馬丙南，朱煒春，林菁，周潔雯，高智群

廣州市第八人民醫(yī)院，廣州510440

隨著預(yù)防人類免疫缺陷病毒（HIV）母嬰傳播工作在全球范圍內(nèi)的推進，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法（ART）預(yù)防HIV母嬰傳播的方法逐漸得到普及，規(guī)范執(zhí)行包含ART在內(nèi)的母嬰阻斷措施的HIV感染母親所生新生兒（HIV母嬰阻斷新生兒）感染HIV的概率幾乎為零［1］。由于母嬰垂直傳播感染率逐年下降，宮內(nèi)暴露于HIV和ART但未感染（HEU）兒童的人數(shù)逐漸增多，關(guān)于HIV暴露和母嬰阻斷措施對HEU兒童生長發(fā)育的影響也引起了越來越多的關(guān)注。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，與正常兒童相比，HEU兒童會有體格生長發(fā)育落后和神經(jīng)發(fā)育障礙的高風險；體格發(fā)育不良經(jīng)過營養(yǎng)干預(yù)后多可以恢復(fù)到正常，但神經(jīng)發(fā)育障礙如注意力下降、記憶力減退及社交互動行為減少等糾正存在困難。出現(xiàn)這些問題的原因主要認為是圍產(chǎn)期暴露于HIV和ART，即生命早期的暴露可能持續(xù)影響了其后續(xù)的生長發(fā)育，但是關(guān)于產(chǎn)生相關(guān)影響的具體作用機制目前尚不清楚［2-4］。腸道菌群作為菌群—腸—腦軸（MGBA）的重要環(huán)節(jié)，在神經(jīng)發(fā)育、情緒、行為和認知過程中起到重要作用［5］。圍產(chǎn)期和新生兒期是神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵時期，HIV母嬰阻斷新生兒在此期間出現(xiàn)腸道菌群的異?？赡軙ζ渖窠?jīng)發(fā)育產(chǎn)生長期的影響［6］。本研究通過高通量測序分析HIV母嬰阻斷新生兒早期腸道菌群的構(gòu)成特征，旨在尋找影響HIV母嬰阻斷新生兒神經(jīng)功能發(fā)育的潛在因素，以期發(fā)現(xiàn)HIV母嬰阻斷新生兒早期腸道菌群的干預(yù)靶點和治療方向，為HEU兒童神經(jīng)發(fā)育障礙尋找可行的早期預(yù)防方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究為前瞻性、觀察性研究，選取2019年1月—12月在廣州市第八人民醫(yī)院出生的HIV母嬰阻斷新生兒20例（母嬰阻斷組）及同期與之胎齡及出生體質(zhì)量方面相匹配的健康母親所生新生兒20例（對照組），胎齡及出生體質(zhì)量相匹配的標準為胎齡相差5 d以內(nèi)、體質(zhì)量相差200 g以內(nèi)。母嬰阻斷組納入標準：①新生兒母親HIV呈陽性，且已規(guī)范接受HIV母嬰阻斷治療，無糖尿病、高血壓、肥胖及慢性感染性疾病等其他基礎(chǔ)性疾病；②新生兒在本院出生并在生后4 h內(nèi)開始進行預(yù)防性ART；③胎齡≥37周；④出生體質(zhì)量≥2.5 kg。對照組納入標準：①母親HIV呈陰性，無糖尿病、高血壓、肥胖及急慢性感染性疾病等基礎(chǔ)性疾??；②順產(chǎn)出生，母乳喂養(yǎng)；③胎齡≥37周；④出生體質(zhì)量≥2.5 kg。排除標準：①出生時中、重度窒息；②有發(fā)育畸形或先天性基礎(chǔ)??；③母親分娩前1個月內(nèi)使用過抗生素或腸道微生態(tài)制劑；④新生兒需使用抗生素或腸道微生態(tài)制劑治療。母嬰阻斷組男12例，女8例，胎齡（38.63±0.91）周，出生體質(zhì)量（3 398.00±387.29）g，開奶時間（2.10±0.91）h，母親年齡（29.50±3.59）歲；對照組男9例，女11例，胎齡（38.84±1.10）周，出生體質(zhì)量（3 367.50± 365.12）g，開奶時間（2.23±0.90）h，母親年齡（29.30±3.88）歲。兩組研究對象性別、胎齡、出生體質(zhì)量、開奶時間及母親年齡等基線資料比較均無統(tǒng)計學意義。本研究通過廣州市第八人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會備案審批，新生兒監(jiān)護人均簽署知情同意書。

