吳奇芳，廖燕宏，2△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，1解剖學(xué)系，2神經(jīng)系統(tǒng)疾病教育部重點實驗室，武漢 430030

異丙腎上腺素(isoprenaline，ISO)是臨床上一種常見的β腎上腺素能受體激動劑，心悸、心絞痛、高血壓等是ISO常見的副作用。這些副作用的長期存在可引起心肌的病理性重構(gòu)，加之ISO本身的細(xì)胞毒性可能會造成心肌細(xì)胞的損傷，因而會促進(jìn)心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)的發(fā)生。MF是心肌組織在受到各種內(nèi)外環(huán)境損傷時發(fā)生的一種病理性改變，其主要的組織學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在心肌間質(zhì)內(nèi)的過度沉積及肌成纖維細(xì)胞的聚集。Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ，COL-1)是ECM中的主要蛋白質(zhì)，在發(fā)生MF時表達(dá)量顯著升高。α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)被認(rèn)為是成纖維細(xì)胞活化后向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，心肌組織中α-SMA蛋白表達(dá)量的增高也可提示MF的發(fā)生。

經(jīng)典瞬時受體電位通道(transient receptor potential canonical，TRPC)是一種廣泛表達(dá)在心臟、腎臟、腦等各種重要臟器中的非選擇性陽離子滲透通道[1]，與多種臟器的多種疾病息息相關(guān)。TRPC通道以同源或異源四聚體的形式，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子(calcium，Ca2+)濃度。TRPC通道所介導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度的增高，是某些信號通路激活的前提，其在諸如心肌肥大、心肌纖維化等心血管疾病發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。TRPC通道與臟器纖維化之間的關(guān)系在近期常被報道，且蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)/糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)和胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)蛋白的相關(guān)通路一直是纖維化研究領(lǐng)域的熱點。但是，利用TRPC6基因敲除(TRPC6 knockout，TRPC6-/-)小鼠探究TRPC6通過AKT/GSK-3β和ERK信號通路對ISO誘導(dǎo)心肌纖維化產(chǎn)生影響的相關(guān)研究尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

本實驗所用的野生型(wild type，WT)小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，TRPC6-/-型小鼠由美國NIH/NIEHS Lutz Birnbaumer實驗室提供。異丙腎上腺素粉劑購于Sigma公司；組織化學(xué)染色試劑盒購于北京Solarbio公司；纖維化相關(guān)指標(biāo)抗體及通路抗體購于CST公司。

1.2 模型構(gòu)建與分組

取6～8周齡(體重約20～25 g)WT和TRPC6-/-成年雄性健康小鼠各40只，使用生理鹽水(Saline)或ISO對小鼠進(jìn)行腹腔注射，將小鼠按基因型和用藥的不同隨機(jī)分為以下4組：WT Saline組；WT ISO組；TRPC6-/-Saline組；TRPC6-/-ISO組，每組20只。Saline組小鼠使用生理鹽水，ISO組小鼠使用ISO，分別連續(xù)行腹腔注射10 d，注射劑量為每只小鼠50 mg/(kg·d)，給藥間隔為24 h，建立小鼠心肌纖維化模型。

1.3 小鼠的一般生存情況記錄

每日對小鼠的一般生存情況進(jìn)行觀察并記錄。

1.4 心肌組織的固定與取材

麻醉小鼠，將其固定并打開胸腔，充分暴露心臟。由心尖部將靜脈注射針頭插入左心室適量長度，剪開右心耳，推注50 mL預(yù)熱的生理鹽水后更換為4%的多聚甲醛繼續(xù)勻速推注，至小鼠全身肌肉僵直后停止，剪取心臟，移入4%多聚甲醛液體中固定24 h待用。

1.5 心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及結(jié)果判讀

取固定好的小鼠心臟的心室分別行石蠟及OCT(optimal cutting temperature compound)包埋劑包埋后切片，而后分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)、Masson、天狼猩紅及免疫熒光染色，光學(xué)顯微鏡及共聚焦顯微鏡下分別觀察并采集圖像。

結(jié)果判讀：HE染色可顯示心肌組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞變性及心肌細(xì)胞排列情況；Masson、天狼猩紅染色可顯示組織內(nèi)沉積的膠原纖維以及心肌排列情況。

1.6 組織蛋白的提取

麻醉小鼠后剪取心尖組織，放入裂解液內(nèi)充分研磨，研磨后行超聲破碎，而后進(jìn)行離心(12000×g，30 min)。離心后取上清液，加入相應(yīng)體積的上樣緩沖液(loading buffer)振蕩混勻，熱水浴變性蛋白。

