孫曉鵬，郭康，郭志坤

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 周口 466000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003

心是機(jī)體物質(zhì)代謝非?；钴S的器官，其功能實(shí)現(xiàn)依賴于持續(xù)的能量供應(yīng)，成人心所需的ATP大約70%來源于心肌線粒體中β氧化的脂肪酸[1]。心型脂肪酸結(jié) 合 蛋 白（heart type fatty acid binding protein，HFABP）是一種由132個(gè)氨基酸組成的小分子可溶性蛋白質(zhì)，分子量為15 Kda，在心肌細(xì)胞質(zhì)中含量較為豐富，約占胞質(zhì)蛋白總量的5%～15%，其主要功能是參與轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸到線粒體進(jìn)行β氧化[2]。有研究表明H-FABP在肌細(xì)胞中含量的變化主要與脂肪酸的利用有關(guān)[3]。多種生理實(shí)驗(yàn)證實(shí)脂肪酸攝取和代謝的增加可以提高H-FABP及其RNA的濃度，表明脂肪酸水平調(diào)控H-FABP基因的表達(dá)[4]。目前對(duì)H-FABP的研究主要集中于它作為急性心肌梗死的早期生物學(xué)標(biāo)志物，而對(duì)其在高脂血癥中的表達(dá)研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過建立高脂血癥大鼠模型，觀察不同血脂水平大鼠心肌中脂滴含量和心功能，以及相應(yīng)的H-FABP表達(dá)，旨在為進(jìn)一步研究高脂血癥大鼠心肌脂肪酸的代謝特點(diǎn)和臨床治療高脂血癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

清潔級(jí)雄性大鼠30只，體重180～200 g，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為對(duì)照組15只，實(shí)驗(yàn)組15只；每組大鼠根據(jù)取材時(shí)間（4周、8周、12周）分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 飼養(yǎng)與采血 對(duì)照組大鼠予普通飼料自然喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組予高脂飼料自然喂養(yǎng)。分別在飼養(yǎng)4、8、12周檢測血脂。檢測方法：取空腹大鼠，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，眼眶取血1 ml分離血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglycerides，TG）含量。

1.2.2 心功能檢測 采血后應(yīng)用高頻探頭行二維心超聲檢查，于左側(cè)胸骨旁左心室水平做短軸切面采集左室二維圖像，測定左心室舒張末期內(nèi)徑（Lvid：d）、左心室后壁厚度（Plvw：d）及左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.2.3 心肌組織病理學(xué)觀察 分別在飼養(yǎng)4、8、12周，禁食12 h后，麻醉處死大鼠，取心，10%多聚甲醛固定過夜，30%蔗糖溶液脫水，oct包埋，冰凍切片，厚度8μm，0.5%油紅O避光染色，蘇木素復(fù)染，甘油明膠封片觀察。

1.2.4 脂滴透射電鏡觀察 大鼠禁食12 h后，心室切取1 mm×1 mm×1 mm心肌組織，立即放入2.5%的戊二醛中4℃浸泡2 h。PBS漂洗3次，每次15 min，然后放入10 g/L鋨酸中固定2～3 h，PBS漂洗3次，每次15 min，乙醇梯度脫水。純丙酮加包埋液（1：2）室溫過夜，60℃烘箱固化24 h，切片，厚度60 nm。將切片經(jīng)3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，JEM 1200透射電鏡觀察。

1.2.5 H-FABP免疫組化顯色 將各組大鼠心用多聚甲醛固定24 h，30%蔗糖溶液脫水至心沉底。Pbs沖洗，oct包埋，冰凍切片，厚度8μm。37℃溫箱烤片30 min，將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中（PH 6.0），微波爐加熱10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫。PBS清洗3次，滴加3%過氧化氫浸泡20 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。而后依次滴加正常山羊血清（北京中杉金橋生物公司）浸泡20 min封閉非特異性抗原，1：200小鼠來源H-FABP抗體（abcam公司）及1：500 HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物公司）進(jìn)行免疫組化染色，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 H-FABP免疫熒光顯色 37℃溫箱烤片30 min，將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中，于高壓鍋內(nèi)熱處理2 min進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加3%過氧化氫浸泡20 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。0.3%Triton浸泡30 min進(jìn)行細(xì)胞膜打孔，而后依次滴加正常山羊血清浸泡20 min，1：200小鼠來源H-FABP抗體（abcam公司）及1：500 CY3（北京中杉金橋生物公司）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，DAPI染核，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。

