李東旭 張 文 葛志強(qiáng) 詹軼群 尹榮華 楊曉明

(天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，天津 300072)

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，由脂質(zhì)和多糖構(gòu)成，是天然免疫反應(yīng)中最有效的刺激因子之一[1]。Toll樣受體4(TLR4)是一種與天然免疫反應(yīng)密切相關(guān)的受體，廣泛分布于免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜表面。TLR4通過識(shí)別LPS活化NF-κB和MAPK信號(hào)通路等，誘導(dǎo)多種炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)免疫應(yīng)答和抵抗病原體入侵[1-2]。此外，LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路的過度激活是多種炎癥性疾病發(fā)生的主要原因，如敗血癥、內(nèi)毒素導(dǎo)致的慢性肝病重癥化等[3]。發(fā)現(xiàn)新的LPS/TLR4信號(hào)通路的調(diào)控因子及調(diào)控機(jī)制對(duì)相關(guān)疾病的治療具有重要意義。

ABRO1(abraxas brother 1)，也被稱為KIAA0157或FAM175B，與BRCC36、MERIT40和BRCC45共同組裝形成BRISC復(fù)合體。BRISC復(fù)合體是一種特異性去除K63泛素化的去泛素化酶，其中ABRO1與BRCC3是最重要的兩個(gè)亞基，BRCC3具有去泛素化功能，ABRO1具有酶活性的催化功能，共同調(diào)節(jié)BRISC的去泛素化酶活性[4]。ABRO1在各類細(xì)胞中均有表達(dá)，參與不同的生理過程，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分裂、DNA損傷反應(yīng)等[5-6]。ABRO1敲除小鼠可以抵抗LPS誘導(dǎo)的敗血癥，其外周血單個(gè)核細(xì)胞中，IL-1β和IFN-β等細(xì)胞因子的mRNA水平明顯降低，在小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDM)中，敲除ABRO1和BRCC3并不影響LPS/TLR4信號(hào)通路活化，然而ABRO1和BRCC3缺失會(huì)阻斷NLRP3炎癥小體組裝，進(jìn)而抑制IL-1β和IL-18分泌[7-8]。綜上所述，ABRO1在LPS/TLR4通路活化中的作用仍未確定。

本文主要探討ABRO1在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)細(xì)胞中對(duì)LPS/TLR4信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)敲除ABRO1并不影響LPS/TLR4信號(hào)通路的活化，提示ABRO1對(duì)LPS/TLR4通路的調(diào)節(jié)可能具有細(xì)胞選擇性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1小鼠 ABRO1敲除小鼠(C57BL/6)由本實(shí)驗(yàn)室建立并飼養(yǎng)于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。選取SPF級(jí)8周齡、體重20～22 g、雌雄ABRO1雜合小鼠進(jìn)行交配，選擇孕期為13.5 d的孕鼠分離MEF細(xì)胞。

1.1.2細(xì)胞和質(zhì)粒 HEK-293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC，用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2和熒光素酶報(bào)告基因載體pCDH-NF-κB-Luciferase為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，Gibco公司)；LPS(Sigma公司)；Pierce ECL化學(xué)發(fā)光底物(美國(guó)Thermo scientific 公司)；ABRO1抗體為實(shí)驗(yàn)室定制(ABclonal公司)；ACTB抗體(ABclonal公司)；p-P65、P65、p-IκBα、IκBα、p-P38、P38、p-ERK、ERK、p-JNK和JNK抗體(CST公司)；IL-6流式微球陣列(CBA)試劑盒(BD公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)；TRIzol(北京威格拉斯公司)；定量PCR試劑盒(Thermo 公司)；慢病毒包裝試劑盒(System Biosciences公司)。

1.1.4主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱3111型(美國(guó)Thermo scientific 公司)；NanoDrop 2000超微量分管光度計(jì)(美國(guó)Thermo scientific 公司)；流式細(xì)胞儀LSRFortessa型(BD公司)；PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；顯微鏡成像(奧林巴斯)；熒光檢測(cè)儀(Promega公司)等。

