付燕 楊芩 楊月 胡紅

摘要?以“杰兔”“燦爛”和“粉藍”3個兔眼藍莓品種的花藥為試材，采用正交試驗設計，研究了植物生長調節(jié)劑和不同品種對藍莓花藥愈傷組織誘導和增殖效果的影響，以期為開展藍莓花藥培養(yǎng)創(chuàng)新種質提供科學依據(jù)。結果表明，6-BA、2，4-D 和NAA的濃度變化對藍莓花藥愈傷組織誘導有明顯影響，其中6-BA 影響最大;MS+1.0?mg/L 6-BA+2.0?mg/L 2，4-D+0.4?mg/L NAA對“燦爛”花藥愈傷組織誘導率最高，出愈率為35.67%。同時，將參試的3個品種的花藥分別接種在上述培養(yǎng)基中，品種間的出愈率差異顯著，依次分別為“杰兔”46.50%、“燦爛”35.70%和“粉藍”29.50%。此外，以“杰兔”初代培養(yǎng)誘導的愈傷組織繼續(xù)增殖培養(yǎng)，該研究處理中最佳增殖培養(yǎng)基為MS+1.00?mg/L IAA+1.25?mg/L 6-BA+0.25?mg/L KT+1.00?mg/LNAA，其增殖系數(shù)為0.89。

關鍵詞?藍莓;花藥培養(yǎng);基因型;愈傷組織;增殖

中圖分類號?S663.9?文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）01-0045-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.012

Abstract?Orthogonal design was used to study the effects of plant growth regulators and different varieties on the induction and proliferation of anther callus using the anthers of three rabbiteye blueberry Powderblue，Premier and Brightwell as materials，in order to lay a foundation for the innovative germplasm in blueberry.The results showed that the concentration of 6-BA，2，4-D and NAA had significant effects on the induction of anther callus in blueberry，and among which 6-BA had the greatest effect.The optimum medium for anther callus induction of MS+1.0?mg/L 6-BA+2.0?mg/L 2，4-D+0.4?mg/L NAA with the highest induction rate of 35.67%.Meanwhile，there were significant differences in callus induction rate of anthers among different genotypes，and the callus induction rate of ‘Premier was the highest with 46.50%.In addition，the optimum medium for anther callus proliferation of MS+1.00?mg/L IAA+1.25?mg/L 6-BA+0.25?mg/L KT+1.00?mg/L NAA with the proliferation coefficient of 0.89.

Key words?Blueberry;Anther culture;Genotype;Callus;Multiplication

藍莓 （Blueberry） 屬杜鵑花科 （Ericaceae） 越橘屬 （Vaccinium spp.） 植物，為多年生落葉或常綠小灌木果樹[1]，其果實含有大量的維生素A、C、E 和花青苷等生化物質，具有良好保健功能，備受國內外消費者青睞[2]。目前，國內關于藍莓的研究主要集中在資源調查、育苗、土壤改良、貯藏加工等方面，而育種，特別是生物技術的研究很少[2-3]，主栽品種大多為國外20世紀選育。為促使我國藍莓產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展，必須加快培育擁有自主知識產(chǎn)權的品種[4]。目前，國內外關于藍莓品種的選育主要通過野生選種、實生選種、雜交育種和倍性育種獲得，其中雜交育種仍是最重要的手段[4-5]。近年來，我國把新品種培育作為保持和提升果品競爭力的有力措施，藍莓遺傳育種研究備受我國科研人員關注和重視[6]。然而，我國藍莓常規(guī)雜交選育種技術由于受種質資源狹窄、周期長等缺點的限制，導致短時間內很難超越其他國家的優(yōu)良品種，而利用花藥培養(yǎng)等現(xiàn)代生物技術育種手段不僅可以加快藍莓的育種進程，也是創(chuàng)新種質的有效途徑[7-8]。

花藥培養(yǎng)已在多種果樹上成功應用，并獲得單倍體、胚狀體和胚性愈傷組織[9]，而單倍體植株加倍后獲得的雙單倍體 （DH） 在遺傳上具有高度的純合性[10]，可快速純合優(yōu)良雜交組合的優(yōu)異基因，使植株的基因型和表現(xiàn)型完全一致，尤其在選擇由隱性基因控制的優(yōu)良性狀時具有明顯優(yōu)勢，能極大地縮短育種周期[11]。同時由于基因的純合性，還可以提高基因作圖和基因定位的準確性，因此單倍體植株是果樹優(yōu)質育種、遺傳轉化以及分子標記、遺傳圖譜構建和基因克隆等分子生物學研究領域的珍貴材料[12]。目前已有許多果樹通過花藥或花粉培養(yǎng)，獲得了胚性愈傷組織或單倍體植物[11-12]，但藍莓花藥培養(yǎng)研究迄今鮮有報道。鑒于此，筆者以7年生“燦爛”“粉藍”和“杰兔”品種為試驗材料，探討植物生長調節(jié)劑、基因型對藍莓花藥培養(yǎng)效果的影響，以期建立藍莓花藥培養(yǎng)體系，為花藥培養(yǎng)獲取單倍體和雙單倍體奠定技術基礎，對創(chuàng)新藍莓種質資源、推進育種工作具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。

