秦 凱，簡丹妮, 熊慧華，彭 慧，袁響林，程 熠△

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院腫瘤科，武漢 430030 2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，武漢 430022

乳腺癌是全世界女性中最常見的惡性腫瘤之一。臨床上，這種高度異質性疾病被分為3個基本亞型，即雌激素受體(ER)陽性、人表皮生長因子受體2(HER2)擴增型和三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)，后者缺乏雌激素受體(ER)、孕酮受體(PR)和HER2[1-2]。TNBC在非裔美國婦女中的發(fā)病率較高[2]，目前還沒有針對這種疾病的特定靶向治療方法。與其他亞型相比，TNBC患者局部或遠處復發(fā)的風險更高，預后更差[2-4]。

TP53在遺傳毒性應激誘導細胞周期阻滯方面起到重要作用，并借此維持基因組的完整性。大約30%的乳腺癌患者中含有TP53基因的體細胞突變。超過80%的TNBC患者存在TP53點突變或缺失[5-6]。野生型TP53細胞的主要特征是細胞可以老化，但突變型則不能，因此TP53突變狀態(tài)與化療耐藥有關。TP53突變狀態(tài)也與乳腺癌患者治療反應差和生存率下降有關[7-8]。因此，迫切需要采用新的治療策略來克服TP53突變患者固有的化療耐藥性。在真核細胞中，細胞周期受3個檢查點(G1/S、S期和G2/M檢查點)的精細調節(jié)，而p53調節(jié)G1/S檢查點。因此，TP53缺陷細胞通過ATR/Chk1途徑依賴G2/M期檢查點來阻止DNA損傷后細胞周期的進展。細胞周期檢查點激酶1(cell cycle checkpoint kinase 1，Chk1)和(或)ATR抑制可能導致TP53缺陷型腫瘤的有絲分裂改變和凋亡[9]。

臨床前研究數(shù)據(jù)顯示，Chk1抑制劑(Chk1 inhibitor，Chk1 i)選擇性地增強DNA損傷劑(如順鉑)在TP53突變癌細胞中的作用[10-12]。近年來，大量的Chk1/Chk2抑制劑被開發(fā)用于治療多種癌癥。AZD7762是一種新的ATP位點依賴性等電位抑制劑。它對檢查點激酶表現(xiàn)出比其他激酶更高的特異性[13]。在這項研究中，我們研究了AZD7762對TNBC細胞的作用，探討AZD7762是否能提高TNBC細胞對順鉑的敏感性。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞系BT-549、HCC70、MDA-MB-231、T47D和MCF-7(American type culture collection，美國)在含有10%胎牛血清(Invitrogen，美國)的DMEM中培養(yǎng)。

1.2 siRNA與慢病毒體外轉染

采用Control、Chk1和Chk2 ON-TARGET plus siRNA SMARTpool(GE Dharmacon，美國),按照說明書以Lipofectamine-3000在40 nmol/L的最終濃度下進行siRNA體外轉染。

1.3 細胞活力測定

細胞[5000個細胞(100 μL/孔)]在96孔板(Sarstedt，德國)中培養(yǎng)，并在指定的時間點以指定濃度藥物處理。CCK8分析法(Dojindo molecular technologies，日本)用于評估細胞活力，以載體處理的對照組對數(shù)據(jù)進行標化。所有細胞活力實驗重復進行3次。

1.4 集落形成實驗

細胞(1000個細胞/孔)置于6孔板中，與指定藥物一起孵育7～10 d。存活克隆用4%甲醛固定5 min后用0.5%結晶紫在無水乙醇中染色。然后用數(shù)字掃描儀(佳能CANOSCANNLIDE220掃描儀)拍攝細胞照片。