1.2 糞便標本采集 兩組研究對象均在出生后的第7天采集新鮮糞便標本，采集過程中嚴格遵循無菌操作。用無菌棉簽剝?nèi)バ迈r糞便表層，避免混入尿液或其他雜物，更換棉簽，挑取內(nèi)層糞便至少1 g，裝入無菌凍存管中。收集后立即置于-20℃冰箱保存，并于24 h內(nèi)轉(zhuǎn)入實驗室，用-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 腸道菌群DNA提取和純化 使用QlAamp DNA Stool Mini Kit提取試劑盒（德國Qiagen公司）提取DNA，使用QubitFluorometer試劑盒（美國Life Technologies公司）檢測DNA濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品完整性。利用Taq酶（上海生工）對選擇區(qū)域（V3～V4區(qū)）進行擴增，PCR引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。使用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，將樣品送實驗室進行腸道細菌16 S高通量測序分析。

1.4 細菌16 S高通量測序 使用Illumina Hiseq 2500（美國Illumina公司）測序平臺進行PE250建庫測序，利用雙末端測序（Pair-end）的方法，每條序列從5′端和3′端各產(chǎn)生250讀長（reads）。將測序獲得的原始數(shù)據(jù)在進行分析前對其進行剪切及過濾，濾除低質(zhì)量reads，獲得有效數(shù)據(jù)；通過有效數(shù)據(jù)之間的重疊關(guān)系將reads拼接成標簽（Tags），進一步過濾獲取目標片段；按照97%的相似度將Tags聚類成操作分類單元（OTU），與已知物種的16 S數(shù)據(jù)庫比對進行OTU物種注釋，從而得到每個樣品的群落組成信息。

1.5 腸道菌群多樣性及相對豐度分析 對樣品群落組成行Alpha多樣性分析，包括Observed Species指數(shù)、Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)。上述指數(shù)中可以通過Observed Species指數(shù)及Chao1指數(shù)評估各樣品的物種豐富度，通過Shannon指數(shù)評估各樣品的物種多樣性和均勻度，指數(shù)的值越大代表樣品的多樣性越豐富。對兩組在門、科、屬水平的腸道優(yōu)勢菌群相對豐度進行比較，分析其細菌豐度差異。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較行獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

本研究40份樣品共檢測到2 163 156條高質(zhì)量細菌序列，其中母嬰阻斷組與對照組各檢測到1 006 231、1 156 925條。所有樣本序列共聚類出522個OTUs，其中母嬰阻斷組及對照組各聚類出388、410個OTUs，兩組共有OTUs為276個。

2.1 兩組腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較 母嬰阻斷組Observed Species指數(shù)及Chao1指數(shù)均低于對照組（P均＜0.05），兩組Shannon指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 兩組腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較（）

表1 兩組腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較（）

images/BZ_37_1284_471_2243_589.png母嬰阻斷組對照組20 20 t P 95.67±12.29 111.80±18.13 3.293 0.002 129.43±9.54 140.12±11.98 3.122 0.003 1.22±0.50 1.58±0.67 1.926 0.062

