史雪坤，王慧青，苗天姿，高 樂，張東遠，汪恩強*

（1．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2．中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，天津 300308；3．中科康源（唐山）生物技術(shù)有限公司，河北 唐山 063000）

大腸桿菌引起的雞輸卵管炎導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋率嚴重下降和種雞散發(fā)性死亡。雞輸卵管炎病因復(fù)雜，易反復(fù)發(fā)作，慢性表現(xiàn)為輸卵管膨脹、管壁變薄、有干酪樣滲出物，對蛋雞飼養(yǎng)業(yè)的危害較大[1]。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌和中藥對雞源大腸桿菌有一定的抑菌效果。

益生菌分為芽孢桿菌類、酵母菌類和乳酸菌3大類。常用的益生菌有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸乳球菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌和凝結(jié)芽孢桿菌等[2]。益生菌具有增強消化能力、減少應(yīng)激、增強機體免疫力和預(yù)防疾病等功能[3]。益生菌能產(chǎn)生抑菌作用的一部分原因是細菌在新陳代謝中產(chǎn)生具有拮抗作用的多肽類物質(zhì)，一般為抗菌肽[4]。

中藥抗菌副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性[5]。中草藥的抑菌機制主要通過影響蛋白合成過程和中藥中具有抗菌活性的成分干擾細胞壁的發(fā)育[6]。近些年，越來越多的中藥抗菌活性成分被不斷提取出來，包含多糖類、黃酮類、揮發(fā)油類、生物堿類和有機酸類等化合物[7]。大部分具有清熱解毒和抗炎作用的中藥材都具有抑菌作用[8]。研究表明，黃連內(nèi)含有生物堿、香豆素、多糖等，生物堿類物質(zhì)比重最大，發(fā)揮作用的化合物是小檗堿，具有抗菌、消炎、 抗腫瘤等藥理活性[9-10]。

本試驗選用3種益生菌和6種中藥組合（黃連、茯苓、赤芍、金銀花、魚腥草、桂枝），通過牛津杯擴散法測定對雞源大腸桿菌的抑菌效果，對抑菌機理進行解析，為開發(fā)抗生素替代物質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

從雞輸卵管液中分離出來大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisKS-01）、植物乳桿菌（Lactobacillus phantarumLB-04）、地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformisBL-03）由中科康源（唐山）生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 試驗試劑

DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自天津生化科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、瓊脂粉、氫氧化鈉均為分析純，購自天津市化學(xué)試劑廠；黃連、茯苓、赤芍、金銀花、魚腥草、桂枝均在當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I；腸桿菌肽標準品購自北京百靈威科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

超凈工作臺（SJ-CJ-1FD）購自蘇潔醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋（HH-8A）購自北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；37 ℃隔水恒溫培養(yǎng)箱（6MP-9080）購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；恒溫振蕩器（THZ-C）購自蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；pH計（PHS-2F）購自雷磁儀電科學(xué)儀器有限公司；攪拌器（JB-1A）購自雷磁上海精科有限公司；低速離心機（KDC-40）購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PCR儀（K960）購自力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；瓊脂糖水平電泳儀（DYCP-31DHDYY-6C）購自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像儀（JS-680D）購自上海培清科技有限公司；液相色譜儀（Agilent 1260）購自天津遠大科儀科技發(fā)展有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g，用5 mol/L的NaOH調(diào)pH值至7.0～7.2。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%～2.0%的瓊脂粉。所有培養(yǎng)基均在121 ℃、1×105Pa滅菌 20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品細菌分離

取1 mL的雞輸卵管液中分離細菌和9 mL的無菌雙蒸水混勻，梯度稀釋后，吸取200 μL 10-4和10-5濃度的樣品稀釋液，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，靜置1 h，倒置于37 ℃培養(yǎng)24 h，待菌落長出以后純化培養(yǎng)。選取單菌落接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，250 r/min 37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。

1.2.2 細菌鑒定

提取細菌基因組：取1.5 mL培養(yǎng)菌液，5 000 r/min離心10 min，無菌水洗滌1次，900 μL無菌雙蒸水重懸，加入8 μL濃度為50 mg/L的溶菌酶溶液，放入37 ℃培養(yǎng)箱保溫20 min；加入10 μL 10%的SDS溶液，放入37 ℃培養(yǎng)箱保溫30 min；加入10 μL濃度為20 mg/L的蛋白酶K，放入37 ℃培養(yǎng)箱保溫60 min；加入等體積的苯酚，氯仿，異戊醇（25∶24∶1），振蕩混勻，10 000 r/min離心5 min，收集上清液；在上清液中加入1/5體積的醋酸鈉，2倍體積的冷無水乙醇，沉淀DNA。用70%的乙醇洗滌，室溫下干燥30 min，最后加入50 μL無菌雙蒸水溶解。

反應(yīng)體系：PCR mix 25 μL、模板DNA 1 μL、引物1和2各0.4 μL、無菌雙蒸水23.2 μL、總體積為50 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，54 ℃、30 s，68 ℃、90 s，重復(fù)循環(huán)35次，72 ℃延伸9 min。凝膠回收送樣測序檢測后，利用NCBI BLAST功能，將測序結(jié)果與GenBank已收錄的基因組DNA序列進行比對。

1.2.3 益生菌和中藥的篩選

采用牛津杯定量擴散法通過測定抑菌圈直徑評價多種益生菌和中藥對雞源大腸桿菌的抑菌效果。牛津杯高壓滅菌后置入無菌平板，倒入LB培養(yǎng)基，靜置30 min，等到培養(yǎng)基凝固后取出。吸取200 μL指示菌液均勻涂布至LB固體培養(yǎng)基上，注意不要涂到牛津孔內(nèi)，將平板正置1 h后，分別在孔內(nèi)加入200 μL益生菌發(fā)酵液和中藥煎煮液置入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.4 腸桿菌肽的測定

