羅妮莎,周文珠,王悅,楊春滟,林祺,范香瀛,寇任重,范剛啟

(南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院,南京 210022)

偏頭痛是最常見的原發(fā)性頭痛之一,由于頭痛程度嚴重,導致患者不敢、不愿活動,嚴重影響生存質量,且這種影響主要體現(xiàn)在急性期(發(fā)作期)。針刺運用于偏頭痛急性期鎮(zhèn)痛具有確切療效,且無明顯不良反應,但具體的針刺鎮(zhèn)痛效應機制尚需進一步闡明[1-6]。動物實驗是效應機制研究最主要的手段之一,合理設計包括動物模型、針刺干預、效應指標等要素是保證針刺治療偏頭痛急性期動物實驗研究可行性與結果嚴謹性的前提。為此,本研究擬從近年針刺治療偏頭痛急性期動物實驗研究文獻出發(fā),總結分析動物模型、針刺干預、效應指標等要素設計,并為今后針刺治療偏頭痛急性期動物實驗研究提出建議。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索

搜索收錄于中國知網(CNKI)、Pubmed數(shù)據(jù)庫的文獻,中文主題詞為“針”“針灸”“針刺”“電針”結合“偏頭痛”“偏頭風”,英文主題詞為“acupuncture” 或 “electroacupuncture” 結 合“migraine”。

1.2 文獻篩選

選取2015年1月至2020年2月在中、英文期刊正式發(fā)表的毫針或電針治療偏頭痛急性期(首次針刺在造模后進行)的動物實驗研究文獻,剔除數(shù)據(jù)重復發(fā)表的文獻。

1.3 資料提取與整理

利用 Excel2010軟件對動物實驗研究構成要素,包括動物模型、針刺干預、效應指標等進行分解與整理,具體條目參考ARRIV指南[7]及STRICTA標準[8]。

2 結果與分析

最終共納入 21篇研究文獻[9-29],具體要素分析如下。

2.1 動物模型要素分析

針刺治療偏頭痛急性期動物實驗的模型選擇頻率由高到低依次為電刺激或化學刺激硬腦膜模型、硝酸甘油模型、電刺激三叉神經節(jié)模型、皮層擴布性抑制(Cortical spread dep-ression, CSD)模型,以模擬無先兆或有先兆偏頭痛發(fā)作為主。其中電刺激或化學刺激硬腦膜模型、電刺激三叉神經節(jié)模型均依據(jù)偏頭痛發(fā)作的三叉神經血管學說,硝酸甘油模型主要依據(jù)血管源性學說,皮層擴布性抑制模型主要是依據(jù)皮層擴布性抑制學說[30]。需要指出的是,盡管電刺激或化學刺激硬腦膜模型、電刺激三叉神經節(jié)模型依據(jù)的三叉神經血管學說是目前偏頭痛發(fā)作主流的發(fā)病機制,也可較好地模擬人類偏頭痛的發(fā)作癥狀[30],但手術造模有較大創(chuàng)傷,會對針刺選穴及鎮(zhèn)痛效應機制的觀察產生干擾。硝酸甘油模型造模損傷小、更經濟、更簡便,但硝酸甘油會影響全身血管,無法特異性針對顱內血管起作用,對偏頭痛機制的模擬不夠全面[30]。皮層刺激型能較好地模擬偏頭痛先兆癥狀,相對硬腦膜刺激模型、三叉神經節(jié)刺激模型手術創(chuàng)傷更小,但缺點在于對觀察的儀器要求較高,且對偏頭痛發(fā)作的中樞機制及血管機制均未能很好地解釋[30]?？傮w而言,各種動物模型均有其優(yōu)勢與不足,需根據(jù)針刺研究的目的、實驗條件、技術水平等有針對性地選用,并嘗試建立無創(chuàng)、微創(chuàng)且能較好模擬偏頭痛機制的模型。有學者[31]指出各種模型可以與中醫(yī)證型建立聯(lián)系,在研究時可以針對性選用,也值得針刺研究參考。詳見表1。