1.2方法

1.2.1MEF的分離培養(yǎng) 將懷孕13.5 d的ABRO1雜合小鼠放到鼠籠里，脫頸椎法處死小鼠，將小鼠浸泡在酒精中3～4 min，然后將已處死的孕鼠拿到超凈臺(tái)上的盤子中，用剪刀和鑷子取出胚胎，將胚胎放到PBS中，去除頭、四肢和內(nèi)臟，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀細(xì)細(xì)切碎，37℃胰酶消化30 min，每隔5 min輕輕吹打使之消化充分，然后加入含10%FBS的DMEM終止消化，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，將濾液轉(zhuǎn)移至新的50 ml離心管中，4℃，1 000 r/min 離心5 min，DMEM清洗2次，棄上清，用1 ml DMEM重懸細(xì)胞沉淀，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按一定密度接種于新的60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用含有10%FBS，1%P/S的DMEM傳代培養(yǎng)1～2代。

1.2.2細(xì)胞因子檢測(cè) 傳代培養(yǎng)2代后，進(jìn)行消化處理，重新按1×106個(gè)/ml接種到24孔板，細(xì)胞貼壁過夜。加入10 ng/ml、100 ng/ml或1 μg/ml LPS刺激，分別于0、6、12 h收取細(xì)胞培養(yǎng)基上清。參照說明書，利用CBA法檢測(cè)IL-6的濃度，簡(jiǎn)述如下：取50 μl樣本，用PBS稀釋5倍，與含有2 μl 磁珠、2 μl PE和100 μl PBS混合后，室溫避光孵育1.5 h，用PBS清洗1次，然后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3Western blot 分別接種ABRO1 KO和WT的MEF細(xì)胞于12孔板中，貼壁過夜，更換新的不含血清的DMEM饑餓3 h，用1 μg/ml LPS刺激0、15、30、60 min后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗1次后吸棄，每孔加入120 μl 2× loading buffer裂解細(xì)胞，收集于1.5 ml EP管中，將細(xì)胞裂解液樣品沸水煮 15 min 后，每孔8 μl樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，4℃旋轉(zhuǎn)孵育ABRO1、ACTB、p-P65、P65、p-IκBα、IκBα、p-P38、P38、p-ERK、ERK、p-JNK和JNK等抗體，孵育過夜，TBST洗3次，每次7 min，室溫孵育二抗1 h，TBST洗3次，每次7 min，ECL法暗室顯影檢測(cè)相關(guān)通路蛋白。

1.2.4qPCR 提取ABRO1 KO和WT小鼠MEF細(xì)胞RNA：每個(gè)樣品加1 ml TRIzol，反復(fù)吹打，搖床搖10 min，使蛋白與核酸完全分離；每個(gè)樣品加入200 μl氯仿，振蕩15 s，4℃，12 000 r/min離心15 min，把上層轉(zhuǎn)移至新的RNase-free EP管中；加入同等體積異丙醇，上下顛倒混勻，冰上孵育30 min；4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清，75%酒精洗滌沉淀；4℃，12 000 r/min離心5 min，吸棄上清，待乙醇完全揮發(fā)干凈，加入50 μl無RNase水，使其充分溶解后，NanoDrop 2000測(cè)定RNA濃度和純度，樣本無明顯雜峰，OD值在1.8～2.0之間即為合格樣本。將RNA逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行qPCR，檢查溶解曲線、擴(kuò)增曲線、CT值等，然后計(jì)算作圖。PCR 引物序列：IL-6上游5′-GGCGGATCGGATGTT-GTGAT-3′;下游：5′-GGACCCCAGACAATCGGTTG-3′;TNF-α上游：5′-GACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3′;下游：5′-TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG-3′；IL-1β上游：5′-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3′,下游：5′-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3′;GAPDH 上游5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游 5′-TGT-AGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.2.5慢病毒包裝制備和MEF細(xì)胞感染 為制備慢病毒顆粒，在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)293T細(xì)胞，用15 μg pCDH-NF-κB-Luciferase表達(dá)載體、10 μg psPAX2(Addgene)和5 μg pMD2.G(Addgene)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染8 h后，更換為含10%FBS，1%P/S的DMEM培養(yǎng)基，再過40 h后，收集培養(yǎng)基上清，1 000 r/min 離心10 min，上清液通過0.45 μm膜過濾，預(yù)冷的PEG-it 病毒沉淀溶液(System Bioscien-ces，LV810A)加入到上清中，上清與PEG-it的混合液4℃條件過夜，4℃，1 650 r/min離心 30 min，去除沉淀，收集懸浮著慢病毒顆粒的上清液，10 μl等量分裝儲(chǔ)存于-80℃冰箱中。用制備好的慢病毒顆粒對(duì)MEF細(xì)胞進(jìn)行感染。

