肖 勇，萬偉杰，鄔 磊，王冬根，周瑤敏，徐 俊

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(南昌)/江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330200)

β-受體激動(dòng)劑，俗稱瘦肉精，是具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)的腎上腺素類的合成藥物[1]。在臨床醫(yī)學(xué)上，將其作為平喘性藥物，用于治療支氣管哮喘的相關(guān)疾病[2]。以前，β-受體激動(dòng)劑在畜牧生產(chǎn)中被廣泛用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑，因?yàn)樗梢蕴岣呱i的瘦肉率，減少飼料使用、使肉品提早上市、降低成本[3]。但研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，β-受體激動(dòng)劑化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在動(dòng)物組織中很難被分解，可通過食物鏈逐漸在人體內(nèi)積累，若消費(fèi)者長(zhǎng)期食用這類食品，將可能會(huì)引起慢性或急性中毒，以及心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的病變，甚至可能誘發(fā)惡性腫瘤，因此中國和歐盟等許多國家均嚴(yán)厲禁止該類藥物用于畜禽生產(chǎn)。其實(shí)早在2002 年，我國就將β-受體激動(dòng)劑列入《食用動(dòng)物禁用獸藥及其他化合物清單》[6]。近幾年風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在利益的驅(qū)使下，違法使用β-受體激動(dòng)劑的現(xiàn)象依然嚴(yán)峻，尤其是鹽酸克倫特羅的違禁使用[7]。

目前，β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[8-9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]等。液相色譜法僅靠保留時(shí)間定性，針對(duì)復(fù)雜樣品的抗干擾能力差、靈敏度等均不能滿足當(dāng)前殘留檢測(cè)的要求；氣質(zhì)聯(lián)用法的前處理步驟需衍生，操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高、特異性強(qiáng)，并且可同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)化合物，因此是現(xiàn)階段最主要的檢測(cè)技術(shù)手段。在前處理方面，常見的凈化方法分為2種：一種是固相萃取法，另一種是QuEChERS法。在固相萃取的方法中，文獻(xiàn)報(bào)道較多的是用PCX柱[13]、HLB柱[14]和混合型MCX柱[15]對(duì)樣品進(jìn)行凈化，現(xiàn)行主流適用于動(dòng)物源性β-受體激動(dòng)劑檢測(cè)的3種國標(biāo)方法[16-18]、凈化方式采用的也是固相萃取。固相萃取方法雖然凈化效果好，但前處理過程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，不適宜用于大批量樣品的檢測(cè)。自2003年QuEChERS凈化方法[19]首次發(fā)布以來，很多報(bào)道聚焦在農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留樣品處理方面，而對(duì)獸藥殘留檢測(cè)方面報(bào)道則相對(duì)較少。

本文參照《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所自建方法)[20]，利用QuEChERS凈化方式，聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了同時(shí)分析牛肉中9種β-受體激動(dòng)劑的測(cè)定方法，優(yōu)化了流動(dòng)相、提取溶劑、定溶液和稀釋倍數(shù)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，所建立的方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、實(shí)用，為動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑的監(jiān)測(cè)提供了又一個(gè)快速、有效的方法，有利于提升對(duì)β-受體激動(dòng)劑的監(jiān)控水平，適用于在檢測(cè)機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室開展大批量樣品檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 6460-1295超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科技有限公司)，945605渦旋混合器(美國TALBOYS公司)，LXJ-IIB高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，YP5102電子天平(上海光正)，S210 pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器公司)，THZ-92B回旋式振蕩儀(上海博迅)，Milli-Q超純水儀(默克公司)，SHZ-B恒溫水浴鍋(常州金壇友聯(lián))，N-EVAP112氮吹儀(美國Organomation公司)。

試劑：特布他林標(biāo)準(zhǔn)品、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品、沙丁胺醇-D標(biāo)準(zhǔn)品、克倫特羅-D9標(biāo)準(zhǔn)品(均為德國Dr.Ehrenstorfer公司提供)；西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品、非諾特羅標(biāo)準(zhǔn)品、氯丙那林標(biāo)準(zhǔn)品、妥布特羅標(biāo)準(zhǔn)品、噴布特羅標(biāo)準(zhǔn)品(均為德國WITEGA公司提供)；P-QuEChERS-AOAC 1202提取鹽包：內(nèi)含6 g無水硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉(阿爾塔科技有限公司)；F-QuEChERS-AOAC 3202多功能針式過濾器：內(nèi)含150 mg無水硫酸鎂和50 mg PSA(阿爾塔科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別取上述9種β-受體激動(dòng)劑和2種同位素內(nèi)標(biāo)對(duì)照品適量,精密稱取,用甲醇溶解,制得100 μg/mL β-受體激動(dòng)劑的儲(chǔ)備液，于-20 ℃下避光儲(chǔ)存。