1.5 組合指數(shù)分析

在96孔板中加入100 μL細胞懸液(約5000個細胞)，并在37℃下用遞增劑量的AZD7762(稀釋比1∶4，Selleckchem，美國)和順鉑(稀釋比1∶4，Sigma-Aldrich，美國)孵育72 h。采用1.3項方法評估細胞活力。利用CalcuSyn軟件，用Chou-Talalay方程計算2種化合物的協(xié)同效應，得到效價(IC50值)和劑量-效應曲線。組合指數(shù)(CI)小于0.5表示協(xié)同作用，CI大于0.5表示有無協(xié)同作用。所有細胞活力實驗重復進行3次。

1.6 細胞周期分析

細胞在指定藥物濃度處理24 h后，收集細胞，用70%乙醇固定，并在-20℃下儲存24 h。在PBS中2次洗滌后，用碘化丙二鈉(PI 5 mg/mL，NaCl 9.65 mmol，0.1%檸檬酸三鈉和RNase A 100 mg/mL)在室溫下染色0.5 h。在FACS-Canto系統(tǒng)(BD Biosciences，美國)中檢測細胞周期曲線，并使用FlowJo軟件進行分析。

1.7 膜聯(lián)蛋白-Ⅴ染色

細胞在指定藥物濃度處理24 h后取細胞，用Annexin Ⅴ/PI染色。用流式細胞術(FACS-Canto)計算Annexin Ⅴ-PI陽性細胞的百分比。數(shù)據(jù)以至少2個獨立實驗的平均值表示。

1.8 MCF-7-shp53細胞的建立

當對數(shù)生長的MCF-7細胞達到大約60%的融合率時，利用對照逆轉錄病毒(MKOPuro)或表達p53特異性shRNA的逆轉錄病毒(pMKOPuro)感染MCF-7細胞，其MOI為10。24 h后，更換培養(yǎng)液，在1 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)液中篩選細胞。收集并擴增耐藥細胞株。細胞裂解，蛋白質敲除用免疫印跡法驗證。

1.9 免疫印跡法(Western blot)

細胞裂解物在裂解緩沖液[1% NP-40、0.1 mol/L KH2PO4(pH 7.5)、0.1 mmol/L β-甘油磷酸鹽和1×完整蛋白酶抑制劑混合物(羅氏診斷公司)]中制備。將來自每個樣品的總共30 mg全細胞裂解物在Mini-Protean TGX無染色預制凝膠(Bio-Rad，美國)上電泳，印跡到硝酸纖維素膜上，并與這些主要抗體一起孵育過夜：Chk1(#2345S)、磷酸化Chk1(Ser296)(#2349S)、磷酸化H2AX(Ser139)(γ-H2AX)(#2577S)、裂解的PARP(Asp214)(#5625)和PARP1(#9542S)(Cell Signaling，USA)。Chk2(sc-5278)、p53(sc-126)(Santa Cruz，美國)和抗β-肌動蛋白抗體(Sigma，Merck KGaA，Darmstadt，德國)用作內參對照。

1.10γ-H2AX/磷酸化組蛋白H3/碘化丙啶共染色

將細胞(5×105/mL)接種到96孔板，并按照說明書在37℃處理48 h。然后收集細胞并在-20℃下用70%乙醇固定24 h。在用PBS加0.5% Tween 20和PBS+0.1%BSA洗滌2次后，用Alexa-Fluor?488結合磷酸化組蛋白H3抗體(#9708，Cell Signaling，美國)，稀釋比為1∶200、PE-CF594小鼠抗H2AX(pS139)(#564719，BD Biosciences，美國，稀釋比為1∶200)和組蛋白H2AX兔pAb(A11540，Abclonal，中國，稀釋比為1∶1000)培養(yǎng)細胞，在冰上放置1 h。在PBS中2次洗滌后，用70%乙醇固定細胞并在-20℃下保存24 h，然后在室溫下用PI染色液(PI 5 mg/mL，NaCl 9.65 mmol/L，0.1%檸檬酸三鈉和RNase A 100 mg/mL)染色0.5 h。使用BD FACS Canto進行細胞周期分析和磷酸化組蛋白H3或H2AX陽性細胞的檢測。使用FlowJo軟件進行定量分析。

