吾買爾江·牙合甫，王曉杰，古萊姆拜爾·謝日普，阿麗米熱·買買提，韓俊成，楊 莉，羅金生，買吾蘭·孜克牙

（1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052；2．新疆哈密市畜牧工作站，新疆 哈密839000；3．哈密動物疫病預(yù)防控制中心，新疆 哈密839000）

羔羊大腸桿菌病的病原為致病性大腸桿菌，產(chǎn)志賀毒 素大腸桿菌（shiga-like toxigenicE.Coli，STEC）引起的腹瀉病較嚴重，傳染源主要來自病羊和帶菌羊。傳染途徑包括經(jīng)帶菌母畜哺乳或使用被污染的飼養(yǎng)器皿引起消化道感染，臨床表現(xiàn)為腸炎型和敗血型，也可繼發(fā)肺炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及腎炎等疾病[1]。STEC是一種高致病性人畜共患病原微生物。雖然多數(shù)豬、牛、羊等養(yǎng)殖場發(fā)生的群體性致病菌傳播STEC普遍以血清型O157∶H7為主爆發(fā)，但非O157 STEC食源污染事件正日益增多，且病例持續(xù)呈上升[1-2]。據(jù)報道，2000～2010年非O157 STEC發(fā)病率從0.12/10萬增加到0.95/10萬[3]。牛為STEC貯存宿主，攜帶率達71%以上，STEC對反芻動物的高危害性引起世界廣泛關(guān)注[4]。志賀毒素是STEC主要的毒力基因，毒力因子包括stx1和stx2，stx1能引起腹瀉但不表現(xiàn)全身系統(tǒng)感染癥狀；stx2是致病性大腸桿菌發(fā)揮致病性主要的毒力因子，其更容易引起溶血性尿毒綜合征、出血性腸炎、血小板減少性紫癜、神經(jīng)系統(tǒng)病變等疾病。毒素感染腎臟內(nèi)皮細胞、腎小球和腎小動脈，導(dǎo)致病變[5-6]。與志賀毒素致病性相關(guān)的EHEC溶血素hylA基因，則主要引起腸外疾病，造成宿主多種細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)損傷，誘導(dǎo)促進炎癥細胞因子的釋放。吸附和抹殺基因（eae）編碼的緊密黏附素可導(dǎo)致人腸上皮細胞產(chǎn)生黏附、抹平損傷，在致病過程中發(fā)揮重要作用[7]。

本試驗選取新疆某地區(qū)規(guī)?；庋蝠B(yǎng)殖場7、14日齡腹瀉羊羔為研究對象，分析隨日齡增加受致病菌感染程度，利用實驗室分析技術(shù)篩查非O157 STEC相關(guān)stx1、stx2、eae、hlyA毒力基因，致力于提高羔羊成活率，為地方養(yǎng)殖戶控制和預(yù)防致病性大腸桿菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與試劑

試驗儀器：T100梯度PCR儀（美國BIO-RAD）、凝膠成像儀系統(tǒng)（美國BIO-RAD）、高速離心機（德國Eppendorf）、DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）、電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）等。

試驗試劑：LB肉湯、麥康凱、伊紅美藍等培養(yǎng)基購自奧博星生物技術(shù)有限公司；Taq Master Mix、DNA Marker 2000、瓊脂糖、EZ-Vision DNA染料購自天根生物有限公司；菌株O157∶H7 CICC21530標準菌株由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院蘇占強副教授提供。

1.2 試驗方法

采集新疆某區(qū)規(guī)模化肉羊養(yǎng)殖7、14日齡腹瀉癥狀羔羊肛拭子新鮮糞便45份，4℃冷藏帶回實驗室。采用麥康凱、伊紅美藍培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)發(fā)分離鑒定，另備一份采用TE Buffer緩沖液菌體裂解法制作DNA模板。引物序列和目的片段見表1，由上海生物工程有限公司合成。