標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制：分別移取適量9種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；移取適量2種同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成10.0 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液，均在-20 ℃下避光儲(chǔ)存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：取上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.20 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成0.20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；移取0.50 mL的2種同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成0.50 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液，均在-20 ℃下避光儲(chǔ)存。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm，1.8 μm)；柱溫40 ℃；流動(dòng)相：A相0.1%甲酸水溶液，B相甲醇溶液；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量10.00 μL；梯度洗脫步驟：0～0.50 min，維持2% B；0.50～4.00 min，2% B～35% B；4～5 min，35% B～80% B；5.00～5.50 min，80% B～90% B；5.5～5.7 min，90% B～2% B；5.7～9.0 min維持2% B。

1.2.3 質(zhì)譜參數(shù) 離子源：電噴霧；掃描方式：正離子；電離電壓：4.0 kV；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；源溫：325 ℃；干燥氣流速：5 L/min；霧化氣壓力：50 psi；鞘流氣溫度：350 ℃；鞘流氣流速：12 L/min。優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)試驗(yàn)條件見表1。

表1 9種β-受體激動(dòng)劑和2種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)

1.3 樣品的處理

稱取5 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入0.02 mL 0.50 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液、10 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖液(pH=5.2)、0.04 mL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，振蕩10 min，于37 ℃下避光水浴酶解16 h，酶解后放置至室溫，加入10 mL 2%甲酸-乙腈溶液，再加入P-QuEChERS-AOAC提取鹽包，渦旋振蕩1 min，4500 r/min離心5 min，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，在離心管中加入5 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋混合30 s，4500 r/min離心1 min。吸取下清液以逐滴流出的速度勻速通過多功能針式過濾器至15 mL離心管中，準(zhǔn)確吸取5 mL濾液，于50 ℃氮吹至近干，先加0.25 mL乙腈復(fù)溶，渦旋30 s，再加入0.75 mL 0.1%甲酸水溶液，混勻，過0.22 μm的濾膜，上機(jī)待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化 β-受體激動(dòng)劑是在苯乙醇胺結(jié)構(gòu)母核的基礎(chǔ)上進(jìn)行官能團(tuán)修飾和改造后形成的一大類化合物，屬于水溶性強(qiáng)和極性多樣的化合物群。通過查閱文獻(xiàn)[21-22]，多種獸藥殘留分析中一般采用乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑作為提取試劑，甲醇、乙腈都可以降低高脂肪、高蛋白的基質(zhì)干擾，但與甲醇相比，乙腈提取時(shí)帶入的極性干擾物更少，有利于后續(xù)凈化。本研究采用空白加標(biāo)(2.0 μg/kg)的方式比較了1%甲酸-乙腈[23]、2%甲酸-乙腈[24]、5%甲酸-乙腈[25]、0.1%乙酸乙腈[20]、2%乙酸乙腈、5%氨水乙腈[26]、80%乙腈-水[27]、純乙腈等8種溶劑提取，定溶液選擇0.1%甲酸水∶甲醇=9∶1。結(jié)果表明：在提取溶劑乙腈中加入適當(dāng)?shù)乃岷螅?種化合物的回收率普遍較高，其可能原因是β-受體激動(dòng)劑一般是弱堿性化合物[24]，在酸性溶液中呈現(xiàn)離子狀態(tài)有利于提??；在酸性條件下，西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林和克倫特羅均有較理想的回收率(>80%)，但萊克多巴胺只有在2%甲酸-乙腈、5%甲酸-乙腈的提取條件下能實(shí)現(xiàn)優(yōu)于其他提取劑的回收，另外特布他林在5%甲酸-乙腈的提取條件下的回收率明顯低于2%甲酸-乙腈，故試驗(yàn)選擇2%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑(圖1)。

圖1 不同提取溶劑的回收率比較

2.1.2 定溶液的選擇 樣品上機(jī)前復(fù)溶液的確定直接影響方法的靈敏度，本文比較了定溶液中不同有機(jī)相比例后發(fā)現(xiàn)，在定溶液中加入一定比例的有機(jī)相可明顯提高對(duì)噴布特羅的響應(yīng)[28]，可有效地提高其回收率。但使用有機(jī)相比例過大時(shí)，如在使用v0.1%甲酸水∶v乙腈=1∶1[19]時(shí)發(fā)現(xiàn)，西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特羅和特布他林的出峰均出現(xiàn)分叉的情況，峰型較差，結(jié)果如圖2所示。