1.11統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 乳腺癌細胞對AZD7762的敏感性依賴于TP53狀態(tài)

我們首先評估了AZD7762對5種乳腺癌細胞株(BT-549、HCC70、MDA-MB-231、T47D和MCF-7)細胞活力的影響。細胞暴露于不同濃度的AZD7762中，用CCK8法測定細胞活力。分別計算每個細胞系的IC50值。結果顯示，AZD7762以劑量和時間依賴的方式誘導上述癌細胞死亡(圖1A)。IC50值表明MCF-7是最具AZD7762耐藥性的乳腺癌細胞系(圖1A)。對這些細胞系中常見突變與IC50值之間的關聯(lián)分析表明，其對AZD7762的敏感性與TP53突變狀態(tài)相關，而與ARID1A、ATM、ATR、BRCA1/2、KRAS、PIK3CA和PTEN無關(圖1B)。

為了進一步研究乳腺癌細胞對AZD7762的敏感性與TP53突變狀態(tài)之間的關系，我們建立了1對由MCF-7(p53WT)和MCF-7-shp53細胞(轉染p53慢病毒shRNA的衍生細胞系)組成的乳腺癌細胞系。p53基因敲除的有效性通過Western blot進行驗證(圖1C)。將2株細胞分別暴露于不同劑量的AZD7762，用集落形成實驗和CCK8實驗評估細胞活力。如CCK8和集落形成分析所示(圖1D和圖1E)，MCF-7-shp53細胞比MCF-7-p53WT細胞對AZD7762更敏感。

2.2 AZD7762通過促進DNA損傷和凋亡導致細胞死亡

為了探討AZD7762對乳腺癌細胞毒性作用的潛在機制，我們用不同的方法對乳腺癌細胞進行凋亡檢測。Annexin-Ⅴ凋亡測定結果再次驗證了細胞活力實驗結果，即AZD7762顯著增加了乳腺癌細胞凋亡(圖2A)。凋亡標記物cleaved PARP的表達證

A：5種乳腺癌細胞系經(jīng)不同劑量AZD7762作用96 h后的藥物反應曲線；B：左為測試5種細胞系中的選定突變，TP53突變與AZD7762敏感性相關，右為AZD7762在5種乳腺癌細胞中的IC50；C：蛋白質印跡驗證MCF-7 shp53細胞中p53的穩(wěn)定抑制；D：CCK8法測定MCF-7或MCF-7 shp53細胞活力；E：100 nmol/L AZD7762處理12 d后MCF-7和MCF-7 shp53細胞集落形成的代表性圖像；與cont組比較，**P<0.01圖1 乳腺癌細胞對AZD7762的敏感性依賴于TP53狀態(tài)Fig.1 The sensitivity of breast cancer cells to AZD7762 was dependent on TP53 status

實凋亡誘導具有劑量和時間依賴性(圖2B)。AZD7762顯著下調Chk1功能抑制的標志物磷酸化Chk1 ser296的表達，表明其對靶點的影響，并增加DNA損傷標記物γ-H2AX的表達，證實其對DNA損傷的誘導效應(圖2C)。通過流式檢測發(fā)現(xiàn)MCF-7-shp53細胞的凋亡率高于MCF-7細胞，證實了AZD7762是通過p53突變依賴性地誘導凋亡(圖2D)。泛半胱氨酸蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK對凋亡途徑的抑制有效地降低了AZD7762的藥物殺傷力(圖2E)，證實了AZD7762通過誘導乳腺癌細胞凋亡而導致的細胞死亡。