1.7 Western blot(WB)檢測心肌組織纖維化指標(biāo)及通路蛋白表達(dá)水平

變性好的蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、相關(guān)一抗孵育(工作濃度1∶1000)，二抗孵育(工作濃度1∶2500)，TBST洗滌后使用ECL法顯影并采集圖像。通過Image Lab、Image J軟件對條帶強(qiáng)度進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參，測定相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般生存情況

對小鼠的一般生存情況進(jìn)行動態(tài)記錄，結(jié)果顯示：注射Saline的兩組小鼠一般狀態(tài)良好。與Saline組相比，ISO組小鼠表現(xiàn)出明顯的精神狀態(tài)欠佳，活動度下降，毛發(fā)粗糙且無光澤。注射Saline的兩組小鼠10 d內(nèi)均沒有死亡，注射ISO的兩組小鼠中：WT ISO組小鼠死亡11只，存活9只；TRPC6-/-ISO組小鼠死亡7只，存活13只。對小鼠的存活及死亡數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計分析可知，在為期10 d的腹腔注射周期中，注射ISO的兩組小鼠死亡率明顯增高，但TRPC6-/-ISO組小鼠死亡率較WT ISO組小鼠低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 敲除TRPC6對ISO導(dǎo)致的小鼠心肌纖維化的影響

2.2.1 TRPC6在各組小鼠心肌組織中的表達(dá) 取各組小鼠的心肌組織行免疫熒光染色，并對WT兩組進(jìn)行WB檢測，觀察各組小鼠TRPC6蛋白的表達(dá)情況。免疫熒光結(jié)果顯示：WT Saline組小鼠的心肌組織中可見基礎(chǔ)的TRPC6表達(dá)量，而WT ISO組小鼠的心肌組織中TRPC6表達(dá)量明顯增高；TRPC6-/-Saline組及TRPC6-/-ISO組小鼠心肌組織中TRPC6表達(dá)量均較低，統(tǒng)計學(xué)分析表明，WT ISO組與其他3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖1A)。本實驗室此前關(guān)于心肌缺血再灌注研究中的WB結(jié)果顯示，TRPC6-/-小鼠心臟組織中幾乎無TRPC6通道蛋白的表達(dá)[2]。本研究中WB檢測結(jié)果顯示：較WT Saline組小鼠，WT ISO組小鼠心臟組織中TRPC6蛋白表達(dá)量明顯增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。

2.2.2 各組小鼠心肌組織的形態(tài)學(xué)變化及TRPC6敲除對纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 HE染色，光學(xué)顯微鏡下可見，注射Saline的兩組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，心肌細(xì)胞排列整齊有序，無水腫，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；WT ISO組小鼠心室壁增厚，心肌細(xì)胞排列紊亂，伴心肌細(xì)胞明顯水腫壞死及間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤；TRPC6-/-ISO組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)大致正常，排列紊亂程度較輕，炎性細(xì)胞浸潤較少。Masson及天狼猩紅染色提示，注射Saline的兩組小鼠心臟未見明顯膠原沉積；WT ISO組小鼠心室內(nèi)側(cè)壁可觀察到膠原纖維沉積明顯增加，心肌層次排列極其紊亂；與WT ISO組小鼠相比，TRPC6-/-ISO組小鼠心肌組織內(nèi)膠原纖維沉積減少(圖2A)。

A：各組小鼠心肌組織中TRPC6蛋白熒光水平(標(biāo)尺=50 μm)；B：WT組小鼠心肌組織中TRPC6蛋白表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01圖1 TRPC6通道蛋白在CF小鼠心肌組織中的表達(dá)水平Fig.1 Expression level of TRPC6 channel protein in myocardial tissue of CF mice

本研究中WB結(jié)果提示，與注射Saline的兩組相比，注射ISO的兩組小鼠心肌組織內(nèi)α-SMA及COL-1蛋白表達(dá)量均有增加，但TRPC6-/-ISO組小鼠較WT ISO組小鼠心肌組織內(nèi)α-SMA及COL-1蛋白表達(dá)量可見明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖2B)。

A：各組小鼠心肌組織病理改變(標(biāo)尺=50 μm)；B：各組小鼠心肌組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平；*P<0.05 **P<0.01圖2 TRPC6-/- 對小鼠心肌組織纖維化的影響Fig.2 Effects of TRPC6-/- on myocardial fibrosis in mice

