP熒光法。Stemke等[10]通過熒光素酶-熒光素方法測定細胞中ATP的含量，實現(xiàn)對豬肺炎支原體和絮狀支原體活菌數(shù)的快速測定。Calus等[12]利用ATP熒光法測定豬肺炎支原體培養(yǎng)物的活菌數(shù)，并用其繪制生長曲線。ATP熒光技術具有快速、方便的特點，但對樣品處理、檢測儀器精度和穩(wěn)定性等有較高要求，使應用受到一定限制。上述方法只能檢測培養(yǎng)收獲的活支原體的含量，不能準確反映經(jīng)后續(xù)工藝處理后疫苗中支原體抗原的實際含量，因此更適合活疫苗產(chǎn)品的質量評價。

近年來先后出現(xiàn)紫外測定法和PCR法等快速測定支原體培養(yǎng)物菌體滴度的方法。紫外檢測法具有簡單、快速、精確的特點，是一種較多用于微生物大規(guī)模培養(yǎng)中對培養(yǎng)物菌數(shù)進行測定的方法。該方法的缺陷是測定的結果培養(yǎng)物中所有的核酸濃度，包括死亡和老化，若有污染，還包括污染微生物的核酸，甚至包括培養(yǎng)物中添加物的核酸成分[11]。豬肺炎支原體培養(yǎng)基成分中含有核酸，因此該紫外檢測法不適用于豬肺炎支原體的測定[11]。PCR法雖具有快速、特異性強、重復性好的特點，但是模板提取很關鍵。豬肺炎支原體由于個體小，且培養(yǎng)困難，培養(yǎng)菌液按照常規(guī)的核酸提取方法不能保證每次提取成功，且PCR中容易出現(xiàn)假陽性和假陰性現(xiàn)象，因此該方法用于豬肺炎支原體滅活疫苗抗原含量的測定也具有一定的缺陷性。

蛋白質印跡（Western blot）是生物學領域最重要的支撐技術之一，在蛋白質以及蛋白質組學研究中有廣泛的應用，主要借助抗體的特異性調查蛋白質的表達豐度特征[13]。該技術的原理是樣品總蛋白經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）被分離，再將SDSPAGE膠上的蛋白質信號轉移到固體支持膜（目前常用的是NC膜或PVDF膜）上，然后使目標蛋白質與其特異性一抗抗體（稱為“探針”抗體）在膜上結合，形成目的蛋白與一抗的復合物，再與標記的能識別特異性抗體的種屬特異性抗體（酶標二抗）結合，加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發(fā)光，檢測有無特異性蛋白條帶出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小進行特異性蛋白的半定量。Burnette等[14]采用此方法對抗體和放射性碘標記的蛋白A進行檢測，并將該方法稱為 Western blot。熊仁平等[15]探究免疫印跡法在測定蛋白質含量方面的應用，建立一項用蛋白免疫印跡法測定鳥苷酸結合蛋白（G蛋白）含量的技術。目的蛋白的上樣量是蛋白免疫印跡半定量在藥理研究中的主要影響因素。在能獲得條帶質量較好的前提下，改變上樣體積和抗體孵育時間、適當稀釋抗體和發(fā)光液濃度不但不影響試驗結果，反而有利于試驗[16]?？梢?，控制好樣品上樣量可以通過蛋白免疫印跡對目的蛋白進行半定量測定。

本研究通過制備不同CCU含量的豬肺炎支原體抗原蛋白，然后進行Western blot，建立豬肺炎支原體抗原CCU含量與抗原蛋白含量免疫印跡圖譜之間的關系，之后對車間生產(chǎn)的抗原用CCU測定法和免疫印跡法同時測定抗原含量，兩種方法測定的結果誤差在5倍以內。因此，可以將免疫印跡方法作為滅活疫苗抗原生產(chǎn)質量控制的補充因素。免疫印跡法與CCU測定法相比，具有一定的優(yōu)越性：第一，豬肺炎支原體抗原含量檢測周期縮短12 d；第二，如果CCU檢測結果出現(xiàn)誤差需要重檢時，樣品可能因為保存時間過長（超過10 d）活菌數(shù)大大下降、無法重檢；而免疫印跡法樣品已經(jīng)處理為蛋白，相對活菌來說，蛋白的保存時間明顯延長，因而可以重檢。另外，如果需要測定更精確的豬肺炎支原體抗原含量，可以在免疫印跡圖譜建立時降低標準抗原蛋白稀釋間隔獲得更精準含量的蛋白圖譜。

4 結論

蛋白質免疫印跡分析可用于豬肺炎支原體抗原含量的快速測定。