程 慧,馮 灝,李詩瑤,劉 順,周陶鴻,彭青枝
(1.湖北省食品質量安全監(jiān)督檢驗研究院,湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心,湖北 武漢 430070;2.荊州職業(yè)技術學院,湖北 荊州 434000)
氟蟲腈是1989年由法國羅納普朗克公司生產的苯基吡唑類廣譜類殺蟲劑,因其可通過胃毒作用抵御害蟲的抗藥性,我國于1994年開始引入使用。現(xiàn)代毒理學研究表明,氟蟲腈對害蟲的神經(jīng)膜氯離子通道有強烈的阻礙作用,因其屬于內吸性農藥,在動物性及植物性農產品中殘留量日益得到關注[1-3]。食品中氟蟲腈及其代謝物的殘留可能會引起人體器官不同程度的損傷,國際食品法及我國食品安全標準規(guī)定氟蟲腈在蛋類中限量為0.02 mg/kg,并且我國于2009年開始禁用氟蟲腈。近年來氟蟲腈再次得到關注,主要源于歐洲地區(qū)發(fā)現(xiàn)了被氟蟲腈污染的雞蛋,經(jīng)過相關部門調查表明目前市場上所用消毒液中可能含有氟蟲腈,養(yǎng)雞場使用混有氟蟲腈的消毒液后進而間接引起雞蛋污染[4-6]。在“毒雞蛋”事件之前,我國對于雞蛋的污染物檢測項目中未規(guī)定氟蟲腈的檢測方法及最大殘留限量,但這并不表示我國生產的雞蛋不存在氟蟲腈的污染[7-9]。
市場監(jiān)管總局在2019年12月發(fā)布了關于公開征集23 項食品快速檢測方法的公告,其中13 項明確規(guī)定使用膠體金免疫法,將通過化學方法合成羧基修飾的目標分子與牛血清白蛋白鍵合成免疫原,膠體金免疫法的技術核心是合成羧基修飾的目標分子,即實現(xiàn)目標分子與羧基的連接。然而以小分子為模板形成的半抗原篩選抗體存在不確定性,每一次進行動物免疫實驗的結果得出的抗體特異性存在差異,以此為基礎建立的膠體金免疫法快速檢測目標分子的不確定性同時也會增加。通過核酸適配體建立的比色法快速分析食品中小分子污染物是目前現(xiàn)場檢測研究的重點項目,核酸適配體是體外合成的人工抗體,經(jīng)過篩選試劑盒的分析得到與目標分子特異性結合的核酸適配體,建立適配體傳感器放大識別信號直接獲得目標分子的濃度,通過對識別信號的轉導衍生出電化學法、熒光法、比色法等適配體傳感器[10-13]。
在核酸適配體傳感器中與目標分子特異性結合的適配體還有相對應的信號適配體,信號的轉導可通過修飾信號適配體實現(xiàn)。適配體因合成的特殊性易于標記和修飾,連接活性基團后結合納米材料和生物酶是適配體傳感器實現(xiàn)信號放大的常用方法,將生物酶催化底物顯色反應與適配體結合實現(xiàn)比色傳感器非常符合食品中小分子污染物快速檢測的要求,直接目視比色以快速判定食品中小分子污染物的含量,為食品的現(xiàn)場檢測分析帶來新的思路[13-16]。生物酶直接標記納米材料是有限的,若將生物酶提前聚合再與納米材料結合所達到的催化效果將遠大于直接標記,同理在催化反應完成后將產物再次富集沉淀,加入終止劑分解與顯色劑顯色,這比直接催化底物顯色更加穩(wěn)定[17-19]。另外將識別小分子污染物的核酸適配體與納米磁珠結合,使整個體系的分離與檢測更加便利,進一步實現(xiàn)信號的放大和識別效應的加強[20]。本實驗基于納米磁珠-適配體識別雞蛋中氟蟲腈,利用金納米粒子-聚合酶螯合物連接信號適配體與識別基質結合后,因聚合酶螯合物上聚集的脲酶可催化分解尿素,向反應體系中加入銅離子生成沉淀,加入銅離子顯色劑后沉淀分解產生紅色配合物,此時紅色配合物的吸光度大小間接反映了與識別基質結合的氟蟲腈含量大小,通過2 種納米材料及聚合酶螯合物的信號放大,使本方法對于雞蛋中氟蟲腈的檢測限可應用于食品中小分子污染物的快速檢測(圖1)。本實驗所用檢測方法目前國內外鮮見報道,但是利用聚合酶螯合物實現(xiàn)食品中小分子污染物快速檢測分析是近幾年研究信號放大降低檢測限的熱點[14],此檢測方法的創(chuàng)新之處在于首次將可視化的分光檢測與酶催化反應相結合實現(xiàn)基于核酸適配體的小分子污染物快速檢測,對于其他農藥或獸藥的檢測尚在研究探索[18-20]。
圖1 基于互補鏈反應及聚合酶螯合物顯色反應的比色分析原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of colorimetric analysis based on complementary chain reaction and chromogenic reaction of polymerase chelate