2.3 TRPC6敲除對AKT/GSK-3β和ERK信號通路相關(guān)蛋白的影響

對各組小鼠的心肌組織進(jìn)行AKT/GSK-3β和ERK信號通路內(nèi)相關(guān)蛋白檢測，結(jié)果顯示：腹腔注射ISO的兩組小鼠心肌組織內(nèi)磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-protein kinase B，p-AKT)、磷酸化糖原合酶激酶-3β(phosphorylated-glycogen synthase kinase-3β，p-GSK-3β)及磷酸化胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)蛋白表達(dá)量均增加，但TRPC6-/-ISO組小鼠的p-AKT、p-GSK-3β及p-ERK蛋白表達(dá)量低于WT ISO組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖3)。

*P<0.05，**P<0.01圖3 TRPC6-/- 對小鼠心肌組織中AKT/GSK-3β和ERK信號通路的影響Fig.3 Effects of TRPC6-/- on AKT/GSK-3β and ERK signaling pathways in myocardial tissue of mice

3 討論

心臟是由心肌為主構(gòu)成的人體最重要的器官之一，其主要功能是為血液循環(huán)提供動力，使其得以運行至全身各個部分。當(dāng)機(jī)體所處的各種內(nèi)外環(huán)境改變導(dǎo)致心肌損傷后，可引起MF。心臟內(nèi)的成纖維細(xì)胞在各種損傷刺激下活化后向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，分泌大量以Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白為主的相關(guān)蛋白質(zhì)，并沉積在ECM中[3]。根據(jù)既往研究顯示，心臟內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白含量增加會明顯增加組織硬度，導(dǎo)致MF進(jìn)一步加重。α-SMA是細(xì)胞骨架蛋白微絲系統(tǒng)的一部分，在肌成纖維細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)心肌組織發(fā)生MF時，α-SMA是成纖維細(xì)胞活化的一個標(biāo)志，提示MF改變。MF是一種常見的心臟病理性重塑，可引起心室壁僵硬，心臟收縮力降低，心臟整體性能受損，以及心臟傳導(dǎo)功能異常，包括心律失常[4-5]、心肌肥厚[6]和心力衰竭[7]等。同時，各類心臟疾病也會導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生并加速MF所致的心力衰竭的進(jìn)展，例如高血壓性心臟病、擴(kuò)張型心肌病、缺血性心肌病及炎癥性心臟病[8]等，從而大大影響了患者的預(yù)后及病死率。因此，針對MF的藥物研究對現(xiàn)代心臟病學(xué)具有重大意義。

TRPC超家族包括7個亞型，分別是TRPC1～7，其中TRPC2亞型在人類體內(nèi)是偽基因。根據(jù)序列對比和功能比較，哺乳動物體內(nèi)的TRPC通道又可被分為TRPC1、TRPC2、TRPC3/6/7和TRPC4/5等4個亞家族[9]。在絕大多數(shù)的主要器官中，TRPC通道普遍表達(dá)并有助于各器官的正常發(fā)育和功能，其功能失調(diào)常與多種器官疾病的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。TRPC通道基因與組織纖維化的關(guān)系在越來越多的文獻(xiàn)中被論述：TRPC6在各種蛋白尿性腎臟疾病中起到關(guān)鍵作用，且TRPC6通道基因的突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的腎病綜合征，進(jìn)一步導(dǎo)致終末期腎病，發(fā)生腎臟纖維化[10]；TRPC6的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)克羅恩病中狹窄性腸纖維化的發(fā)生；TRPC3通道蛋白參與腎小管間質(zhì)損傷和梗阻性腎病中纖維化的發(fā)生[11]；敲低TRPC3通道蛋白，可顯著抑制人心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞的纖維化反應(yīng)；下調(diào)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中TRPC3的表達(dá)，可降低其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘導(dǎo)的凋亡的敏感性[12]。另外，TRPC通道功能的障礙涉及多種心血管疾病，與心臟的病理性重構(gòu)也表現(xiàn)出關(guān)聯(lián)性。然而，在小鼠的心肌組織中僅表達(dá)TRPC 7個亞型中的5個，其中TRPC5和TRPC7不表達(dá)[2]。本實驗室之前的研究中探究了TRPC3和TRPC6在心肌缺血再灌注中的作用，結(jié)果顯示，在心臟發(fā)生缺血再灌注時，心肌細(xì)胞可通過CaMKⅡ-Calcineurin-NFAT3c信號途徑，正反饋增高TRPC3和TRPC6的表達(dá)[2]。另有研究亦表明，體內(nèi)的選擇性TRPC6抑制劑BI749327，可有效抑制小鼠心臟、腎臟的應(yīng)激性纖維化和功能障礙[13]。但是，利用TRPC6-/-小鼠對ISO誘導(dǎo)的心肌纖維化的相關(guān)探究未見報道。