1.2.7 Western blotting蛋白表達(dá) 每組取3只大鼠左心室標(biāo)本分別進(jìn)行組織勻漿，組織裂解液裂解，取上清液，BCA總蛋白定量，取等量蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，依次加入1：500小鼠抗H-FABP單克隆抗體以及1：1000山羊抗小鼠HRP標(biāo)記IgG。ECL發(fā)光檢測，成像，顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食大鼠血脂

實(shí)驗(yàn)組大鼠TG水平在第4周末、第8周末、第12周末明顯高于同期對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），3個(gè)實(shí)驗(yàn)階段大鼠TG水平呈現(xiàn)先增高后下降趨勢，但在第4周末與第8周末、第8周末與第12周末的結(jié)果比較差異不明顯（P＞0.05）（圖1A）。實(shí)驗(yàn)組大鼠TC水平在第4周末、第8周末、第12周末3個(gè)時(shí)相點(diǎn)明顯高于同期對(duì)照組（P＜0.001），3個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)相點(diǎn)TC水平逐漸升高，且差異顯著（P＜0.001，P＜0.01）（圖1B）。

2.2 高脂飲食大鼠心功能

超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠Lvid：d、Plvw：d在第4周末、第8周末、第12周末明顯高于同期對(duì)照組（P＜0.001，P＜0.01），在第4周末與第8周末、第8周末與第12周末之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.01），（圖2C、D），尤其是Plvw：d變化呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢。實(shí)驗(yàn)組大鼠LVEF在第4周末、第8周末、第12周末明顯低于同期對(duì)照組（P＜0.001，P＜0.01），第4周末與第8周末比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），第8周末與第12周末比較呈現(xiàn)明顯下降（P＜0.001），（圖2E）。

2.3 高脂血癥大鼠心肌脂滴分布

心肌油紅O染色結(jié)果顯示，第4周實(shí)驗(yàn)組大鼠禁食12 h后，心肌內(nèi)有大量的細(xì)小脂滴，廣泛分布于肌原纖維之間。而對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)幾乎看不到脂滴存在。脂滴在第4周末含量最多，第8周末、第12周末脂滴含量逐漸減少（圖3A～D）。透射電鏡同樣觀察到在高脂飲食第4周心肌細(xì)胞內(nèi)的脂滴最多。在心肌縱切面上，肌原纖維之間出現(xiàn)條狀排列、大小不等的空泡，即脂滴（圖3E～H）。有些細(xì)胞的脂滴位于細(xì)胞膜下（圖3C）。在橫切面上，脂滴位于線粒體和肌原纖維之間，大小不等，散在分布（圖3F，G）。

圖1 高脂飲食對(duì)大鼠血清TG、TC影響A：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在第4、8和12周TG水平B：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在第4、8和12周TC水平*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，ns P＞0.05Fig.1 Effects of high fat diet on TGand TCA:the TG levels of experimental group and control group at the4th week,the 8th week and the 12th week；B:the TC levels of experimental group and control group at the4th week,the 8th week and the12th weekNote:*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,ns P＞0.05

圖2 高脂飲食對(duì)大鼠心功能影響A：對(duì)照組左心室超聲心動(dòng)圖B：實(shí)驗(yàn)組左心室超聲心動(dòng)圖C、D、E：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在第4、8和12周左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室厚壁厚度、左心室射血分?jǐn)?shù)*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001，ns P＞0.05Fig.2 Effects of high-fat diet on cardiac functionA:left ventricular echocardiography in the control group；B:left ventricular echocardiography in the experimental group；C、D、E:the left ventricular diameter at end-diastole,left ventricular thick-wall thickness and left ventricular ejection fraction were measured at the 4th week,the 8th week and the12th week*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001，ns P＞0.05

2.4 高脂血癥大鼠心肌H-FABP的免疫表達(dá)

免疫組織化學(xué)顯色顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠各個(gè)時(shí)相點(diǎn)心肌細(xì)胞中H-FABP主要表達(dá)于胞漿內(nèi)，呈現(xiàn)棕黃色顆粒。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在3個(gè)時(shí)相點(diǎn)的H-FABP表達(dá)依次增加，第12周增加最為顯著（圖4）。免疫熒光顯色顯示H-FABP在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)逐漸增強(qiáng)，與免疫組化結(jié)果一致（圖5）。Western blotting檢測顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌中H-FABP表達(dá)量高于對(duì)照組，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程H-FABP表達(dá)逐漸增加，對(duì)照組各時(shí)段沒有差異（圖6A、B）。實(shí)驗(yàn)第4周與同期對(duì)照組相比表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），（圖6C）。實(shí)驗(yàn)第8周、12周與同期對(duì)照組相比表達(dá)顯著增多（P＜0.001），（圖6D、E）。