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羧基磁珠(粒徑1.0~2.0 mm,10 mg/mL) 美國C h a r m 生物科技有限公司;4-嗎啡啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid,MES)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxy succinimide,NHS)、尿素(98%)、6-巰基己醇 美國Sigma-Aldrich公司;聚合酶螯合物 上?;蚩萍加邢薰荆宦冉鹚帷⑽逅狭蛩徙~、三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane,Tris)、鹽酸、胱氨酸、碳酸鉀、銅離子顯色劑 國藥集團化學試劑上海有限公司;氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚標準品 北京中科質檢生物技術有限公司;聚合酶螯合物(EnVisionTM) 北京華安麥科生物技術有限公司。
實驗中所用氟蟲腈適配體(1)和互補適配體(2)均由上海生工生物工程有限公司提供,根據(jù)以下堿基序列定制合成:(1)5’-S H2-(C H2)6-ACGCGAATCGGAGTTGGGGGT-3’;(2)5’-NH2-(CH2)6-ACCCCCAACTCCGATTCGTCGGCT-3’。
HC-100恒溫混勻儀 杭州佑寧儀器有限公司;UV-1901紫外-可見分光度計 北京普析通用儀器有限公司;4500液相色譜-串聯(lián)質譜 美國AB SCIEX公司。
1.3.1 氟蟲腈適配體的篩選
隨機文庫的固定:取2 nmol初篩文庫與6 nmol生物素標記序列混合后,在金屬浴中95 ℃水浴10 min,30 ℃振蕩反應1 h,直到初始文庫與生物素標記序列互補配對。進一步與鏈霉親和素標記的磁珠在30 ℃條件下振蕩反應1 h,用50 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖溶液(50 mmol/L NaCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2和5 mmol/L CaCl2)洗滌3 次,磁分離后除去未結合部分。正向篩選:取100 μg/kg氟蟲腈溶液加入到初篩的隨機文庫中,在恒溫振蕩器中30 ℃反應1 h后,于4 ℃反應過夜,磁分離后得到氟蟲腈結合的適配體上清液。反向篩選:取100 μg/kg氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈硫醚混合液加入到初篩的隨機文庫中,在恒溫振蕩器中30 ℃反應1 h后,于4 ℃反應過夜,磁分離后得到未結合的適配體,再對其進行正向篩選得到結合的適配體。分離:將上清液加入2 μL 5 mg/mL糖原、50 μL 3 mol/L醋酸鈉和1 400 μL無水乙醇,混勻后-20 ℃靜置過夜,12 000 r/min冷凍離心10 min,棄去上清液,再加入1 mL 70%乙醇溶液復溶后12 000 r/min冷凍離心10 min,最后用100 μL無菌ddH2O復溶待用。以80、60、40 μg/kg和20 μg/kg的氟蟲腈溶液重復對初篩核酸文庫進行正向篩選、反向篩選[21-24]。
PCR擴增反應液體系:氟蟲腈親和性適配體模板鏈20 μL,20 μg/mL上、下游引物各20 μL,2h EsTaqMaster Mix (Dye) 25 μL,用無菌ddH2O補至100 μL。PCR擴增條件為三階段循環(huán):94 ℃變性330 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸320 s。利用凝膠電泳分離和寡聚核苷酸純化試劑盒純化后進行測序。
1.3.2 信號適配體探針的制備
