張夢潔

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海200062

人β防御素2（hBD-2）是第一個被發(fā)現(xiàn)的具有 可誘導(dǎo)表達特性的防御素［1］，廣泛分布于皮膚、支氣管肺部、子宮等部位，尤其以支氣管肺部表達最多。其具有良好的殺菌能力和抗病毒、抗真菌、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，能趨化多數(shù)免疫細胞，在固有免疫和特異性免疫中均有重要功能，因此在肺部炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。在自然條件下，hBD-2表達水平極低或不表達；在受到外界因素刺激誘導(dǎo)后，則在各種組織黏膜細胞中表達并上調(diào)，發(fā)揮其抗微生物和調(diào)節(jié)免疫的功能［2］。腺苷三磷酸（ATP）是一種輔酶，通過多種蛋白功能為機體多種合成反應(yīng)提供所需能量，增強機體組織及細胞的代謝活性，因而其對治療各種疾病均有較強的針對性。目前，ATP已被廣泛應(yīng)用于細菌、病毒、球蟲等引起的呼吸、消化及生殖系統(tǒng)疾病的臨床輔助治療。實驗研究發(fā)現(xiàn)，ATP可以上調(diào)大鼠防御素2（mBD-2）的表達，但ATP是否可以上調(diào)hBD-2的表達水平目前鮮有文獻報告。2016年9月—2017年7月，我們應(yīng)用ATP體外刺激人外周血單個核細胞（PBMCs），觀察其是否可誘導(dǎo)hBD-2表達，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑 PBMCs分離液（Ficoll）及ATP干粉均購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國BI公司，青霉素鏈霉素溶液（雙抗）、RPMI-1640培養(yǎng)液、HBSS和PBS緩沖液均購自美國HyClone公司，臺盼蘭購自美國Gibco公司，人白細胞介素1β（IL-1β）和hBD-2酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定試劑盒均購自武漢Elabscience公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本來源與收集 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，收集健康志愿者20名，男10例、女10例，年齡（35.2±10.5）歲，漢族，均已簽署知情同意書。無菌抽取健康志愿者外周血9 mL于EDTA管抗凝，2 h內(nèi)進行PBMCs的分離。

1.2.2 人PBMCs的分離 采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法。用無菌吸管各取3 mL血液于3只15 mL離心管中，并各加入3 mL等量HBSS液進行1∶1稀釋，輕輕上下吹打，充分混勻；用10 mL注射器吸取搖勻的Ficoll 3 mL于15 mL離心管內(nèi)，避免管壁殘留分離液（Ficoll∶稀釋前全血∶HBSS=1∶1∶1）；將離心管傾斜45°，槍頭緊貼管壁將稀釋全血沿管壁緩慢加于Ficoll液面上，注意保持兩者界面分層清晰。在室溫（20℃）下，用水平離心機以離心半徑10 cm、400 g離心30 min。離心后管內(nèi)分為三層，在第一、二層交界處有一狹窄帶，呈白色云霧狀，以單個核細胞為主。用移液槍去除最上層，小心吸出PBMC層（1～2 mL），移至另一15 mL離心管中。加入6～8倍體積PBS洗滌2次，室溫下以離心半徑10 cm、400 g離心5 min，留取沉淀。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液1 mL重懸細胞，并配成單個細胞懸液。將重懸了PBMCs的RPMI-1640培養(yǎng)液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，顯微鏡下觀察并計數(shù)。用移液器吸取10 μL細胞懸液到離心管中，再加入0.4%臺盼藍10 μL染液，于顯微鏡下計數(shù)PBMCs，活細胞百分比達95%以上，達到實驗要求。

1.2.3 PBMCs分組與ATP干預(yù) 在超凈臺內(nèi)，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×106/mL；將細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL；將PBMCs分為六組，每組設(shè)3個復(fù)孔?？瞻捉M不處理，0、25、50、100、200 μmol/L ATP組分別加入 HBSS液和 25、50、100、200 μmol/L ATP 100 μL，于37℃、5%CO2及相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)12、24 h后終止培養(yǎng)，將各組培養(yǎng)后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌離心管中，標(biāo)記編號后以離心半徑10 cm、1 500 r/min低溫離心10 min，留取適量培養(yǎng)上清液置-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.4 PBMCs培養(yǎng)上清液hBD-2、IL-1β檢測 收集培養(yǎng)上清液，以離心半徑10 cm、3 000 r/min離心5 min，取上清液，采用雙抗體夾心ELISA法檢測hBD-2和IL-1β，具體步驟按試劑盒要求。即加50 μL待測樣品及系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在細胞因子單抗包被的酶標(biāo)板上，室溫孵育使細胞因子結(jié)合到酶標(biāo)板上，再加入二抗孵育結(jié)合；最后加底物液顯色30 min，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測OD值并計算hBD-2和IL-1β含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。所有計量數(shù)據(jù)以-x±s表示，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗，組內(nèi)不同時間點的比較行重復(fù)測量方差分析，相關(guān)關(guān)系采用Person相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組PBMCs培養(yǎng)上清液中hBD-2水平比較 見表1。