3 討論

圖3 大鼠心肌細(xì)胞脂滴A：對(duì)照組心肌內(nèi)未見脂滴CON：對(duì)照組B～D：光鏡下高脂飲食第4、8和12周心肌細(xì)胞脂滴分布（油紅O染色）E～H：電鏡下高脂飲食第4、8和12周心肌細(xì)胞脂滴的亞微結(jié)構(gòu)分布E和F為心肌細(xì)胞縱切面G和H為心肌細(xì)胞橫切面 箭頭示脂滴Fig.3 Lipid droplets in myocardial cells of high-fat diet ratsA:no lipid droplets in myocardial cells of the control group；B～D：the distribution of lipid droplets in myocardial cells under light microscopy at the 4th week,the 8week and the 12 week,oil red O staining；E-H:the ultrastructural distribution of lipid droplets in hyperlipidemic myocardial cells at the 4th week,the 8th week and the 12th week；E and F were the longitudinal sections of cardiomyocytes；G and H were the transverse sections of cardiomyocytes,arrows indicated lipid droplets

圖4 不同階段高脂飲食影響大鼠心肌細(xì)胞H-FABP免疫組化表達(dá) CON：對(duì)照組Fig.4 Immunohistochemical staining of H-FABP in cardiomyocytes CON:control group

心是人體能量需求較高的器官，為維持正常心功能，需要保證足夠的能量持續(xù)供應(yīng)心，因此，心肌細(xì)胞活動(dòng)有賴于ATP的持續(xù)生成。在能量代謝過程中，糖和長鏈脂肪酸是心主要的能量來源[5,6]。雖然糖的氧化是心肌ATP的重要來源，但健康成人的心肌ATP 50%～70%來自長鏈脂肪酸[7]。心肌獲得脂肪酸主要來自循環(huán)系統(tǒng)中甘油三酯水解后與白蛋白結(jié)合的游離脂肪酸以及極低密度脂蛋白水解的脂肪酸[8]。獲取的脂肪酸除供線粒體氧化供能外，其余部分以三酰甘油的形式儲(chǔ)存于心肌細(xì)胞的脂滴中，并在需要時(shí)由三酰甘油脂酶（ATGL）水解為脂肪酸和甘油[9]。

長鏈脂肪酸是主要的脂類，但游離長鏈脂肪酸不溶于胞質(zhì)，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)需要脂肪酸結(jié)合蛋白幫助。脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）是胞質(zhì)內(nèi)可溶性的小分子蛋白（14-15Kda）家族，可以結(jié)合長鏈脂肪酸[10]。心型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）是FABPs家族主要成員，由FABPs3基因編碼，主要分布于心肌和骨骼肌[11]，結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸至線粒體進(jìn)行氧化。研究表明，HFABP可以刺激心肌細(xì)胞肥大[12]。H-FABP近年來作為心肌梗死早期生物學(xué)標(biāo)志物越來越被重視，據(jù)載，在急性心肌梗死30 min內(nèi)，H-FABP從胞質(zhì)釋放入血液循環(huán)[13]。

高脂血癥是冠心病最大的風(fēng)險(xiǎn)因子[14]，高脂血癥是指血清TC、TG、LDL、VLDL升高和HDL降低，其中高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥與缺血性心病密切相關(guān)[15]。高脂血癥患者血液中膽固醇和甘油三酯水平升高，心肌細(xì)胞攝入的脂肪酸隨之增加，作為長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白H-FABP表達(dá)也會(huì)增高，但對(duì)于高脂血癥患者H-FABP的表達(dá)和血脂水平的關(guān)系以及對(duì)心肌脂肪酸代謝的影響卻鮮有研究。

圖5 大鼠心肌細(xì)胞H-FABP免疫熒光表達(dá)A～C：對(duì)照組CON：對(duì)照組D～F：實(shí)驗(yàn)4周組G～I(xiàn)：實(shí)驗(yàn)8周組J～L：實(shí)驗(yàn)12周組A、D、G、J：H-FABP表達(dá)B、E、H、K：Dapi標(biāo)記細(xì)胞核 C、F、I、L：前兩列的疊加Fig.5 Immunofluorescence expression of H-FABP in cardiomyocytes of hyperlipidemic ratsA-C:control group；D-F:the 4 week experimental group；G-I:the 8 week experimental group；J-L,the 12 week experimental group；A，D，G，J:H-FABP expression；B，E，H，K:dapi labeled nucleus；C，F(xiàn)，I，L:merged the first two columns