選用抑菌效果明顯的枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃轉(zhuǎn)速為250 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h，8 000 r/min離心30 min，留取上清液。上清液用Millpore超濾離心管超濾濃縮后（截留分子量為3 000 kD）5 000 r/min離心，留取上清液，即為抗菌肽粗提取液。采用高效液相色譜法測定腸桿菌肽含量（ZORBAX 300SB-C8），分析發(fā)酵液濃縮液和腸桿菌肽標準品峰面積，計算出腸桿菌肽的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞源大腸桿菌分離純化與菌種鑒定

將雞輸卵管液分離培養(yǎng)純化后的細菌基因組為模板，使用16 s通用引物進行PCR擴增，得到基因片段。瓊脂糖凝膠回收后送樣測序檢測，利用NCBI BLAST功能，將測序結(jié)果與GenBank已收錄的基因組DNA序列進行比對，該菌株與大腸桿菌E. coliRCB592的16 s RNA序列相似度達到99.3%，確定該雞源菌株為大腸桿菌（E. coli）。以E . coliRCB592菌株作為指示菌。

2.2 益生菌對雞源大腸桿菌抑菌效果分析（見表1、圖1）

表1 3種益生菌對大腸桿菌RCB592平均抑菌圈直徑（牛津杯直徑為0.8）Tab.1 The average inhibition zone diameter of the three probiotics against E. coli RCB592 /cm (Oxford cup diameter is 0.8) 單位：cm

由表1、圖1可知，地衣芽孢桿菌的加入，并無明顯抑菌圈，無抑菌效果。枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌抑菌效果明顯，且枯草芽孢桿菌的抑菌效果略優(yōu)于植物乳桿菌。

2.3 中藥材組合抑菌作用（見表2、圖2）

表2 中藥組合對大腸桿菌RCB592平均抑菌圈直徑Tab.2 Pairwise combination of traditional Chinese medicines on E.coli RCB592 average inhibition zone diameter 單位：cm

本研究將6種中藥采用兩兩組合方式，比例均為1∶1。由表2和圖2可知，黃連和茯苓的抑菌效果最為顯著，黃連和赤芍的抑菌效果最弱。

2.4 解析益生菌的抑菌機理（見圖3）

以雞源大腸桿菌E.coliRCB592為指示菌，益生菌的抑菌效果明顯優(yōu)于中藥組合效果。主要是中藥材中活性物質(zhì)釋放較慢，被雞源大腸桿菌利用、發(fā)揮藥效周期較長，所以中藥材抑菌效果較為有限。益生菌（枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌）抑菌效果非常明顯。為了解析益生菌的抑菌機理，將枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵液進行高效液相分析，發(fā)現(xiàn)在枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵液中檢測到腸桿菌肽的存在。由圖3可知，腸桿菌肽含量大約為27.68 mg/g和11.45 mg/g。

3 討論

本試驗比較益生菌和中藥對大腸桿菌的抑菌效果，篩選出抑菌效明顯的益生菌，并對其抑菌機理進行分析。胡仁火等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃連單獨使用對大腸桿菌抑菌效果很差，抑菌率只有17%。本試驗單獨使用黃連無抑菌效果，但是黃連和其他中藥聯(lián)合使用效果較好。可能是黃連中具有抗菌活性的成分和其他中藥的抗菌成分發(fā)生反應(yīng)，起到藥物之間的相加作用。黃連有較明顯的抑菌效果是由于黃連中小檗堿的抗菌作用，小檗堿是一種廣譜的抗生素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抗菌作用，但是小檗堿對革蘭氏陽性菌效果較好。中藥組合對雞源大腸桿菌有抑菌效果，但較為有限。中藥抑菌成分多種多樣，多種抑菌活性成分相互作用的機制研究還不透徹。確定中藥材中發(fā)揮抑菌作用的成分需要體外試驗和體內(nèi)試驗相結(jié)合才能得到更準確的結(jié)論。益生菌對大腸桿菌有非常明顯的抑菌效果是由于發(fā)酵分泌產(chǎn)生具有抗菌活性的抗菌肽。目前，大約有3 000多種抗菌肽被分離出來，抗菌肽是宿主先天性防御系統(tǒng)中的重要組成部分[12]，不僅有強大的抑菌效果，還有抗病毒、抗寄生蟲、調(diào)節(jié)機體免疫功能和抑制腫瘤等多種作用。白杰等[13]研究獲得的枯草芽孢桿菌B3菌株，其產(chǎn)生的抗菌肽分子質(zhì)量較小為1 567.86 Da，對E. coli具有高效的抑菌效果。莊國宏[14]在探究初步機理的研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌通過分泌的抗菌肽能夠引起腸桿菌細胞膜穿孔，導(dǎo)致代謝活力下降及菌體破裂等，從而起到抑菌的效果。

由于益生菌發(fā)酵產(chǎn)生的抗菌肽具有不易產(chǎn)生耐藥性、無毒副作用等優(yōu)點，未來可以生產(chǎn)益生菌作為微生物菌劑，作為傳統(tǒng)抗生素的替代品，可降低家禽發(fā)病率和致死率。

4 結(jié)論

本試驗中檢測到枯草芽孢桿菌腸桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵液中有抗菌肽成分，其含量可以達到27.68 mg/g和11.45 mg/g。較高的抗菌肽產(chǎn)量是枯草芽孢桿菌腸桿菌和植物乳桿菌有明顯抑菌效果的原因。