1.2.6熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) 吸棄感染熒光素酶報(bào)告基因的MEF細(xì)胞上清，加入被動(dòng)裂解液，室溫裂解15 min，收集細(xì)胞裂解液上清，轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，參照儀器和熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)試劑盒說明書，用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光。計(jì)算報(bào)告基因與內(nèi)參基因的熒光素酶活性比值，即熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ABRO1敲除和WT小鼠MEF細(xì)胞的分離培養(yǎng)與表達(dá)鑒定 取孕期為13.5 d孕鼠胚胎，制備成ABRO1 KO和WT MEFs，Western blot鑒定MEF細(xì)胞，證實(shí)ABRO1 KO MEF細(xì)胞中無ABRO1表達(dá)，而WT MEF細(xì)胞中ABRO1正常表達(dá)(圖1)。說明ABRO1 KO和WT MEF細(xì)胞構(gòu)建成功。

圖1 MEFs細(xì)胞中ABRO1蛋白表達(dá)鑒定

2.2敲除ABRO1不影響MEF細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的IL-6釋放 傳代2次后的MEF細(xì)胞重新消化，種板，分別用10 ng/ml、100 ng/ml和1 μg/ml 3種劑量的LPS刺激MEF細(xì)胞0、6、12 h，收取細(xì)胞培養(yǎng)基上清，流式CBA法檢測(cè)炎癥因子IL-6的含量，結(jié)果顯示，靜息態(tài)MEF細(xì)胞分泌極少量IL-6，而LPS刺激6 h或12 h可以促進(jìn)IL-6的大量分泌；但是，無論在何種刺激濃度和刺激時(shí)間下，ABRO1 KO和WT MEF細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6水平都基本一致(圖2A～C)。

圖2 敲除ABRO1不影響MEF細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的IL-6的釋放

2.3敲除ABRO1不影響MEF細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平 1 μg/ml LPS刺激MEF細(xì)胞0 h和3 h，收集細(xì)胞提取RNA，用qPCR檢測(cè)IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平。結(jié)果顯示，LPS刺激3 h顯著提高了IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平，但ABRO1 KO和WT MEF細(xì)胞中這3種細(xì)胞因子的mRNA水平基本一致(圖3A～C)。

圖3 敲除ABRO1不影響MEFs細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平

2.4敲除ABRO1不影響MEF細(xì)胞中LPS-TLR4信號(hào)通路的活化 進(jìn)一步檢測(cè)了敲除ABRO1對(duì)TLR4下游信號(hào)通路活化的影響，主要包括NF-κB和MAPK信號(hào)通路。Western blot結(jié)果顯示，LPS刺激后MEF細(xì)胞IκBα蛋白水平迅速降低，在之后60 min 恢復(fù)到較高水平；p-IκBα和p-P38在15 min和60 min出現(xiàn)2次表達(dá)峰；但ABRO1敲除并不影響IκBα降解以及P65、IκBα、P38、ERK、JNK磷酸化水平的動(dòng)態(tài)變化(圖4)。

圖4 敲除ABRO1不影響MEF細(xì)胞LPS/TLR4信號(hào)通路的活化

2.5敲除ABRO1不影響MEF細(xì)胞中NF-κB報(bào)告基因活性 利用慢病毒將NF-κB報(bào)告基因轉(zhuǎn)入到MEF細(xì)胞中，1 μg/ml LPS分別刺激0、3、6 h，結(jié)果顯示，LPS刺激顯著提高NF-κB報(bào)告基因活性，但ABRO1 KO和WT的MEF細(xì)胞中NF-κB報(bào)告基因的活性無顯著差異(圖5)。