2.2 兩組在門水平腸道優(yōu)勢菌群相對豐度比較 兩組腸道菌群的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門，這4個菌門的相對豐度之和占所有腸道細菌豐度的99.13%。母嬰阻斷組擬桿菌門相對豐度低于對照組（P＜0.05），兩組厚壁菌門、變形菌門和放線菌門相對豐度比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 兩組腸道優(yōu)勢菌群在門水平相對豐度比較（%，）

表2 兩組腸道優(yōu)勢菌群在門水平相對豐度比較（%，）

images/BZ_37_235_1412_2243_1471.png母嬰阻斷組對照組20 20 t P 52.36±17.12 56.32±19.26 0.687 0.496 30.45±12.66 26.76±10.33 1.010 0.319 9.13±3.02 7.56±2.26 1.861 0.070 5.36±1.98 7.01±2.17 2.512 0.016

2.3 兩組在科水平腸道優(yōu)勢菌群相對豐度比較 母嬰阻斷組雙歧桿菌科相對豐度低于對照組（P＜0.05），兩組其他菌科比較差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.4 兩組在屬水平腸道優(yōu)勢菌群相對豐度比較 母嬰阻斷組雙歧桿菌屬、梭菌屬相對豐度低于對照組（P均＜0.05），其他菌屬比較差異無統(tǒng)計學意義。見表4。

表3 兩組腸道優(yōu)勢菌群在科水平相對豐度比較（%，）

表3 兩組腸道優(yōu)勢菌群在科水平相對豐度比較（%，）

images/BZ_37_234_2000_2246_2058.png母嬰阻斷組對照組20 20 t P 32.62±11.33 28.43±9.17 1.286 0.206 25.75±9.54 24.53±8.62 0.424 0.674 12.07±5.74 11.89±5.03 0.106 0.917 10.63±2.86 12.17±3.65 1.485 0.146 6.17±1.62 6.09±2.12 0.134 0.894 4.83±1.26 6.67±1.98 3.506 0.001images/BZ_37_234_2290_2246_2365.png母嬰阻斷組對照組t P 2.62±1.13 3.13±1.37 1.284 0.207 0.05±0.02 0.06±0.03 1.240 0.223 1.58±0.62 1.52±0.55 0.324 0.748 1.48±0.31 1.61±0.22 1.529 0.134 1.03±0.42 1.20±0.55 1.099 0.279 0.06±0.02 0.05±0.02 1.581 0.122

表4 兩組腸道優(yōu)勢菌群在屬水平相對豐度比較（%）

表4 兩組腸道優(yōu)勢菌群在屬水平相對豐度比較（%）

images/BZ_37_234_2676_2246_2734.png母嬰阻斷組對照組20 20 t P 28.91±12.26 30.36±13.52 0.355 0.724 25.49±10.47 23.65±11.23 0.536 0.595 14.77±5.76 12.62±4.67 1.297 0.203 8.64±3.16 7.24±2.75 1.495 0.143 8.15±2.13 10.17±3.19 2.355 0.024 4.73±1.57 6.06±2.16 2.227 0.032images/BZ_37_234_2966_2246_3041.png母嬰阻斷組對照組t P 3.42±1.02 3.97±1.44 1.394 0.172 1.36±0.66 1.28±0.51 0.429 0.670 1.27±0.41 1.33±0.55 0.391 0.698 1.05±0.50 1.11±0.43 0.407 0.686 0.42±0.21 0.37±0.16 0.847 0.402 0.08±0.02 0.07±0.02 1.581 0.122 0.07±0.02 0.08±0.03 1.240 0.223

