李永明 郭紹方 曲玉鳳 汪正威

（1 普洱學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，普洱 665000；2 中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園森林生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650223）

1 引言

蜜蜂是世界上最重要的傳粉昆蟲之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值，蜜蜂作為社會性昆蟲，其復(fù)雜的社會性及其智能行為，是研究巢口行為計(jì)數(shù)的模式生物，蜜蜂巢門口行為很常見，卻很少受到關(guān)注。蜜蜂巢門口行為按照數(shù)量的多少，可分為兩大類：一類是發(fā)生時(shí)動態(tài)數(shù)量少的，例如采集、守衛(wèi)、防御、盜蜂、理毛、移走、學(xué)習(xí)、認(rèn)知等行為[1]；另一類是發(fā)生時(shí)動態(tài)數(shù)量較多的，有飛逃、婚飛、爽飛（幼蜂試飛）、分蜂等行為[2]。

對于蜜蜂的采集行為和婚飛行為[3]，目前，采用較多的門控技術(shù)，如無線射頻識別技術(shù)多用于巢口對進(jìn)出蜜蜂個體進(jìn)行計(jì)數(shù)來推算其外出采集的時(shí)長、頻次來分析蜂群行為[4]，或者通過不同感應(yīng)器設(shè)置，來記錄標(biāo)記和未標(biāo)記蜜蜂進(jìn)出巢口的頻次等行為[4]。對于巢口外一定空間距離的行為，則多通過單個攝像頭進(jìn)行視頻和圖像采集，來記錄和分析巢門口的進(jìn)出頻次。視角往往局限于巢口較小的范圍（REF）[5]，對于巢門口的動態(tài)行為則相對關(guān)注較少。

蜜蜂待天氣晴朗時(shí)，將大量飛出蜂巢[6]。在巢口進(jìn)行初次出巢飛行，飛行時(shí)頭朝向蜂箱巢門口懸空飛翔，時(shí)高時(shí)低，主要完成自身排泄和認(rèn)巢，整個初次出巢飛行過程的持續(xù)時(shí)間與蜂群的強(qiáng)弱呈正相關(guān)，一般將持續(xù)數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)，此過程稱為蜜蜂的“爽飛”。此時(shí)由于數(shù)量眾多且飛行軌跡相對雜亂，形成一團(tuán)動態(tài)蜜蜂“爽飛云團(tuán)”。若采用無線射頻識別技術(shù)對爽飛精準(zhǔn)計(jì)數(shù)難度系數(shù)很大，通道太少堵塞蜜蜂巢口，影響蜜蜂正常爽飛行為，同時(shí)個體間疊加、串聯(lián)等導(dǎo)致的計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。目前尚未有精準(zhǔn)、快速對爽飛行為等蜜蜂巢門行為計(jì)數(shù)的方法。

本文受啟發(fā)于photoshop 平面像素計(jì)數(shù)法介紹一種利用立體像素測量出蜜蜂巢門口爽飛數(shù)量的高效、精準(zhǔn)的方法[7]，同時(shí)，提出以ImageJ（https://imagej.net）記錄蜜蜂巢門口爽飛的計(jì)數(shù)方法及該方法的使用條件和標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)流程。本研究擬為后續(xù)智能蜂箱開發(fā)、蜜蜂巢門口行為研究以及胡蜂-蜜蜂攻防關(guān)系研究提供一定參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的東方蜜蜂和西方蜜蜂均為帶蜂王的健康蜂群，位于中國科學(xué)院西雙版納植物園西南生物多樣性實(shí)驗(yàn)蜂場。通過兩臺Gopro 8 高速運(yùn)動相機(jī)于2020年7月至2020年9月對蜜蜂巢口行為進(jìn)行拍攝記錄。

2.2 研究方法

2.2.1 拍攝場景設(shè)置

將蜂群與三維系統(tǒng)觀測組合在一起，使蜂群適應(yīng)一周。待蜂群采集蜂正常出入采集后，在蜜蜂巢口布置好巢門口飛行記錄設(shè)備[8]，待蜂群出現(xiàn)爽飛時(shí)進(jìn)行拍攝。