表1 PCR引物序列和目的片段Tab.1 PCR primer sequence and product length

1.3 PCR反應(yīng)條件

16S rDNA擴增條件：PCR反應(yīng)體系共25.0μL。Taq MasterMix12.5μL、引物1.0μL、細菌DNA模板1.0μL、ddH2O 9.5μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，54℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min，1.0%瓊脂糖照膠分析[8]。

stx1、stx2、eae擴增條件：PCR反應(yīng)體系共25.0μL。Taq MasterMix10.0μL、引 物0.4μL、細 菌DNA模 板1.0μL、ddH2O 13.2μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共34個循環(huán)；72℃延伸10 min，1.0%瓊脂糖照膠分析[9]。

hlyA擴 展 條 件：PCR反 應(yīng) 體 系 共25.0μL。Taq MasterMix12.5μL、引 物0.5μL、細 菌DNA模 板1.0μL、ddH2O 10.5μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30循環(huán)；72℃延伸3 min，1.5%瓊脂糖照膠分析[10]。

rfbE、fliC擴 增 條 件：PCR反 應(yīng) 體 系 共25.0μL。Taq MasterMix12.5μL、引 物1.0μL、細 菌DNA模 板1.0μL、ddH2O 9.5μL。rfbEPCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。fliCPCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min，1.5%瓊脂糖照膠分析[11]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 19.0的Pearson's卡方檢驗對STEC陽性率進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果（見圖1）

本試驗對腹瀉癥狀羔羊采集的45份糞便樣品采用生化方法篩查，PCR方法進行大腸桿菌分離（16S rRNA）。

由圖1可知，擴增16S rRNA（1 439 bp）目的基因條帶，符合預(yù)期大小。最終腹瀉癥狀羔羊糞便樣品共分離大腸菌株40份，陽性率88.90%。

圖1 16S rRNA的檢測Fig.1 Detection of 16S rRNA

2.2 編碼毒力基因stx1、stx2、eae、hlyA檢測結(jié)果（見圖2、圖3）

由圖2、圖3可知，采用標準株大腸埃希菌CICC21530作為陽性模板進行毒力基因檢測鑒定，擴增出目的條帶stx1（655 bp）、stx2（477 bp）、hlyA（526 bp），未擴增出eae毒力基因。

圖2 編碼毒力基因stx1、stx2擴增結(jié)果Fig.2 PCR test results of stx1、stx2 virulence genes

圖3 編碼毒力基因hlyA擴增結(jié)果Fig.3 PCR test results of hlyA virulence genes

2.3 新疆某羊養(yǎng)殖場7、14日齡羔羊STEC毒力基因結(jié)果（見表2）

表2 新疆某羊養(yǎng)殖場7、14日齡羔羊STEC毒力基因結(jié)果Tab.2 STEC virulence gene results of 7 and 14-day-old lambs in a sheep farm in Xinjiang 單位：%

本試驗共分離到大腸菌株40株，其中7日齡17株，14日齡23株。由表2可知，7、14日齡羔羊糞源陽性菌株分離編碼毒力基因stx1、stx2、hlyA分離較高（30.00%），其中擴增出編碼毒力基因stx2和stx2+hlyA各3株（7.50%），編碼毒力基因stx1、stx1+stx2、stx1+hlyA各2株（5.00%）。不同日齡腹瀉羔羊分析，7日齡腹瀉羔羊大腸菌株編碼毒力基因陽性率較低，檢出編碼毒力基因stx1、stx2和stx1+hlyA各1株（5.88%），未檢測出stx1+stx2、stx2+hlyA。14日齡腹瀉羔羊大腸菌株均擴增出編碼毒力基因，結(jié)果分析陽性率較低，其中stx2+hlyA編碼毒力基因陽性率為13.04%，其次stx2、stx1+stx2編碼毒力基因陽性率為8.70%。

2.4 O157鑒定結(jié)果（見圖4）

由圖4可知，對分離鑒定的編碼毒力基因stx1和stx2的40株大腸桿菌進行O157（rfbE）、H7（fliC）鑒定發(fā)現(xiàn)，擴增出9株H7（fliC）非特異性目的條帶，未擴增出O157特異性目的條帶，視為非O157產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌。