圖2 使用v0.1%甲酸水∶v乙腈=1∶1作為定溶液峰型分叉效果圖

最后，本試驗(yàn)比較了文獻(xiàn)報(bào)道中常見的5種定溶液組合的回收率，定溶液分別為v0.1%甲酸水∶v甲醇=9∶1[29]、0.1%甲酸水[14,24,30]、350 μL甲醇+650 μL 0.1%甲酸水[23]、250 μL乙腈+750 μL 0.1%甲酸水、v0.1%甲酸水∶v乙腈=9∶1[24]，結(jié)果如圖3所示。定溶液中水相與有機(jī)的比例對(duì)極性敏感物質(zhì)有一定的影響，本試驗(yàn)先用250 μL乙腈對(duì)氮吹干后的物質(zhì)進(jìn)行渦旋復(fù)溶，然后再加750 μL 0.1%甲酸水混勻，如此操作下各種化合物的峰型和回收率均達(dá)到滿意的效果。

圖3 5種定溶液試驗(yàn)所得各種化合物的回收率

2.1.3 流動(dòng)相選擇 基于β-受體激動(dòng)劑類藥物均具有較強(qiáng)的水溶性，而且本研究中的9種化合物既有極性(如沙丁胺醇)，也有弱極性(如克倫特羅、妥布特羅)，還有非極性(如噴布特羅)等，所以需要選擇合適的流動(dòng)相才能將各種物質(zhì)在不同的時(shí)間被洗脫下來，從而達(dá)到有效分離的目的。有文獻(xiàn)表明，在正離子掃描的模式下，流動(dòng)相加入一定量的甲酸可以提高離子化效率和分離度[31-32]，故本文比較了甲醇、乙腈作為有機(jī)相分別與0.1%甲酸溶液組成流動(dòng)相的效果。結(jié)果表明：將甲醇作為有機(jī)相時(shí)，各種化合物響應(yīng)值較高；而當(dāng)甲醇中加入0.1%甲酸后，對(duì)待測(cè)物響應(yīng)強(qiáng)度的影響不大，因此本研究選擇0.1%甲酸水-甲醇溶液作為流動(dòng)相。在該流動(dòng)相體系下，所有化合物的峰型尖銳，相互無干擾，并且可以在7 min內(nèi)完成目標(biāo)物的分離和色譜柱的分離。各種目標(biāo)化合物的選擇離子流色譜圖見圖4。

圖4 各種目標(biāo)化合物的選擇離子流色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及定量限

本方法通過使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)9種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行分析，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度作為橫坐標(biāo)，各種藥物定量離子對(duì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。β-受體激動(dòng)劑在0.25～10.00 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各種藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。試驗(yàn)采用在空白牛肉中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)定性或定量離子對(duì)色譜峰的信噪比大于10為定量限，得出各種藥物的定量限為0.25 μg/kg。

表2 牛肉中9種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度與回收率試驗(yàn)

取0.25、0.50、2.50 μg/kg共3個(gè)梯度水平的陽性添加試樣，按照“1.3樣品的處理”的步驟操作，每個(gè)濃度進(jìn)行5個(gè)平行試驗(yàn)，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，%)計(jì)算精密度，以實(shí)測(cè)濃度與理論添加濃度之比，計(jì)算各個(gè)被測(cè)物質(zhì)的方法回收率，結(jié)果在低(0.25 μg/kg)、中(0.50 μg/kg)、高(2.50 μg/kg)濃度下，β-受體激動(dòng)劑的精密度小于10%，回收率在67.73%～114.13%之間，具體結(jié)果見表3。

表3 β-受體激動(dòng)劑的精密度和回收率(n=5)

2.4 實(shí)際樣品的分析

對(duì)日常檢測(cè)任務(wù)中收集的4份陽性牛肉樣品(T1、T2、T3、T4)，分別選用本方法、國標(biāo)GB/T 21313—2007和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號(hào)公告-18—2008中的方法進(jìn)行了測(cè)試，樣品中均檢出有克倫特羅，結(jié)果見表4。說明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)牛肉中β-受體激動(dòng)劑的殘留檢測(cè)。

表4 實(shí)際樣品分析結(jié)果 μg/kg

3 結(jié)論

本研究以2%甲酸-乙腈溶液作為提取劑，采用QuEChERS前處理技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件和質(zhì)譜參數(shù)，建立了快速測(cè)定牛肉中9種常見β-受體激動(dòng)劑殘留的方法，大大簡(jiǎn)化了前處理過程；結(jié)合新型凈化方法，降低了基質(zhì)對(duì)分析物的干擾，提高了樣品的檢測(cè)效率，使得檢測(cè)更加準(zhǔn)確、可靠，為今后畜產(chǎn)品中受體激動(dòng)劑的殘留檢測(cè)提供了一種新的方法。