動物品種方面,主要選用 SD大鼠,大鼠的體質量在180～300 g之間,200～220 g為最常用區(qū)間;性別選擇上,以選擇雄性動物為主,少數(shù)選擇雌雄各半或雌性動物。大鼠在實驗難度與經濟成本上確實具有明顯優(yōu)勢,但家兔、貓、非人靈長類動物也各有利弊。尤其是考慮到針刺本身可能給其帶來的損傷因素,以最常用的直徑0.25 mm針具為例,此型號針具對人體很少導致傷害,但對于體積、表皮面積遠小于人類的大鼠而言,則很可能導致與實驗無關的針刺傷害,甚至影響實驗的最終結果。因此適當選擇體積較大的如家兔、貓等動物品種,可以一定程度上減少這種干擾。在實驗動物的性別選擇上,既往為避免激素水平干擾研究結果,傾向于選擇雄性動物為研究對象。但研究顯示,性別是影響偏頭痛發(fā)病、治療的重要因素之一[32],因此在偏頭痛動物實驗中忽視雌性動物不利于全面、準確地評價針刺效應機制。建議今后根據(jù)實驗目的,適當選擇雌性動物做為實驗對象,同時加強性別差異、激素分泌等因素對針刺鎮(zhèn)痛效應機制的影響研究。詳見表1。

表1 動物模型要素分析

2.2 針刺干預要素分析

選穴,針刺工具,針刺的方向角度深度,行針手法,針刺干預時機與療程,留針時間,電針的頻率、強度、波形、時間等針刺干預要素,在絕大多數(shù)文獻中都有提及,但要素的具體設置方面,不同研究之間,特別是不同課題組之間存在較大的差異,導致針刺實驗研究的成果的零散、孤立,難以對臨床治療方案的選擇提供指導。詳見表2。

2.2.1 選穴/刺激部位的選擇

選穴特點。針刺治療偏頭痛急性期動物實驗研究穴位選用具體呈現(xiàn)以下特點,①頻次由高到低依次為風池、陽陵泉、外關、太沖、率谷;②多選少陽經穴,包括風池、陽陵泉、外關、率谷;③以選頭穴(風池、率谷)和四肢遠端腧穴(陽陵泉、外關、太沖)為主;④由于無法確切定位動物的疼痛部位,故無法取阿是穴;⑤未見辨證選穴的動物實驗研究。在實驗研究中,明確標注腧穴的單雙側也是必要的,目前大部分研究都能做到這一點。臨床上針刺治療偏頭痛,或以患側取穴,或雙側取穴。針刺治療偏頭痛的動物實驗研究也應該關注這一點,比如刺激三叉神經節(jié)的模型可以模擬偏側偏頭痛發(fā)作,那么患側取穴和雙側取穴的效應是否相同,存在何種差異,都值得研究。

定位標準。針刺治療偏頭痛急性期動物實驗研究的腧穴定位,目前主要依據(jù)各版本《實驗針灸學》教材、中國針灸學會《動物針灸穴位圖譜》或參考既往發(fā)表的研究文獻。動物腧穴定位標準的制定工作開展較早,但仍存在定位證據(jù)不足、準確性待驗證、穴位數(shù)量少等不足。為此,動物模型的腧穴定位國家標準制定工作目前已經展開[33]。

表2 針刺干預要素分析

非經穴的設計與選擇。少數(shù)文獻設置了非經穴對照組與經穴對照,非經穴的選擇是否合理,影響針刺對照的準確性。納入研究中非經穴對照具體選擇如下,①選經穴旁開位置[14,18];②選雙側髂棘前 1 cm處[10,13,15,24-25,27];③取大鼠脅下髂嵴上 20～25 mm,后正中線旁開 20 mm區(qū)段,雙側各取上下對稱點[16-17];④取腰部非穴點(未描述,無具體定位)[23]。目前非穴點還是以經驗選取為主,缺乏根據(jù)不同研究目的而針對性選擇非經穴對照的規(guī)范。