首先,將取500 μL已溶解的100 mL 1%氯金酸溶液,加入49.5 mL二級水,待該溶液加熱至沸騰后邊攪拌邊加入1.25 mL 10 mg/L檸檬酸鈉溶液,繼續(xù)加熱至沸騰后停止加熱,冷卻至室溫待用。取2.0 mL制備好的金納米粒子,加入0.1 mol/L K2CO3溶液調節(jié)pH值至8.5后與150 μg聚合酶螯合物攪拌過夜,離心除去未結合的物質。接著,取3 μg巰基化的互補適配體加入金納米粒子-聚合酶螯合物體系中4 ℃振蕩過夜,離心分離后加入巰基己醇封閉多余位點;最后得到金納米粒子-聚合酶螯合物-信號適配體復合物,4 ℃靜置過夜保存待用[25-28]。
1.3.3 磁珠與識別適配體的結合
識別氟蟲腈的適配體經(jīng)過氨基修飾可與羧基化磁珠通過化學鍵結合,利用EDC和NHS進行酰胺反應活化羧基磁珠,之后在其表面共價結合識別適配體制備反應基質。取4 μL 25 mg/mL羧基功能化磁珠,加入100 μL溶于pH 6.0 MES溶液中的2 mg/mL EDC和1 mg/mL NHS活化磁珠2 h,分離洗滌磁珠,加入10 μg識別適配體,在恒溫振蕩器中保持4 ℃振蕩過夜,用pH 6.0 Tris-HCl緩沖溶液反復洗滌磁珠-適配體復合物,加入胱氨酸作為封閉劑,再洗滌分離得到復合物4 ℃保存待用[29-31]。
1.3.4 比色適配體傳感器的信號轉導
將上述實驗合成的過量金納米粒子-聚合酶螯合物-信號適配體與100 μL磁珠-適配體復合物混合,室溫振蕩2 h,磁分離得到信號適配體與識別適配體的結合物。進一步與100 μL不同濃度的氟蟲腈溶液和雞蛋提取液在室溫振蕩反應30 min,由于識別適配體與氟蟲腈的特異性識別使金納米粒子-聚合酶螯合物-信號適配體分離出來,隨后向分離的探針中加入30 mmol/L尿素和20 mmol/L銅離子混合溶液100 μL,室溫振蕩反應10 min離心分離,加入銅離子顯色溶液所得產物用于比色分析,建立吸光度與氟蟲腈濃度之間的線性關系。
雞蛋樣品前處理:稱取3 g打散的雞蛋置于15 mL離心管中,加入2 mL乙酸乙酯,輕微顛倒30余次提?。嵉共荒軇×乙苑廊榛? 000 r/min離心5 min,取0.5 mL有機層溶液空氣吹干,用0.2 mL pH 6.0 Tris-HCl緩沖溶液復溶渦旋混勻待檢。
通過檸檬酸鈉還原法制備金納米粒子,由于聚合酶螯合物中富集大量脲酶和抗體,金納米粒子和聚合酶螯合物通過靜電吸附作用結合后形成復合物,復合物與信號適配體的巰基通過Auü S鍵結合形成新的信號探針,實驗通過透射電鏡及紫外分光光度計驗證復合物與信號探針的結合過程。如圖2所示,金納米粒子的平均粒徑約為13 nm,連接聚合酶螯合物之后平均粒徑明顯增加,表明金納米粒子與聚合酶螯合物成功結合。如圖3所示,金納米粒子在波長500 nm左右有一個特征吸收峰(曲線a),互補適配體在波長350 nm處有一個特征吸收峰(曲線c),信號探針合成后的紫外表征曲線b在波長350 nm和500 nm處均有吸收峰,證明信號探針的制備符合實驗要求。
圖2 金納米粒子(A)、互補適配體探針(B)透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron microscopy images of gold nanoparticles (A) and complementary aptamer probes (B)
圖3 金納米粒子紫外吸收光譜圖Fig.3 UV absorption spectra of gold nanoparticles
圖4 50 mg/kg氟蟲腈、空白對照用于比色分析的紫外-可見吸收光譜曲線Fig.4 UV-visible absorption spectra of flufenitrile at 50 mg/kg and blank control for colorimetric analysis
本方法基于適配體連接納米磁珠進行雞蛋中氟蟲腈的分析檢測,通過氟蟲腈核酸適配體引發(fā)雜交鏈反應,并進一步結合聚合酶螯合物雙功能化金納米粒子標記物制備的納米探針復合物,用于所得產物溫育反應?;诖胖檫B接的核酸適配體與其互補鏈之間的結合作用,使得金納米探針得以成功捕獲從而形成磁性復合物。利用該復合物上定量捕獲的高含量脲酶分子的酶催化生物礦化作用,以及進一步溶解釋放礦化富集的銅離子進行腙類顯色劑(E)-1,2-二苯基-2-(2-(吡啶-2-基)亞肼基)乙酮E配位顯色反應,從而可以成功實現(xiàn)本方法的比色信號轉導。實驗通過紫外-可見吸收光譜法考察本方法發(fā)展的上述信號轉導策略對靶向分析物氟蟲腈的信號響應情況。如圖4所示,當將50 mg/kg氟蟲腈用于比色反應后,所得顯色溶液產物在波長502 nm處出現(xiàn)了一個很強的紫外-可見吸收峰;當沒有將所得磁性復合物經(jīng)過稀酸溶解處理時,所得產物溶液在300~700 nm波長范圍內沒有出現(xiàn)明顯的特征吸收。同時,當在構建的磁珠平臺上進行空白對照實驗時,所得產物經(jīng)顯色處理之后只得到十分微弱的背景信號。這一結果充分證明了本磁珠分析平臺上夾心免疫識別反應的成功進行以及該工作設計的比色信號轉導策略的可行性。