3 討論

人體的腸道菌群在圍產(chǎn)期和嬰幼兒期逐漸建立和發(fā)育，新生兒早期腸道菌群構(gòu)成受到內(nèi)外多種因素的影響［7］。HIV母嬰阻斷新生兒腸道菌群建立的過程中，主要受到以下三方面影響：①由于HIV感染母親的腸道黏膜免疫屏障受損及通透性增加，會伴隨出現(xiàn)母體腸道菌群失調(diào)［8］。研究發(fā)現(xiàn)，母體腸道菌群的DNA可以傳遞給胎兒，會直接影響其子代腸道菌群的建立［9］。另外，HIV感染母親孕期多有焦慮、緊張或抑郁等心理波動，這些也會影響其子代腸道菌群的定植。②HIV母嬰阻斷新生兒在宮內(nèi)及新生兒期均伴有ART暴露，目前常用的ART均有線粒體毒性；腸道菌群與線粒體之間存在交互效應(yīng)，線粒體可通過其代謝產(chǎn)物對腸道菌群的定植產(chǎn)生影響［1］。③目前HIV母嬰阻斷新生兒多為選擇性剖宮產(chǎn)出生，生后推薦人工喂養(yǎng)，分娩方式及喂養(yǎng)方式對其道菌群的正常建立也會產(chǎn)生影響［10］。因為以上多重因素的影響，HIV母嬰阻斷新生兒的腸道菌群可能有別于正常新生兒。由于腸道菌群與宿主之間存在物質(zhì)及能量等方面的相互作用，可直接或者間接地影響宿主的生理及代謝功能，其中也包括對人體神經(jīng)發(fā)育及功能產(chǎn)生影響［5］。因此，研究HIV母嬰阻斷新生兒早期腸道菌群的特征或可為防治HEU兒童神經(jīng)發(fā)育障礙提供一些新的思路。

本研究通過比較兩組新生兒腸道菌群的Alpha多樣性，發(fā)現(xiàn)母嬰阻斷組Observed Species指數(shù)與Chao1指數(shù)低于對照組，提示母嬰阻斷組新生兒存在一定程度的腸道菌群多樣性降低。胎兒期及出生后早期階段是神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵時期，一些重要的神經(jīng)連接會在此時建立；在此期間腸道菌群與人體之間相互作用，通過MGBA影響人體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。若在這些時期發(fā)生腸道菌群紊亂，會影響MGBA的信息交流，改變大腦正常發(fā)育軌跡，導致出現(xiàn)行為模式、認知水平、社交行為、探索行為或?qū)W習能力等方面的不良結(jié)局。研究顯示，腸道菌群減少及多樣性降低幼鼠在成年后會出現(xiàn)認知障礙和行為異常，無菌小鼠杏仁體內(nèi)多種基因轉(zhuǎn)錄水平顯著改變，其中許多基因與大腦生理活動如神經(jīng)信號傳遞、神經(jīng)元可塑性及神經(jīng)元代謝等有關(guān)；正常腸道菌群的缺失與中樞神經(jīng)遞質(zhì)和受體的改變直接相關(guān)，菌群的改變會導致機體行為改變［11］。這提示HIV母嬰阻斷新生兒的腸道菌群多樣性降低可引起其代謝產(chǎn)物或神經(jīng)遞質(zhì)的異常，可能是其日后神經(jīng)發(fā)育障礙及行為異常發(fā)生的原因之一。

本研究結(jié)果顯示，兩組在門水平腸道優(yōu)勢菌群比較，母嬰阻斷組擬桿菌門的相對豐度低于對照組。擬桿菌門是健康人群的優(yōu)勢菌門，其主要作用包括幫助宿主分解多糖、提高營養(yǎng)利用率、保持腸黏膜完整性、促進免疫系統(tǒng)發(fā)育及維持腸道微生態(tài)平衡等。擬桿菌具備較強的發(fā)酵能力，是腸道分解膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs）的關(guān)鍵菌群［12］。SCFAs主要為丁酸、丙酸和乙酸等碳原子數(shù)為1～6個的游離脂肪酸，其既可以提供機體所需的能量及維持腸道的穩(wěn)定性，也是人體的新型信號分子，腸道菌群可通過產(chǎn)生SCFAs參與人體諸多的生理及病理反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs具有神經(jīng)活性，特別是丁酸、乙酸和丙酸，可以經(jīng)過相應(yīng)的受體來調(diào)節(jié)基因的表達，并通過MGBA影響人體神經(jīng)功能［13］。研究顯示，SCFAs能促進大腦小膠質(zhì)細胞的發(fā)育和生長，維持細胞穩(wěn)態(tài)，增強大腦免疫防御功能；無菌小鼠由于缺少SCFAs受體會引起小膠質(zhì)細胞的缺陷，可導致先天性神經(jīng)免疫應(yīng)答受損，誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾?。?4］。此外，SCFAs還可通過G蛋白偶聯(lián)通路起到調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)的作用，甚至可通過組蛋白去乙?；确绞狡鸬奖碛^遺傳修飾的作用［15］。母嬰阻斷組新生兒擬桿菌門豐度降低，可直接影響其短鏈脂肪酸的生成水平，從而影響其神經(jīng)發(fā)育和功能。