2.2.2 針刺操作

2.2.2.1 毫針

針具規(guī)格。針具規(guī)格多樣,最常見為0.25 mm直徑的針灸針,長度13 mm或25 mm,其次為0.16 mm直徑針灸針(相關文獻均未提及長度參數(shù)),此外還有0.32 mm×40 mm規(guī)格。1篇研究文獻選用銀質毫針(直徑3～5 mm,長1.5～2.0 cm)[20]。還有3篇研究文獻未提及針具規(guī)格[19,23,28]?？紤]到針刺本身可能給其帶來的損傷因素,發(fā)明、規(guī)范適用于不同實驗動物的針灸針,減少針刺工具傷害對實驗結果帶來的干擾,也是今后研究需要注意的要點。

針刺方向角度深度。各穴位的針刺方向角度深度設置多樣。風池穴針刺方向與角度包括向對側眼部針刺、向鼻尖方向斜刺、向后下方斜刺等,針刺深度包括 2 mm、2～3 mm、3 mm、1～6 mm、3～10 mm、1 cm。陽陵泉直刺為主,針刺深度 6 mm、1～6 mm、2～3 mm、3～10 mm。外關直刺為主,深度 1 mm、2～3 mm 、1～6 mm、3～10 mm。率谷針刺方向角度未提及,針刺深度8 mm[9]。太沖針刺方向角度及深度均未提及[20]。

行針手法。行針手法以平補平瀉手法為主,捻轉角度為180°,頻率120次/min,持續(xù)捻轉0.5～3 min。

針刺時間因素。①針刺干預時機與療程方面,包括造模成功后治療1次,造模成功后治療每日1次或隔日1次,療程包括治療1、3、5、6、7次;②留針時間為10 min,15 min,20 min,30 min。

2.2.2.2 電針

電針規(guī)格方面韓式電針儀 HANS-200/HANS-200E為應用最多型號,此外還有華佗牌 SDZ-Ⅱ、青島鑫升G6805、HANS-LH200、HANS WQ-1002F等。電針波形頻率包括疏密波 2/15 Hz、10/50 Hz、2/100 Hz;斷續(xù)波 2～15 Hz、20～40 Hz。電流強度包括 0.5～1.0 mA、1.0～2.0 mA、0.1～1 mA,多以大鼠耐受為度。電針時間包括10 min、15 min、20 min、30 min。

2.2.2.3 假針刺/假電針

1篇文獻設置了假電針對照組,即針刺后不接電針[9]。

2.3 效應指標分析

目前針刺治療偏頭痛急性期動物實驗的鎮(zhèn)痛機制研究包括生化機制、神經電生理機制、腦血流量調節(jié)等。選穴為機制研究的重點內容,但不同經穴間、經穴與非經穴間、頭面枕部穴及遠端穴間鎮(zhèn)痛效應差異及機制研究仍很薄弱;與穴位研究成果相比,針刺對不同動物模型的鎮(zhèn)痛機制差異、不同針刺操作參數(shù)鎮(zhèn)痛效應特異性及機制研究基本空白。詳見表3。

表3 效應指標分析

2.3.1 行為學指標

行為學指標方面,針刺可以改善①耳紅持續(xù)時間,以及撓頭、爬籠、咬尾、打轉、往返運動等頻次,這些指標主要用來觀察硝酸甘油模型。②面部/眶周機械痛閾、足底痛閾/50%縮足閾值、甩尾及熱板實驗的熱刺激痛閾等,主要用以觀察硬腦膜刺激、三叉神經節(jié)刺激模型。其中,面部/眶周機械痛閾評價是研究者針對偏頭痛疼痛發(fā)作特點,對傳統(tǒng)的足底痛閾/50%縮足閾值等疼痛研究指標改進而來,因此更能反映偏頭痛臨床癥狀的變化,現(xiàn)已成為偏頭痛模型最主要的行為學指標[34]。