為了保證金納米粒子-聚合酶螯合物納米標記物的最佳酶催化信號轉導能力,實驗首先將不同用量的聚合酶螯合物和過量適配體互補鏈依次加入到1.5 mL制備好的金納米粒子中進行納米標記物的制備,然后將制備的幾種不同產物分別用于50 mg/kg氟蟲腈在構建的磁性分析平臺上的比色分析信號轉導。從圖5A可以看出,實驗所得顯色產物的吸光度響應值首先隨著聚合酶螯合物用量的增加而增大;當適配體互補鏈的用量大于3 μg后,顯色產物的吸光度響應開始緩慢下降。導致這一現(xiàn)象的原因應該是:當金納米粒子表面負載的適配體互補鏈量較少時,不能提供足夠的脲酶以用于分解尿素產生顯色物質;但是,由于金納米粒子表面空間的制約,過量的適配體互補鏈則會導致制備所得的納米標記物上聚合酶螯合物的負載量減少,從而減弱傳感器的信號轉導能力。本實驗以3 μg適配體互補鏈和150 μg聚合酶螯合物作為納米標記物制備的最佳用量。
在進行互補鏈反應時,充當生物識別的氟蟲腈適配體用量和雜交鏈反應時間均為影響反應效率的重要因素。實驗首先研究了在不同濃度氟蟲腈適配體條件下,50 mg/kg氟蟲腈在構建的磁珠分析平臺上的紫外-可見光譜響應。如圖5B所示,隨著氟蟲腈適配體用量不斷增加,所得顯色產物的吸光度也隨之增加;當氟蟲腈適配體用量大于10 μg之后,其所得顯色產物吸光度開始趨向于一個穩(wěn)定值。該結果說明,用量為10 μg的氟蟲腈適配體足夠識別磁珠平臺上捕獲的氟蟲腈,以實現(xiàn)其比色信號轉導。為此,將10 μg氟蟲腈適配體用量用作本工作的最佳實驗條件。同時,還對互補鏈反應時間進行優(yōu)化。如圖5C所示,隨著反應時間的延長,所得顯色產物的吸光度不斷增加;當該時間延長至50 min之后,吸光度響應開始趨于穩(wěn)定。這說明50 min足以使互補鏈反應完全進行,從而達到該方法的最佳信號轉導與放大。圖5D顯示磁珠復合物與互補鏈及聚合酶螯合物修飾的金納米粒子和氟蟲腈反應時間變化對信號響應的影響,隨著反應時間的延長,信號響應隨之增加;當反應時間延長至30 min后信號響應強度趨于穩(wěn)定,這表示適配體與氟蟲腈反應飽和。因此,選擇30 min作為最佳反應時間。
圖5 各因素對50 mg/kg氟蟲腈紫外-可見吸收響應的影響Fig.5 Effects of various factors on the UV-visible absorption response of flufenitrile at 50 mg/kg
在上述最佳條件下,實驗考察不同濃度氟蟲腈在制備的磁性傳感平臺上的紫外-可見吸收光譜響應。結果表明,在0.1 μg/kg~50 mg/kg范圍內,其吸光度與氟蟲腈含量的對數(shù)值之間成良好線性關系,線性回歸方程為A=0.582 33+0.010 21lgC,R2=0.998。在3 倍信噪比條件下,計算得到本方法的檢測限為0.072 μg/kg。
為了進一步驗證本實驗開發(fā)比色適配體傳感器的特異性和選擇性,選擇相同類型的50 mg/kg溴蟲腈、氟蟲脲、定蟲隆、三氟氯氰菊酯作為交叉反應的目標物,日常監(jiān)督抽檢過程中陽性樣品中此5 種農藥的檢出率較高,且目前用于該5 種農藥的快速檢測方法仍在研究中,故選擇此5 種類型農藥作為檢驗氟蟲腈的特異性。實驗分別考察在構建的磁珠免疫分析平臺上交叉反應。從圖6可以看出,氟蟲腈目標分析物在磁珠平臺上具有十分明顯的吸收光譜響應,而溴蟲腈、氟蟲脲、定蟲隆、三氟氯氰菊酯沒有表現(xiàn)出較空白對照實驗更為明顯的信號響應。這一結果表明,該比色分析方法具有較好的特異性。為進一步證明該方法對于化學結構類似物的特異性,分別研究氟蟲腈的主要代謝物如氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈在含量為5 mg/kg時本方法檢測結果均為陽性,說明本檢測方法與GB 23200.115ü 2018《雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯(lián)用法》同樣適用于氟蟲腈和氟蟲腈的主要代謝物的檢測。