2.2.2 高速運(yùn)動相機(jī)拍攝

使用高速運(yùn)動相機(jī)進(jìn)行側(cè)面和頂部拍攝（圖1）。通過俯視拍攝圖片和側(cè)面拍攝圖片從不同角度觀測爽飛行為，達(dá)到還原3D 場景的目的，從而更準(zhǔn)確的挖掘出爽飛數(shù)量變化曲線、時(shí)間。在進(jìn)行拍攝時(shí)，先架設(shè)好運(yùn)動相機(jī)，調(diào)整到合適位置及拍攝角度并設(shè)定好程序后，待東方蜜蜂爽飛時(shí)兩臺相機(jī)同時(shí)開機(jī)，確保兩臺相機(jī)的同步性，對爽飛拍攝直至結(jié)束；拍攝時(shí)實(shí)驗(yàn)員記錄當(dāng)天環(huán)境變化、行為發(fā)生起始時(shí)間，胡蜂的分布、出現(xiàn)頻率以及捕食蜜蜂情況。對于西方蜜蜂爽飛拍攝方法與東方蜜蜂相同，最終得到有效數(shù)據(jù)180 組。

圖1 東、西方蜜蜂蜂巢門口“爽飛云團(tuán)”側(cè)面（A、C）和頂部（B、D）拍攝圖

2.2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

對于180 組圖片數(shù)據(jù)，進(jìn)行記錄篩選分類整理，刪除部分損壞與角度錯誤圖片，必要時(shí)有針對性的進(jìn)行補(bǔ)拍。分別對東方蜜蜂和西方蜜蜂以及俯視和側(cè)面數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，通過ImageJ 進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，最終得出此方法在不同環(huán)境下對東、西方蜜蜂爽飛計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率的差異。數(shù)據(jù)通過excel 進(jìn)行整理，通過卡方分析比較計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率。

3 結(jié)果與分析

分別整理出東方蜜蜂、西方蜜蜂爽飛時(shí)圖片，每種蜂分別選擇高清俯視圖和側(cè)視圖各90 張進(jìn)行分析。結(jié)果顯示東方蜜蜂與西方蜜蜂側(cè)視圖平均準(zhǔn)確率分別為95.89%、93.14%，俯視圖分別為96.62%、91.34%。30 只以下技術(shù)均可達(dá)到100%準(zhǔn)確率；隨著只數(shù)增加至60～90 只，準(zhǔn)確率仍達(dá)到95.47%（東方蜜蜂）、89.17%（西方蜜蜂）。西方蜜蜂達(dá)到100 只以上，準(zhǔn)確率仍在90%左右（圖2）。

東方蜜蜂拍攝場景搭建于較空曠、無建筑陰影地，而西方蜜蜂拍攝場景搭建于近樹木和建筑物的地段上，比較東方蜜蜂和西方蜜蜂各區(qū)間圖片數(shù)據(jù)，對于蜜蜂數(shù)量在30 只以下圖片，無論是東方蜜蜂還是西方蜜蜂、俯視（圖）還是側(cè)視（圖），計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率均達(dá)100%。側(cè)視圖分析結(jié)果表明：對于圖片蜜蜂數(shù)量在30～60 只的計(jì)數(shù)西方蜜蜂準(zhǔn)確率比東方蜜蜂高3.07%，對于圖片蜜蜂數(shù)量在60～90 只的計(jì)數(shù)東方蜜蜂比西方蜜蜂準(zhǔn)確率高5.82%，總體側(cè)視圖片東方蜜蜂準(zhǔn)確率比西方蜜蜂高2.75%。俯視圖分析結(jié)果表明：計(jì)數(shù)東方蜜蜂準(zhǔn)確率比西方蜜蜂高5.19%，但兩者準(zhǔn)確率均為90.00%以上，從變量數(shù)據(jù)比較結(jié)果可清晰看出該計(jì)數(shù)方法對爽飛行為計(jì)數(shù)同樣有效。而從整體數(shù)據(jù)中可看出在計(jì)數(shù)蜜蜂數(shù)量少時(shí)，計(jì)數(shù)西方蜜蜂較東方蜜蜂準(zhǔn)確，在記錄30～60 只時(shí)，計(jì)數(shù)東方蜜蜂準(zhǔn)確率較西方蜜蜂高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)確率與蜂群拍攝場景的陰影投射面積呈負(fù)相關(guān)，東方蜜蜂巢門口陰影較少，對自動計(jì)數(shù)干擾較小，而西方蜜蜂蜂群周圍有樹木建筑等陰影，對自動計(jì)數(shù)干擾相對較大，數(shù)量眾多時(shí)，干擾更為明顯（圖2）。

圖2 東、西方蜜蜂ImageJ自動計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率比較

4 討論

ImageJ 自動計(jì)數(shù)法適用于蜜蜂爽飛行為的計(jì)數(shù)，無論是蜜蜂數(shù)目較低的爽飛圖片（0～30 只），還是蜜蜂數(shù)目較高的爽飛圖片（90～180 只），此方法均表現(xiàn)出較高的可信度，與人工計(jì)數(shù)法計(jì)算的爽飛蜜蜂數(shù)差異較小。