作為一種臨床上常用的β腎上腺素能受體激動劑，ISO可對心肌組織造成損傷從而導(dǎo)致組織內(nèi)炎癥，繼而引起心肌組織間成纖維細(xì)胞過度增殖和ECM過度積累[14]，產(chǎn)生修復(fù)性纖維化。在關(guān)于MF相關(guān)通路的研究中，轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smads、AKT/ GSK-3β和ERK等蛋白相關(guān)信號通路一直是探究的熱點。本研究通過對小鼠進(jìn)行連續(xù)大劑量的ISO腹腔注射，構(gòu)建小鼠心肌纖維化模型，探究TRPC6通道通過介導(dǎo)AKT/GSK-3β和ERK信號通路對ISO誘導(dǎo)的小鼠MF的影響。

通過對各組小鼠的一般生存情況進(jìn)行動態(tài)觀察，結(jié)果顯示，注射ISO的兩組小鼠均有一定程度的一般狀態(tài)變差及死亡，但與WT小鼠相比，TRPC6基因敲除能有效改善ISO注射后小鼠的一般情況，并降低小鼠的死亡率。利用組織免疫熒光技術(shù)及WB分析也顯示，WT ISO組小鼠心肌組織中TRPC6蛋白表達(dá)量明顯高于WT Saline組小鼠，提示TRPC6可能參與ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化過程。同時，本研究組織化學(xué)及WB分析的結(jié)果顯示，ISO可以誘導(dǎo)WT及TRPC6-/-小鼠發(fā)生MF，但與WT小鼠相比，TRPC6-/-小鼠的心肌組織內(nèi)浸潤的炎性細(xì)胞及沉淀的膠原蛋白明顯減少，α-SMA和COL-1蛋白表達(dá)水平下降。上述結(jié)果提示，敲低TRPC6基因表達(dá)可能抑制心肌組織損傷后纖維化的形成。

AKT/GSK-3β和ERK的相關(guān)通路是組織纖維化研究領(lǐng)域的熱點。小鼠主動脈縮窄術(shù)引發(fā)小鼠心肌間質(zhì)纖維化的模型中，阿司匹林可能通過下調(diào)ERK、減少p-AKT的表達(dá)，阻斷絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/ERK以及p-AKT/ β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路，抑制心肌成纖維細(xì)胞中膠原的生成以及主動脈縮窄模型小鼠的MF[15]。有研究證明，GSK-3β可有效抑制膠原蛋白的產(chǎn)生，然而p-GSK-3β可抑制其活性，并促進(jìn)膠原蛋白的沉積。在血管緊張素Ⅱ灌注模型中，小分子Dickkopf(DKK)3蛋白的過表達(dá)可通過調(diào)節(jié)GSK-3β/β-catenin通路滅活p-GSK-3β，從而減輕MF[16]。ERK相關(guān)信號通路在多種器官的纖維化中起到關(guān)鍵作用，例如血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)增加大鼠體內(nèi)腎素分泌，從而激活大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和MAPK/ERK通路，并同時造成相關(guān)的器官損傷，如腎臟和心臟的肥大以及纖維化[17]。本實驗結(jié)果表明，ISO組小鼠心肌組織的p-ERK、p-AKT和p-GSK-3β蛋白表達(dá)量明顯增高，但TRPC6-/-ISO組小鼠心肌組織中的p-ERK、p-AKT和p-GSK-3β蛋白表達(dá)量較WT ISO組小鼠明顯降低。表明敲低TRPC6基因可能通過AKT/GSK-3β和ERK信號通路抑制MF的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，本實驗的研究結(jié)果表明，在ISO的持續(xù)性損傷刺激下，心肌細(xì)胞內(nèi)TRPC6表達(dá)上調(diào)，且TRPC6可通過調(diào)控AKT/GSK-3β和ERK的磷酸化水平，來發(fā)揮其在MF發(fā)生發(fā)展中的作用。敲除TRPC6基因可減輕ISO所誘導(dǎo)的MF。因此，本研究提示TRPC6可能成為改善和攻克MF的全新治療靶點，為MF的治療提供了嶄新的思路。