2.3.2 生化指標

生化指標方面,針刺可調節(jié)外周血神經遞質/神經肽類物質降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)、P物質(substance p, SP)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、垂體腺苷酸循環(huán)激活多肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)、β-內啡肽(β-endorphin, β-EP),內皮素-1(endothelin-1, ET-1)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、內源性大麻素分解酶 N-花生四烯酸乙醇胺(anandamide,AEA)、單酰基甘油酯酶(monoacylglycerol lipase,MAGL);調節(jié)外周血炎癥因子如白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β) 、 白 細 胞 介 素 -6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 、 環(huán) 氧 化 酶 -2(Cyclooxygenase-2, COX-2);此外還可調節(jié)外周血腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)。

針刺可調節(jié)硬腦膜CGRP、VIP表達,肥大細胞與巨噬細胞數(shù);可調節(jié)腦膜中動脈肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)的活化與表達;可調節(jié)三叉神經節(jié)(trigeminal ganglia, TG)內CGRP、CGRPmRNA、c-fos,5-HT7R、5-HT1DR、5-HT1BR mRNA,大麻素受體1(cannabinoid receptor 1, CB1)的表達;調節(jié)三叉神經脊束核尾核(Trigeminal Nucleus Caudalis, TNC)內 5-HT7R、5-HT1DR、5-HT1AR mRNA、5-HT1BR mRNA表達;可調節(jié)下行通路中縫大核(raphe magnus nucles, RMg)5-HT7R、5-HT1AR mRNA表達;調節(jié)中腦導水管周圍灰質(periaqueducttal gray, PAG)的CGRP、β-EP、5-HT、5-HT7及其受體,以及c-fos陽性細胞數(shù)。

2.3.3 神經電生理

c類纖維對三叉神經頸髓復合體(trigeminal cervical medulla complex, TCC)內廣動力范圍神經元(wide-dynamic range neuron, WDR)的彌漫性傷害抑制性控制有關鍵作用,而針刺可在60 s內迅速降低c類纖維誘發(fā)的TCC內WDR神經元放電。

2.3.4 腦血流量

針刺可使腦部血管的血流速度增快,進而緩解血管痙攣,減少血流阻力,增加腦血流量,從而起到治療作用。

3 討論

近年來針刺治療偏頭痛急性期動物實驗研究取得了一定成果,但仍存在部分研究實驗要素設計不夠規(guī)范,研究總體效率偏低,無法有效指導臨床的問題。建議對實驗要素的設計可從以下方面針對性改進,以保證研究質量、提升研究效率、促進臨床轉化。

3.1 建立實驗要素設計規(guī)范,保證研究質量

無論是臨床研究還是動物實驗研究,規(guī)范的研究設計是保證研究質量的前提。臨床研究領域早在1996年、2001年就先后發(fā)布臨床試驗報告的統(tǒng)一標準(Consolidated Standards of Reporting Trials,CONSORT)及針刺臨床試驗干預措施報告標準(Standards for Reporting Interventions in Clinical Trials of Acupuncture, STRICTA)并不斷修訂、更新[8]。而在動物實驗領域,直到 2010年才由Kilkenny等參照CONSORT聲明,首次發(fā)表針對動物實驗研究的報告指南,即 ARRIV(Animals in Research:Reporting In Vivo Experiments)指南[7]。針對針刺動物實驗設計或報告的指南與規(guī)范,目前知之甚少,多是根據(jù)研究組自身經驗或者依據(jù)各個版本的《實驗針灸學》教材。目前動物腧穴定位規(guī)范方面工作相對開展較早,取得了一定成果,2017年《實驗動物常用腧穴名稱與定位編寫通則》等5項針灸團體標準項目的立項論證會議在南京舉行,標志著實驗動物腧穴名稱與定位國家標準的制定工作正式開展[33]。但相對臨床領域而言,針刺動物實驗研究相關的規(guī)范與指南的制定工作總體是滯后的,因此,建議針刺治療急性期偏頭痛動物實驗在今后研究設計與報告方面,參考 ARRIV指南并結合STRICTA標準,對實驗要素進行設計。同時呼吁盡快制定針刺動物實驗研究的設計或報告的指南與規(guī)范,以提高動物實驗研究的質量,保證實驗的可重復性及結論的可靠性。