2.2 各組PBMCs培養(yǎng)上清液中IL-1β水平比較 見表2。

2.3 ATP作用后PBMCs培養(yǎng)上清液中hBD-2與IL-1β水平的關(guān)系 經(jīng)ATP作用12、24 h時，PBMCs培養(yǎng)上清液中hBD-2與IL-1β水平均呈正相關(guān)（r分別為0.494、0.725，P均＜0.01）。

3 討論

hBD-2是防御素家族中非常重要的成員，主要表達于皮膚、支氣管等各種黏膜上皮細胞，外周血中的中性粒細胞和單核細胞在致炎因子刺激下也可以表達 hBD-2［3-4］。在高濃度時，hBD-2 對病原微生物具有直接殺傷作用；而低濃度時，hBD-2就只有趨化性，它可趨化募集樹突狀細胞、T淋巴細胞、白細胞、肥大細胞和巨噬細胞等，使這些細胞聚集在感染部位、誘導(dǎo)分化成熟、促進細胞因子產(chǎn)生；而這些細胞及細胞因子反過來又影響hBD-2的誘導(dǎo)表達，從而對機體的免疫狀態(tài)產(chǎn)生影響。hBD-2也可通過激活G蛋白偶聯(lián)受體和磷脂酶C途徑還能與肥大細胞表面兩種特異性受體結(jié)合，從而誘導(dǎo)肥大細胞聚集到炎癥部位并活化、脫顆粒、釋放組胺，參與速發(fā)型超敏反應(yīng)［5］。研究顯示，hBD-2是Toll樣受體（TLR）的內(nèi)源性配體，通過TLR2、TLR4、CC趨化因子受體6（CCR6）等受體介導(dǎo)，在IL-1相關(guān)蛋白激酶（IRAK）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的協(xié)同作用下，觸發(fā)細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，激活NF-κB，活化T淋巴細胞，觸發(fā)強有力的特異性免疫應(yīng)答［6］。YANG等［7］發(fā)現(xiàn)，hBD通過CCR6途徑誘導(dǎo)的未成熟樹突狀細胞（iDC）的遷移，在hBD-2的刺激下通過CCR6促進iDC遷移，促進抗原提呈作用，激活T細胞，引發(fā)免疫應(yīng)答。

表1 各組PBMCs培養(yǎng)上清液中hBD-2水平比較（）

表1 各組PBMCs培養(yǎng)上清液中hBD-2水平比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與0 μmol/L ATP組比較，bP＜0.01；與 25 μmol/L ATP組比較，cP＜0.01；與 50 μmol/L ATP組比較，dP＜0.01；與同組培養(yǎng)12 h比較，eP＜0.01。

images/BZ_15_234_402_1193_520.png99.57± 9.03 117.71± 8.07abe 133.79± 8.69abce 114.87±12.73abce 150.40±10.02abcde 99.82± 9.57 0 μmol/L ATP組25 μmol/L ATP組50 μmol/L ATP組100 μmol/L ATP組200 μmol/L ATP組空白組93.17± 5.67 106.62± 8.85ab 113.31± 7.98ab 120.97±10.30abc 128.39±10.48abcd 93.97± 7.92

表2 各組PBMCs培養(yǎng)上清液中IL-1β水平比較（）

表2 各組PBMCs培養(yǎng)上清液中IL-1β水平比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與0 μmol/L ATP組比較，bP＜0.01；與 25 μmol/L ATP組比較，cP＜0.01；與 50 μmol/L ATP組比較，dP＜0.01；與100 μmol/L ATP組比較，eP＜0.01；與同組培養(yǎng)12 h比較，fP＜0.01。

24 h 14.08±2.50 17.34±2.29abf 19.93±3.69abf 24.32±4.42abcdf 27.41±4.06abcdef 13.00±2.05組別0 μmol/L ATP組25 μmol/L ATP組50 μmol/L ATP組100 μmol/L ATP組200 μmol/L ATP組空白組IL-1β 12 h 10.92±2.43 12.61±4.60 14.30±4.08ab 17.35±2.76abc 18.83±3.38abcd 10.66±2.75