兩組在科及屬水平腸道優(yōu)勢菌群比較顯示，母嬰阻斷組雙歧桿菌科、雙歧桿菌屬及梭菌屬的相對豐度均低于對照組。雙歧桿菌是母乳喂養(yǎng)新生兒腸道中最豐富的定植菌群，其可以消耗人乳中的復(fù)雜寡糖，為人體提供能量［16］。而HIV母嬰阻斷新生兒大都缺乏母乳喂養(yǎng)，這可能是導致其雙歧桿菌豐度下降的原因之一。雙歧桿菌作為人體腸道中最重要的益生菌之一，除了具有維持腸道菌群平衡、抵抗腸道病原菌定植與入侵及增強腸道上皮屏障功能外，還可以通過其代謝產(chǎn)物直接或間接的對神經(jīng)功能產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，對母嬰分離小鼠補充雙歧桿菌可以有效提高腦干和基底核中去甲腎上腺素水平，逆轉(zhuǎn)其行為異常［17］。雙歧桿菌還可利用谷氨酸鈉合成γ-氨基丁酸（GABA），GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中關(guān)鍵的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與調(diào)節(jié)機體諸多神經(jīng)生理活動，對維持神經(jīng)系統(tǒng)正常功能有重要的作用［18］。梭菌屬是腸道中發(fā)現(xiàn)的最豐富的菌屬之一，是人體腸道最主要的產(chǎn)丁酸細菌；其產(chǎn)生的丁酸不僅可為腸細胞提供能量、抑制炎癥因子釋放及保護腸黏膜屏障，還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫、影響神經(jīng)細胞可塑性和影響神經(jīng)發(fā)育的功能［19］。所以，母嬰阻斷組新生兒雙歧桿菌科/屬及梭菌屬的相對豐度降低可能會對其近期及遠期的神經(jīng)發(fā)育和功能產(chǎn)生影響。

綜上所述，與普通新生兒相比，HIV母嬰阻斷新生兒早期的腸道菌群多樣性降低，擬桿菌門、雙歧桿菌科、雙歧桿菌屬及梭菌屬相對豐度降低，這些差異可能會導致腸道菌群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物或神經(jīng)遞質(zhì)異常，并通過MGBA途徑對HIV母嬰阻斷新生兒的大腦發(fā)育、認知水平及行為模式等神經(jīng)發(fā)育過程產(chǎn)生不利影響。應(yīng)用微生態(tài)制劑早期干預(yù)、調(diào)節(jié)腸道菌群，進而通過MGBA途徑對中樞神經(jīng)產(chǎn)生影響，有望成為改善HEU兒童神經(jīng)發(fā)育預(yù)后的有效手段之一。因本研究為初步探索性研究，仍存在一定的局限性，比如對腸道菌群的檢測僅選取了一個時間點，未進行多時點動態(tài)檢測；對腸道菌群的檢測深度僅至屬分類水平等，后期計劃加大納入的樣本量、增加檢測的時間點及樣本檢測的深度，以進行更加深入的研究。