圖6 試劑空白和5 種農藥在磁珠分析平臺上的吸收強度響應Fig.6 Absorption intensity of reagent blank, bromozoonitrile fluolin and fluozoonitrile at 50 mg/kg on the magnetic bead analysis platform
同時,本工作還利用發(fā)展的信號策略考察不同含量氟蟲腈在通過相同實驗方法構建的磁珠傳感平臺上的重復實驗結果。當氟蟲腈含量分別為0.01、0.1 mg/kg和10 mg/kg時,5 次重復測定結果的相對標準偏差分別為3.6%、4.2%和2.7%。此外,制備的適配體磁珠和金納米粒子標記物均于4 ℃條件下保存,2 周之后,將其用于含量為50 mg/kg氟蟲腈的分析測定,仍然可以保持97.5%以上初始信號響應。這些結果表明,該比色免疫分析方法具有較為滿意的重復性和穩(wěn)定性。為進一步考察該方法的分析可靠性和準確性,實驗還將其用于從農貿市場和超市購買的雞蛋進行檢測。按照1.3.4節(jié)方法處理。按照GB 23200.115ü 2018《雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯(lián)用法》作為參考方法對樣品進行檢測。氟蟲腈加標樣品含量分別為5.0、20.0 mg/kg和50.0 mg/kg,通過本方法、傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫和參考方法對加標前后的含量分別進行檢測。如表1所示,樣品回收率為93.1%~100.6%,3 種方法的檢測結果一致,表明該方法用于雞蛋中氟蟲腈的檢測是可行的,本方法在操作簡便性和準確性上均符合市場需求,能夠滿足基層市場對于現(xiàn)場快速檢測的基本需求。
表1 本方法與參考方法測定雞蛋中氟蟲腈含量結果對比Table 1 Comparison of recoveries and RSD values of fluoronitrile in spiked eggs by this method and conventional methods
表2 本方法測定雞蛋加標樣品的假陰性率和假陽性率Table 2 False negative rates and false positive rates calculated for detection of negative egg samples spiked with various concentrations of fluoronitrile by this method
將經(jīng)過預處理的雞蛋陰性樣品中分別加入不同含量氟蟲腈標準溶液進行檢測,根據(jù)原食藥總局頒布的《食品快速檢測方法評價技術規(guī)范》[32]中快速檢測方法性能指標計算假陰性率(假陰性總數(shù)/試驗樣品總數(shù))和假陽性率(假陽性率總數(shù)/試驗樣品總數(shù)),每個濃度設置20 組實驗,本實驗陽性樣品參照GB 2763ü 2019《食品中農藥最大殘留限量》[33]制定(蛋類中氟蟲腈殘留量≤0.02 mg/kg)。如表2所示,本實驗構建的雞蛋中氟蟲腈快速檢測方法與傳統(tǒng)實驗室檢測方法相比較,得出本檢測方法的假陰性率和假陽性率分別為5%和10%,符合2017年及2019年頒布的KJ系列食品快速檢測方法技術要求(≤10%)。
基于磁珠的互補鏈反應、識別及顯色反應,本實驗成功建立一種可用于氟蟲腈高靈敏檢測的比色分析新方法。本檢測方法基于磁珠構建分析平臺簡化了相關操作,從而進一步縮短溫育反應時間;引入適配體可提高識別作用的特異性,為結合互補鏈反應和納米標記物的酶致生物礦化作用進行分析信號的放大提供了可能性?;阢~離子的高效富集、方便釋放與快速、可視化的顏色反應,進行比色信號轉導策略的構建,較好彌補了傳統(tǒng)方法中直接利用酶催化顯色反應進行比色信號的檢出限偏低。故本方法有望在食品中小分子污染物分析領域發(fā)揮較好的實用價值。