本研究通過生化指標(biāo)的檢測，運(yùn)用油紅O染色光鏡和電鏡觀察大鼠心肌組織脂滴沉積變化，以及對(duì)H-FABP的免疫組化、免疫熒光，Western blotting表達(dá)和心功能進(jìn)行檢測，初步揭示了高脂血癥大鼠心肌脂肪酸代謝的特點(diǎn)以及心肌形態(tài)和功能的影響。結(jié)果顯示，隨著高脂飼料喂養(yǎng)時(shí)間的延長TC水平顯著升高，而TG水平增加不明顯，并在第12周末出現(xiàn)降低。這種現(xiàn)象在其它實(shí)驗(yàn)的造模過程中也曾出現(xiàn)，可能機(jī)制是脂質(zhì)代謝紊亂加重及血中TG水平升高，肝起到貯存TG的緩沖作用，大量的TG向肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，肝功能損傷至一定程度時(shí)，其代謝轉(zhuǎn)運(yùn)TG的能力便會(huì)大大減弱[16]。組織學(xué)結(jié)果顯示，高脂血癥大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維間出現(xiàn)脂滴儲(chǔ)積，而正常大鼠心肌細(xì)胞中無明顯脂滴，說明高脂飲食使心肌的脂肪酸攝入增多，超過了心肌脂肪酸的β氧化能力，多余的脂肪酸以甘油三酯形式貯存在心肌細(xì)胞的脂滴內(nèi)，最終導(dǎo)致心肌發(fā)生脂肪變性。但是本實(shí)驗(yàn)還顯示，隨著高脂飲食時(shí)間延長，血脂濃度升高，反而導(dǎo)致大鼠心肌內(nèi)的脂滴減少。如何解釋這一看似相互矛盾的現(xiàn)象？通過免疫組化、免疫熒光和Western blotting表達(dá)顯示，隨著造模時(shí)間的延長心肌H-FABP表達(dá)量逐漸增加，這可能是高脂飲食持續(xù)一定時(shí)間后心肌內(nèi)脂滴下降的根本原因。因?yàn)镠-FABP主要作用是轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸至線粒體進(jìn)行β氧化，H-FABP增多，脂滴分解加快，脂肪酸的β氧化增加，心肌細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量也會(huì)減少。如果繼續(xù)延長高脂飲食喂養(yǎng)時(shí)間，是否會(huì)出現(xiàn)HFABP下降（衰竭），心肌細(xì)胞內(nèi)的脂滴再次增多，加重心肌變性，而導(dǎo)致心功能障礙等，尚需進(jìn)一步研究。

圖6 對(duì)照組與高血脂大鼠心肌組織H-FABP的表達(dá)CON：對(duì)照組ns P＞0.05，***P＜0.001Fig.6 Expression changes of H-FABP in myocardium of hyperlipidemia rats in the control groupCON:control group,ns P＞0.05,***P＜0.001

有大量的證據(jù)表明脂質(zhì)及其代謝的中間產(chǎn)物可以導(dǎo)致心肌的脂毒性損傷，心肌脂毒性可以造成心肌胰島素抵抗，心肌細(xì)胞凋亡和心收縮功能障礙[1]。在脂肪酸的氧化過程中會(huì)伴隨活性氧簇（reactive oxygen stress，ROS）的產(chǎn)生，ROS增加可誘導(dǎo)心肌肥厚和心肌細(xì)胞功能紊亂[17]。本研究通過二維超聲心動(dòng)圖檢測發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠與對(duì)照組相比Lvid：d明顯增大、Plvw：d明顯增厚，LVEF明顯下降，隨著血脂濃度的升高這種變化更為顯著。這表明高血脂已明顯影響大鼠的心功能。但本研究發(fā)現(xiàn)大鼠心肌內(nèi)脂滴的增多與心功能變化并不一致，脂滴明顯增多時(shí)，心功能下降反不明顯，隨著脂滴數(shù)量的減少心功能出現(xiàn)明顯下降。這種結(jié)果可能與高血脂大鼠心肌的脂毒性損傷有關(guān)。因?yàn)樾募≈舅岬摩卵趸龆啵瑫r(shí)伴隨ROS生成增加，導(dǎo)致對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷，另外H-FABP高表達(dá)也可以造成對(duì)心肌細(xì)胞的刺激[12]。

綜上所述，高脂飲食可使大鼠心肌內(nèi)脂滴增多，心肌發(fā)生脂肪變性，隨著血脂濃度的升高，H-FABP的表達(dá)明顯增加，心肌脂肪酸的β氧化增強(qiáng)，心肌中脂滴含量減少，但心功能下降。然而相關(guān)機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步探索。