圖4 O157鑒定結(jié)果Fig.4 Results of O157 identification

3 討論

腸桿菌源致病菌以STEC O157∶H7為主，可通過食物傳播[12]。STEC產(chǎn)生的產(chǎn)志賀毒素（STX）與人畜共患傳染病相關(guān)，主要毒力因子包括志賀毒素stx1、stx2[13]。據(jù)報道，STEC O157∶H7是主要的爆發(fā)血清型[14]。研究表明，STEC非O157血清型同樣可引起人畜共患傳染病的傳播[15]。牛、羊、駱駝等反芻動物是STEC的天然宿主，STEC可在牛、羊的漿液中存活較長時間，并產(chǎn)生stx，牛消化系統(tǒng)缺乏志賀毒素受體，因此牛不會表現(xiàn)出相應(yīng)疾病癥狀，攜帶病原菌的牛的排泄物可通過水源、土壤、飼草料等傳播[16-17]。STEC感染可導(dǎo)致人或家畜危及生命的并發(fā)癥，如HC和HUS。0.3%～9.9%牛的糞便中可檢測出STEC，在綿羊肉、糞便中也可檢測出STEC[18-19]。羊養(yǎng)殖場STEC檢出率為37.3%，stx以stx1為主，stx檢出率達65.2%[20]。巴西綿羊糞源STECstx1、stx2、ehxA檢出率87.7%[21]。本試驗中，7、14日齡段腹瀉羔羊陽性菌株（40份）中檢測到非O157 STEC菌株（30.00%），其中stx2和stx2+hlyA陽性率較高（7.50%），表明STEC在羔羊幼齡時期定植，新生羔羊可能是STEC感染人類的潛在性重要宿主[22]，推測該致病菌感染源來自母乳和乳房表皮。本試驗采納張妍等[23]報道的肉牛屠宰環(huán)節(jié)中非O157鑒定方法，共分離出40株編碼毒力基因stx1和stx2，未擴增出O157（rfbE）特異性目的條帶，因此視為非O157產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌。巴西南部綿羊群50%STEC的試驗動物中分離出陽性菌，并感染全部養(yǎng)殖場[18]。不同國家的綿羊養(yǎng)殖場STEC感染率普遍較高[24]。本研究分離株中stx2、hlyA編碼毒力基因占主導(dǎo)地位。目前，stx亞型stx2a、stx2c、stx2d更易引起人類感染。報道顯示，攜帶Stx2b的STEC與溶血性尿毒綜合征散發(fā)病例存在關(guān)聯(lián)性[25]。本研究未對stx亞型基因進行擴增分析，無法推斷其亞型表達情況。hylA毒力基因誘導(dǎo)促進炎癥細胞因子的產(chǎn)生，是反芻動物源STEC常見基因之一。本試驗未擴增出編碼毒力基因eae，數(shù)據(jù)結(jié)果與前期研究者一致[18,22]。eae毒力基因的存在與致病強度直接相關(guān)，但不能斷定存在高致病性風(fēng)險。Bekal等[26]報道，羊源eae菌株與人類的HC和HUS有關(guān)。相關(guān)研究顯示，363樣品中eae陽性率為9.92%，羊尸體陽性率為18.9%。eae基因存在于腸道致病性大腸桿菌中[27]。鑒定EPEC必須檢測eae基因是否呈陽性[28]。本研究從7、14日齡腹瀉羔羊糞便中分離出編碼毒力基因stx1、stx2和hlyA，隨羔羊日齡增長其陽性檢出率增高（17.65%至39.13%）。目前，預(yù)防STEC仍需提高飼養(yǎng)管理水平，采取灌服巴氏消毒處理的母乳。免疫力較強的羔羊在育肥、屠宰加工過程中也可能通過各種方式感染，STEC污染達40%[29]。因此，飼養(yǎng)人員、羊毛交易商的健康也存在風(fēng)險[25,28]。為預(yù)防STEC擴散，病死羔羊應(yīng)無害化處理，少病原微生物交叉污染[30]。本研究不足以確定非O157 STEC在7～14日齡段腹瀉羔羊中的患病率，因此增加檢測樣本的數(shù)量和規(guī)模，獲得更全面的數(shù)據(jù)，對于分析養(yǎng)殖動物非O157 STEC感染的趨勢更有利。

4 結(jié)論

7、14日齡腹瀉羔羊源大腸桿菌中分離出stx1、stx2、hlyA相關(guān)編碼毒力基因12株，其中編碼毒力基因stx2和stx2+hlyA各3株，stx1、stx1+stx2、stx1+hlyA各2株，不同編碼毒力基因、不同日齡羔羊陽性率差異不大。