3.2 系統(tǒng)性設計實驗要素,提高研究效率

目前動物模型、針刺的選穴及操作等要素都得到了一定重視,但現(xiàn)有研究主要還是集中于探討針刺鎮(zhèn)痛效應機制如何,部分研究初步探討了不同穴組之間、經穴與非經穴之間、針刺與假針刺之間的效應機制差異,但還不夠深入和系統(tǒng)。針刺干預包括選穴、針具選擇、針刺方向角度深度、行針手法、留針時間、干預時機與療程等要素,在針刺治療急性期偏頭痛中,哪些要素對鎮(zhèn)痛效應是主要影響因素,哪些是次要影響因素?不同要素之間,也具有相互聯(lián)系、相互作用,那么不同要素之間產生不同組合的鎮(zhèn)痛效應機制存在何種差異?不同要素之間怎樣組合可以達到最佳的鎮(zhèn)痛效應?這些問題都還不能很好地回答。

對于上述問題如果僅是從單因素角度進行研究設計與解答,就只可能得出相對局限、孤立的結論。而為提高研究效率,更加全面、真實地反映針刺效應的客觀規(guī)律,可以考慮借助系統(tǒng)科學或系統(tǒng)工程學理論,運用多因素系統(tǒng)分析范式,對針刺治療偏頭痛急性期實驗研究進行設計。從系統(tǒng)科學角度分析,動物模型、選穴、針刺操作等要素均可直接或間接造成針刺鎮(zhèn)痛效應機制的差異,同時這些要素又可分解為若干個子因素,這些因素對針刺鎮(zhèn)痛效應機制的影響存在主次關系,不同因素之間也存在交互關系如協(xié)同、拮抗等;通過多因素分析,可明確各因素的主次、交互關系,對各因素及其組合進行對比,尋找其鎮(zhèn)痛效應及鎮(zhèn)痛機制的差異,并最終可優(yōu)選出對針刺干預敏感的優(yōu)勢動物模型,以及鎮(zhèn)痛機制明確、鎮(zhèn)痛效應相對突出的偏頭痛急性期優(yōu)勢針刺干預方案,從而實現(xiàn)對臨床研究與臨床實踐的有益指導[35]。目前在針刺治療偏頭痛急性期臨床研究領域,已有多個工作組、多項研究采用正交設計等多因素系統(tǒng)分析法,對針刺治療工具、選穴、針刺方向角度深度、針感、穴位局部針數(shù)、針刺時機、留針時間等要素進行優(yōu)選研究并取得研究成果[1,3,5]。有理由相信,運用多因素系統(tǒng)分析法對針刺治療偏頭痛動物實驗要素進行設計是可行的,并且將極大提高研究效率。