1?材料與方法

1.1?材料

以種植于凱里學院卓越農(nóng)林人才培養(yǎng)實訓基地內7年生的藍莓植株“杰兔”（六倍體，6n=72）、“燦爛”（六倍體，6n=72）、“粉藍”（六倍體，6n=72）[13]3個品種為參試材料，盛花期采集橫徑為0.10～0.15 cm、縱徑為0.7～0.8 cm的花蕾，顯微鏡觀察花粉粒處于單核期且發(fā)育良好的花藥為試驗材料進行接種培養(yǎng)。

1.2?方法

1.2.1?花藥的獲得。

將采集的花蕾用70%的酒精去除花冠表面灰塵后，置于（4 ℃）條件下的冰箱中預處理3 d，然后在無菌條件下，用70% 的乙醇浸泡15 s，無菌水清洗3遍，再用0.1% 升汞溶液消毒4 min，清洗4～5遍。將處理好的材料放置于無菌濾紙上吸干水分，小心剝離花藥并接種在各處理培養(yǎng)基上。

1.2.2?愈傷組織誘導培養(yǎng)基。

參照段麗君等[14-15]的方法并略有改動，愈傷組織培養(yǎng)基為 MS培養(yǎng)基，pH=6.0，添加蔗糖45 g/L，瓊脂9.5 g/L，以“燦爛”花藥為試料，采用L9 （33） 正交實驗設計，植物生長調節(jié)劑6-BA 濃度為0.75、1.00、1.25?mg/L，2，4-D濃度為1.50、2.00、2.50?mg/L，NAA濃度為0.10、0.20、0.40?mg/L。將花藥接種到含有不同激素種類的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，每瓶接種4枚花藥，每處理共接種150瓶，每50瓶為1個重復，共3次重復，即每個處理共接種600枚花藥。

1.2.3?不同基因型對藍莓花藥誘導的影響。將“燦爛”“粉藍”“杰兔”3個品種的花藥分別接種到上述篩選的最佳培養(yǎng)基中，探討不同基因型對藍莓花藥愈傷組織誘導的影響。

1.2.4?愈傷組織增殖培養(yǎng)基。

參照黃鳳祥等[16]的方法并略有改動，愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，pH=6.0，添加蔗糖45 g/L，瓊脂9.5 g/L，以“杰兔”花藥為試料，采用L9（34） 正交實驗設計，植物生長調劑6-BA濃度為0.75、1.00、1.25?mg/L，IAA為0.75、1.00、1.25?mg/L，KT為0.25、0.50、0.75?mg/L，NAA濃度0.75、1.00、1.25?mg/L。將直徑1.0～1.5 cm的正方體或近圓形藍莓花藥愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)基中，增殖周期為40 d，觀察愈傷組織生長情況，并稱量計算其鮮重增加量。每瓶接種1顆，每個處理均接種30瓶。

愈傷組織誘導和增殖接種后放置于培養(yǎng)室內，光照12 h/d，光強2 000～2 500 lx，溫度 （25±1） ℃條件下培養(yǎng)。

1.3?數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析?接種60 d后統(tǒng)計各處理花藥褐化率、膨大率及花藥出愈率。增殖培養(yǎng)40 d稱量鮮重，并計算增殖系數(shù)。用SPSS （16.0） 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，在分析之前先將所有百分率數(shù)據(jù)進行反正弦轉換，處理間差異在0.05的顯著水平上進行SNK檢驗。