3 討論

本研究重點(diǎn)揭示了敲除ABRO1對(duì)MEF細(xì)胞LPS/TLR4通路活化的影響。結(jié)果顯示，缺失ABRO1并不影響MEF細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的IL-6的分泌及IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平；ABRO1 KO MEF細(xì)胞中，LPS誘導(dǎo)的TLR4下游NF-κB和MAPK信號(hào)通路的活化并無明顯異常；敲除ABRO1也并不影響LPS對(duì)NF-κB報(bào)告基因的激活。因此，敲除ABRO1不影響MEF細(xì)胞中LPS/TLR4通路的活化。LPS/TLR4通路活化后會(huì)激活多種轉(zhuǎn)錄因子，其中NF-κB最為關(guān)鍵。正常情況下NF-κB/P65被IκBα限制在胞質(zhì)，LPS刺激促進(jìn)IκBα磷酸化，進(jìn)而IκBα發(fā)生降解，釋放NF-κB，NF-κB入核后與目的基因特異性結(jié)合并使其轉(zhuǎn)錄[9]。類似NF-κB通路，LPS/TLR4活化也會(huì)促進(jìn)ERK、JNK和P38發(fā)生磷酸化，激活相關(guān)核蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，如AP1等[10]。IL-6等炎癥細(xì)胞因子是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB所調(diào)控的靶基因，在LPS/TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及相關(guān)疾病中起關(guān)鍵作用[11-12]。本研究重點(diǎn)檢測(cè)了ABRO1 KO及WT MEF細(xì)胞中NF-κB和MAPK信號(hào)通路的活化、NF-κB報(bào)告基因的活性、炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄以及IL-6的分泌，以探討ABRO1對(duì)MEF細(xì)胞LPS/TLR4通路的影響。

已有研究表明，BRISC在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。BRISC可以調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素受體IFNAR1的去泛素化并促進(jìn)其活化，進(jìn)而參與抗病毒反應(yīng)[13]。BRISC也可以調(diào)節(jié)NLRP3去泛素化，進(jìn)而促進(jìn)NLRP3炎癥小體活化[7]。BRISC還可以通過調(diào)節(jié)HIV-1病毒Tat蛋白K63位去泛素化，控制其自噬途徑的降解[14]。在小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDM)中，敲除ABRO1和BRCC3并不影響LPS/TLR4信號(hào)通路的活化[15]。但是LPS處理后的ABRO1敲除小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中，IL-1β和IFN-β等細(xì)胞因子的mRNA水平明顯降低，提示敲除ABRO1可能抑制了某些細(xì)胞中LPS/TLR4通路的活化[13]。MEF細(xì)胞是研究天然免疫的重要材料，MEF細(xì)胞并不是發(fā)揮免疫功能的細(xì)胞，只有在外界刺激下才產(chǎn)生應(yīng)答并分泌炎癥因子或化學(xué)因子等，分泌細(xì)胞因子的能力強(qiáng)，MEF細(xì)胞的分離比分離純化免疫細(xì)胞更方便，MEF細(xì)胞屬于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，而大多數(shù)免疫細(xì)胞屬于懸浮細(xì)胞，因此選用MEF細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程更容易控制[16]。目前MEF是研究天然免疫過程中某個(gè)基因或信號(hào)通路較佳的細(xì)胞模型[8]。而ABRO1在小鼠MEF細(xì)胞中的功能研究尚未報(bào)道。我們分離了ABRO1 KO和WT MEF細(xì)胞，建立了LPS誘導(dǎo)小鼠MEF細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)ABRO1敲除并不影響LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子IL-6的分泌以及TLR4下游NF-κB和MAPK信號(hào)通路的活化。說明ABRO1對(duì)LPS/TLR4通路的影響可能具有細(xì)胞特異性，需要后續(xù)進(jìn)一步確定。