3.3 實驗要素設計立足臨床問題,實現(xiàn)成果轉化

目前針刺治療偏頭痛急性期的實驗研究為解釋針刺鎮(zhèn)痛效應與機制奠定了一定基礎,但不可否認,目前針刺治療偏頭痛急性期的實驗研究存在與針刺臨床脫節(jié)的問題,無法有效地為針刺臨床服務。具體體現(xiàn)在,①針刺治療偏頭痛急性期實驗研究無法為針刺臨床篩選優(yōu)勢亞型或適應證。目前偏頭痛動物模型可模擬無先兆偏頭痛、先兆偏頭痛、家族偏癱性偏頭痛等亞型[30],針刺對不同類型的偏頭痛鎮(zhèn)痛效應機制有何差異?尚無研究證據(jù)。②針刺治療偏頭痛急性期實驗研究無法為提升針刺臨床療效提供指導。從目前的針刺治療偏頭痛急性期動物實驗研究結果來看,似乎不同的選穴、針刺操作都有一定的鎮(zhèn)痛效應,但不同選穴、不同操作手法組成的干預方案,其鎮(zhèn)痛效應孰優(yōu)孰劣、鎮(zhèn)痛機制有何差異尚不明確,無法為臨床研究、臨床實踐提供參考。③針刺治療偏頭痛急性期實驗研究無法為針刺臨床鎮(zhèn)痛療效的觀察提供權威的生物學指標。盡管針刺治療偏頭痛急性期的動物實驗研究顯示針刺鎮(zhèn)痛機制包括生化機制、神經電生理機制、腦血流量調節(jié)等,但目前臨床研究與臨床實踐的主要療效指標仍以相對主觀的臨床癥狀為主,如2 h內頭痛緩解率、疼痛復發(fā)率(24 h以內)以及對惡心、嘔吐、畏光、畏聲等伴隨癥狀的改善等,可用于評價臨床療效的生物學效應評價體系尚未建立,無法為臨床療效評價提供客觀參考[35]。

與臨床脫節(jié)的問題其實廣泛存在于基礎研究中,改變這一現(xiàn)狀不光需要實驗技術的進步,更需要研究思維的轉變,即研究問題從臨床中來,并以指導臨床實踐為最終目的,實現(xiàn)實驗研究與臨床的雙向轉化,這也是近年來提出“轉化醫(yī)學”理念的初衷。但從目前看,針刺實驗研究的臨床轉化仍舉步維艱。其實對于針刺治療偏頭痛急性期研究領域,上文提到的 3個脫節(jié)之處就是實驗研究的切入點,而實現(xiàn)針刺優(yōu)勢病種的篩選、優(yōu)勢治療方案的篩選、權威生物學指標的篩選等,就是具有潛在臨床轉化價值的研究方向。如在臨床取穴方面,筆者所在研究團隊通過分析既往選穴規(guī)律,結合神經支配區(qū)理論,發(fā)現(xiàn)針刺治療偏頭痛急性期最常用的腧穴可分為枕神經支配區(qū)穴位(風池、率谷、百會)、三叉神經支配區(qū)穴位(頭維、太陽、率谷、百會)、脊神經支配區(qū)穴位(太沖、外關、陽陵泉),結合偏頭痛三叉神經血管系統(tǒng)機制、三叉神經髓復合體這一特定解剖結構,提出不同神經支配區(qū)穴位針刺鎮(zhèn)痛效應的相對特異性假說,并在臨床部分證實[1,36]。在此基礎上若能進一步從神經通路角度闡明不同神經支配區(qū)穴位針刺鎮(zhèn)痛效應的相對特異性機制,則可以為臨床選穴及優(yōu)化選穴提供強有力的證據(jù)。針刺操作參數(shù)的鎮(zhèn)痛效應特異性及其機制也理應成為實驗研究的重點,如在臨床實踐中發(fā)現(xiàn),淺刺入筋膜層與深刺入肌層均可以有效緩解偏頭痛的急性發(fā)作,為此產生了針刺鎮(zhèn)痛機制的多樣解釋如神經機制、結締組織機制等[37]。那么針刺不同層次是否對神經系統(tǒng)、結締組織的調節(jié)存在差異,其具體的鎮(zhèn)痛機制究竟如何,這些問題的解決無疑對針刺操作的臨床研究與實踐具有重要指導意義。因此,呼吁轉變針刺治療偏頭痛急性期動物實驗的研究思維,對實驗要素的設計應該基于臨床問題,并實現(xiàn)實驗研究與臨床的雙向轉化,從而更好地用現(xiàn)代醫(yī)學技術為針刺研究與實踐注入不竭的發(fā)展動力。