蜜蜂在畫面中所占面積大小與相機(jī)鏡頭距離呈負(fù)相關(guān)，本次計(jì)數(shù)方法利用圖像處理，通過確定蜜蜂面積的范圍從而進(jìn)行精準(zhǔn)自動計(jì)數(shù)，且計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。此外，Motic 面積計(jì)數(shù)法、PS 像素計(jì)數(shù)法[7]、Bayes 摳圖算法同為圖像處理利用面積計(jì)數(shù)，但計(jì)數(shù)原理是用計(jì)數(shù)總數(shù)=總區(qū)域面積（像素）/計(jì)數(shù)對象面積（像素）平均值進(jìn)行自動計(jì)數(shù)。此類計(jì)數(shù)方法在記錄立體空間中個體數(shù)量時(shí)受限較大，因?yàn)槊鄯湓诔查T口飛行，離鏡頭遠(yuǎn)近相差70cm，二者像素大小差異可達(dá)到7 倍；流式直接體積法也是利用計(jì)數(shù)總數(shù)=總區(qū)域體積/計(jì)數(shù)對象體積平均值進(jìn)行自動計(jì)數(shù)，此方法更適用于活細(xì)胞類計(jì)數(shù)。此外，MATLAB 計(jì)數(shù)法是利用bwlabel函數(shù)對二值圖像進(jìn)行連通域自動計(jì)數(shù)。

通過研究發(fā)現(xiàn)ImageJ 自動計(jì)數(shù)法與其他圖像面積處理法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：可針對因距相機(jī)距離不同導(dǎo)致面積不同的蜜蜂進(jìn)行自動計(jì)數(shù)，提高可信度；可對拍攝飛行重疊而出現(xiàn)黏連的“蜜蜂片”分割，提高計(jì)數(shù)精度。缺點(diǎn)：需架設(shè)背景板以減少相應(yīng)的噪音信號，提高準(zhǔn)確率；需盡量避免強(qiáng)光及弱光拍攝，造成陰影導(dǎo)致圖像中對比度不一致甚至模糊記錄。

計(jì)數(shù)精準(zhǔn)度的提高是研究實(shí)驗(yàn)的重要前提，本研究結(jié)果表明，降低周圍干擾是提高計(jì)數(shù)精準(zhǔn)度的有效方法，降低干擾可從外界拍攝環(huán)境控制和軟件處理兩方面改進(jìn)。拍攝環(huán)境控制方面：拍攝爽飛行為時(shí)，最大限度降低干擾，可將拍照背景單一化處理，如可用白色擋板材料作為拍攝背景；天陰時(shí)或無強(qiáng)光造成陰影時(shí)，拍攝條件最佳；根據(jù)拍攝環(huán)境調(diào)整拍攝方位，避免陰影落入到拍攝空間。本實(shí)驗(yàn)得出從頂部拍攝和側(cè)面拍攝效果均比較理想。軟件處理方面：在對圖片計(jì)數(shù)時(shí)，軟件降噪是一種高效便捷的方法，對于原始圖片可進(jìn)行模糊處理，降低背景干擾，增加蜜蜂識別，計(jì)數(shù)參數(shù)設(shè)置尤為重要，需根據(jù)不同的圖片選擇面積范圍和圓度等。

蜜蜂巢門口除了能觀察到數(shù)量較多的爽飛行為，同時(shí)還能觀察到采集行為、防御行為等[9,10]。有經(jīng)驗(yàn)的蜂農(nóng)甚至可以在不開箱的情況下，通過在蜜蜂巢門口觀察采集行為以及爽飛行為來判斷蜂群的健康程度[11]。高效便捷的蜜蜂爽飛計(jì)數(shù)方法，不僅可以幫助我們實(shí)時(shí)監(jiān)測爽飛的發(fā)生時(shí)間、數(shù)量多少、蜂群強(qiáng)弱，更有助于我們快速對其繁殖期幼蜂數(shù)量進(jìn)行動態(tài)監(jiān)控。本研究通過ImageJ 計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)用此方法能觀察較多蜜蜂數(shù)量巢口行為的爽飛行為，同時(shí)對較少蜜蜂數(shù)量的其他采集行為的準(zhǔn)確率會更高。此方法能為區(qū)分爽飛行為、飛逃行為等提供一定參考，可為后期智能蜂箱開發(fā)對巢口行為監(jiān)測提供一定理論參考和應(yīng)用基礎(chǔ)，并為防止蜜蜂飛逃提供支撐[12,13]。

致謝

在此感謝中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園化學(xué)生態(tài)組提供的實(shí)驗(yàn)設(shè)備及實(shí)驗(yàn)蜂群，特別鳴謝化學(xué)生態(tài)組老師和其他師兄師姐的指導(dǎo)和關(guān)心。