褐化率=褐化花藥數(shù)/接種花藥總數(shù)×100%

出愈率=出愈花藥數(shù)/接種花藥總數(shù)×100%

膨大率=膨大花藥數(shù)/接種花藥總數(shù)×100%

增殖系數(shù)=（Y-Yo）/Yo

式中，Y為接種40 d后愈傷組織鮮重;Yo為接種時愈傷組織鮮重。

2?結果與分析

2.1?植物生長調節(jié)劑對藍莓花藥愈傷組織誘導的影響

接種后跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，接種后第20天左右花藥開始膨大，第25天左右有部分花藥開始分化愈傷組織，至接種后第33天可見米黃色團狀愈傷組織，且部分愈傷組織在不斷增殖，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織表面顏色由米黃轉為綠色，至接種后第50天有少數(shù)愈傷組織邊緣開始出現(xiàn)褐化的現(xiàn)象，之后隨著培養(yǎng)時間的延長，褐化的愈傷組織進而出現(xiàn)干死的現(xiàn)象。同時，從表3可以看出，在培養(yǎng)基中添加不同種類、不同濃度的植物生長調節(jié)劑，對花藥褐化率、膨大率及愈傷組織的誘導均有顯著影響。各處理花藥接種60 d后，花藥的褐化率為1.17%～7.17%，褐化率最高的為2號處理，即0.75?mg/L 6-BA+2.00?mg/L 2，4-D+0.20?mg/L NAA，其膨大率和誘導率分別僅為2.83%和2.33%。各處理間花藥的膨大率和出愈率均存在顯著差異，且花藥的膨大率與愈傷組織誘導率成正相關，其中5號處理6-BA 1.00?mg/L+2，4-D 2.00?mg/L+NAA 0.40?mg/L的花藥膨大率和出愈率最高，分別為37.00% 和35.67%，并顯著高于其他處理;其次是7號處理1.25?mg/L 6-BA+1.50?mg/L 2，4-D+0.40?mg/L NAA的花藥膨大率和出愈率分別為17.67%和15.00%，再次是4號處理1.00?mg/L 6-BA+1.50?mg/L 2，4-D+0.20?mg/L NAA的膨大率和花藥出愈率均為13.00%，其余處理組織的誘導率均為超過10.00%，且3和9號處理的花藥膨大率和出愈率均為0。

2.2?不同基因型對藍莓花藥誘導的影響

由表2可知，基因型對藍莓花藥培養(yǎng)誘導愈傷組織有顯著影響，不同品種的花藥褐化率、膨大率和愈傷組織誘導率存在顯著差異。參試的3個品種中，“燦爛”的褐化率最高，為4.50%，且顯著高于“粉藍”的3.00%和“杰兔”的2.83%?；蛐蛯ε虼舐屎统鲇实挠绊戁厔菀恢?，“杰兔”的膨大率和出愈率均最高，分別為47.67%和46.50%，且均顯著高于燦爛的膨大率 （38.20%） 和出愈率 （35.70%），粉藍的膨大率 （33.83%） 和出愈率 （29.50%）最低，且均顯著低于“杰兔”和“燦爛”。

2.3?植物生長調節(jié)劑對藍莓增殖效果的影響

增殖培養(yǎng)跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，愈傷組織在整個增殖周期中質地均為致密狀態(tài)，顏色由最初綠色變?yōu)楹志G色，隨著培養(yǎng)時間推移顏色不斷變深，鮮重不斷增加。培養(yǎng)至第35天左右，愈傷組織鮮重幾乎不再增加，并出現(xiàn)褐化。由表3可知，不同濃度植物生長調節(jié)劑組合對“杰兔”藍莓花藥愈傷組織增殖效果有顯著影響，其中 6號處理實際增加鮮重顯著高于其他處理，為2.96 g，增殖系數(shù)最高，為0.89;1號處理實際增加鮮重最低，為1.47 g，增殖系數(shù)也最低。綜合考慮，6號處理組合，即MS+1.00 mg/L IAA+1.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L KT+1.00 mg/L NAA對“杰兔”花藥愈傷組織增殖效果最好。

3?結論與討論

花藥離體培養(yǎng)可以使小孢子產(chǎn)生單倍體，是果樹育種中種質資源創(chuàng)新的最有效方法之一[17]，獲得的單倍體經(jīng)加倍形成純合二倍體，能加快獲得某一性狀純系，同時極大地豐富了親本種質資源，從而更好地實現(xiàn)倍性育種，加快育種進程[18-19]。目前，蘋果[17]、枇杷[15]、枸杞[20]、棗[21]、火龍果[9]、木瓜[22]、扁桃[10]、甜橙[23]、軟棗獼猴桃[24]等果樹已通過花藥或花粉培養(yǎng)獲得愈傷組織、胚狀體、單倍體植株。研究表明，植物花藥愈傷組織形成受多種因素影響，其中激素是影響花藥愈傷組織誘導的關鍵因素，植物生長調節(jié)劑的種類、濃度和配比的差異直接影響植株的再生率[11，15-16]。該研究發(fā)現(xiàn)，不同種類和不同濃度的植物生長調節(jié)劑對藍莓花藥愈傷組織的誘導均有顯著影響，這與植物生長調節(jié)劑對枇杷[15]、軟棗獼猴桃[24]等果樹的花藥愈傷誘導的影響一致。該研究以“燦爛”花藥為試材，在研究植物激素種類和濃度對愈傷組織誘導影響中獲得的最高誘導率為35.67%，與段麗君等[14]在冬棗和范建新等[9]在火龍果上的花藥愈傷誘導率相似，總體上誘導率不高，這可能是因為該研究正交實驗中植物生長調節(jié)劑的種類或濃度梯度還不夠合理，需要進一步優(yōu)化。

將不同品種的花藥接種在相同培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)“杰兔”兔眼藍莓花藥的誘導率均顯著高于“燦爛”和“粉藍”，這表明基因型對藍莓花藥愈傷組織誘導可產(chǎn)生顯著影響，這與火龍果[9]上的研究結果一致。該研究雖然通過正交試驗獲得了比較成熟的藍莓花藥愈傷組織增殖配方，但增殖系數(shù)不高 （最大僅為0.89）。因此，建議在后期的優(yōu)化研究中可添加誘導效果更好的TDZ，比較其對藍莓愈傷組織增殖和再分化的影響。

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