有研究發(fā)現(xiàn)，ATP還具有細胞間信息傳遞功能［8］，可提高細胞內(nèi)鈣離子水平，促進鈣離子參與調(diào)節(jié)細胞的多種生物學(xué)功能。鈣非特異性調(diào)節(jié)劑ATP能通過與特殊受體（P2-嘌呤受體）結(jié)合，促進磷酸肌醇激酶的水解，從而引起鈣動員、胞內(nèi)鈣升高，導(dǎo)致細胞的特殊反應(yīng)；這些反應(yīng)依據(jù)細胞類型不同而異，并且與細胞的功能有關(guān)［9］。hBD-2在自然條件下表達水平極低或不表達，當(dāng)受到刺激誘導(dǎo)后則在各種組織黏膜細胞中表達并上調(diào)，發(fā)揮其抗微生物和調(diào)節(jié)免疫的功能［2］。hBD-2的可誘導(dǎo)表達特性，為利用某種人工方式調(diào)控其表達提供了理論依據(jù)。PBMCs為免疫活性細胞的集合體，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、單核細胞等免疫活性細胞，尤其T淋巴細胞，在機體免疫反應(yīng)中扮演重要作用。hBD-2能趨化多數(shù)免疫細胞，因而在固有免疫和特異性免疫中均起著重要作用。

為探索人工促進hBD-2表達上調(diào)的方法，以進行體內(nèi)研究且能應(yīng)用于臨床，并進一步探討hBD-2與機體免疫狀態(tài)的關(guān)系。本研究先提取人PBMCs，用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至一定濃度后接種于培養(yǎng)板中，分別加入不同濃度的ATP液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于12、24 h收集細胞培養(yǎng)上清液，用ELISA法檢測其上清中的hBD-2及IL-1β。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組和0 μmol/L ATP組比較，經(jīng)不同濃度ATP組處理后，PBMCs細胞培養(yǎng)上清中hBD-2及IL-1β表達水平出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；且隨著ATP濃度適當(dāng)?shù)脑黾蛹白饔脮r間的延長，細胞培養(yǎng)上清液中hBD-2及IL-1β的表達水平可進一步升高。本研究結(jié)果進一步證明了ATP可以誘導(dǎo)人體內(nèi)hBD-2和IL-1β表達，并可通過人體免疫細胞發(fā)揮作用，在增強機體免疫方面起極為重要的作用。本研究結(jié)果提示，經(jīng)ATP處理后，PBMCs培養(yǎng)上清液中hBD-2與IL-1β的表達水平呈正相關(guān)，這與SUN等［10］發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織中mBD-2與IL-1β表達呈正相關(guān)這一觀點相符。目前的研究表明，hBD-2的誘導(dǎo)表達可能是通過多種信號途徑實現(xiàn)的，核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號通路被外來刺激信號激活可能是hBD-2基因激活的機制之一，hBD-2的表達是通過激活NF-κB、在IL-1β及TNF-α參與下實現(xiàn)的［11］。也有研究表明，ATP是促進巨噬細胞中IL-1β成熟與分泌的重要內(nèi)源性刺激物［12-13］。結(jié)合本研究可以推測，ATP作用于PBMCs后使細胞內(nèi)鈣離子濃度增高，導(dǎo)致NF-κB信號通路激活，從而誘導(dǎo)細胞因子如IL-1β和hBD-2表達，使細胞內(nèi)IL-1β和hBD-2的分泌增加；而hBD-2反過來趨化免疫細胞，促進產(chǎn)生細胞因子如IL-1β，這些細胞因子反過來又影響hBD-2的誘導(dǎo)表達，兩者相互影響；但ATP也有可能通過直接刺激PBMCs分泌IL-1β，進而介導(dǎo)hBD-2的表達上調(diào)。當(dāng)然，激活hBD-2基因表達還存在其他機制，如IL-6、JAK/STAT途徑等。有研究認為，其他部位的上皮細胞誘導(dǎo)hBD-2表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制與氣道上皮細胞可能不同［14-15］。例如 KRISANAPRAKORNKIT 等［16］發(fā)現(xiàn)，通過絲裂原素活化蛋白激酶通路可以實現(xiàn)齒齦上皮細胞hBD-2的表達，而不是NF-κB激活通路。MOON等［17］用前炎癥細胞因子IL-1α刺激中耳上皮細胞表達hBD-2，發(fā)現(xiàn)這是通過Raf-MEK1/2-ERK依賴性信號通路發(fā)生的；但MCDERMOTT等［18］在角膜上皮細胞用IL-1β刺激hBD-2的表達時，發(fā)現(xiàn)此過程既有NF-κB信號通路，也有絲裂原蛋白激酶信號通路。由此可見，各種刺激因素對hBD-2的誘導(dǎo)表達可能是通過多種信號途徑實現(xiàn)的。ATP刺激PBMCs誘導(dǎo)hBD-2表達的具體機制和途徑，尚需進一步研究。ATP作為臨床常用藥物，每日使用劑量可達100～200 mg。本研究提示，25 μmol/L ATP即可誘導(dǎo)hBD-2表達上調(diào)，這與臨床上ATP使用劑量相比是極其微量的，這為肺部感染患者臨床上使用小劑量ATP來誘導(dǎo)機體hBD-2的表達并輔助抗感染提供了依據(jù)。