A：T47D細胞暴露于指定濃度的AZD7762 24 h后的代表性流式細胞圖；B：條形圖顯示通過流式細胞術分析T47D細胞觀察到的時間和劑量依賴性凋亡；C：Western blot檢測cleaved PARP1(用于測量凋亡細胞死亡的c-PARP1)和H2AX(測量DNA損傷)；D：顯示MCF-7或MCF-7 shp53細胞暴露于指定劑量AZD7762 24 h后的代表性流式細胞圖；E：用不同濃度的AZD7762處理T47D細胞，加入或不加入Z-VAD-FMK(泛半胱天冬酶抑制劑)，96 h后用CCK8法檢測細胞活力，與DMSO+AZD7762組比較，**P<0.01。圖2 AZD7762通過增加DNA損傷和細胞凋亡導致細胞死亡Fig.2 AZD7762 resulted in cell death by increasing DNA damage and apoptosis

2.3 AZD7762終止TP53突變細胞S期和G2/M期阻滯

TP53突變癌細胞的特征是G1/S檢查點缺陷。為了評價AZD7762對細胞周期進程的影響，我們用AZD7762(IC50)處理細胞24 h，然后對PI和磷酸組蛋白H3(有絲分裂的標志物)進行染色。結果表明，AZD7762使TP53突變型乳腺癌細胞的G1期細胞數(shù)減少，S期和G2/M期細胞數(shù)顯著增加(圖3A)，尤其是M期細胞數(shù)(P<0.01)(圖3A、3B)。此外，AZD7762顯著增加了MCF-7-shp53細胞中S期和M期的細胞數(shù)量(均P<0.01)，但在野生型細胞中沒有(圖3C)，證實其依賴于細胞的TP53狀態(tài)發(fā)揮作用。

2.4 AZD7762增加TP53突變型乳腺癌細胞對順鉑的敏感性

順鉑是臨床治療乳腺癌常用的化療藥物。與先前關于TP53突變與化療耐藥相關的報道一致，我們發(fā)現(xiàn)MCF-7-shp53細胞比MCF-7細胞對順鉑更具耐藥性(圖4A)。Western blot分析顯示，順鉑增加了T47D細胞中Chk1磷酸化(圖4B)，可能導致順鉑耐藥，為Chk1抑制劑和順鉑聯(lián)合治療提供了理論依據(jù)。接下來，我們評估AZD7762是否提高細胞(特別是對順鉑耐藥的TP53突變細胞)對順鉑的敏感性。根據(jù)CCK8和集落形成分析(圖4C、4D)，AZD7762和順鉑聯(lián)合比單一作用具更強的細胞毒性(P<0.01)。用不同的組合指數(shù)(CI)分析進一步評價AZD7762與順鉑的協(xié)同作用。等容圖分析表明，聯(lián)合療法對T47D細胞(CI=0.2045)和MDA-MB-231細胞(CI=0.1204)的抗腫瘤作用是協(xié)同作用而不是相加的(圖4C)。接下來，我們發(fā)現(xiàn)AZD7762和順鉑無論作為單一藥物或聯(lián)合使用均會導致DNA損傷。Western blot結果顯示，與單一藥物相比，聯(lián)合作用顯著增加了DNA損傷誘導(γH2AX)和凋亡(PARP1斷裂)(圖4E)。

為了證實AZD7762對TP53突變細胞順鉑致敏的靶向效應，我們通過siRNA敲除T47D細胞中的Chk1、Chk2或兩者。Chk1或Chk2的敲除增加了順鉑的細胞殺傷效應和DNA損傷誘導(圖4F，P<0.01)。綜上所述，上述結果表明，通過在化療中加入Chk1抑制劑，可以克服TP53突變型乳腺癌細胞對順鉑的耐藥性。

A：上圖為50 nmol/L AZD7762處理24 h的T47D細胞的代表性細胞周期分析；下圖為50 nmol/L AZD7762處理T47D細胞24 h，并進行pH3和PI染色流式細胞術分析；B：50 nmol/L AZD7762作用24 h后T47D和MDA-MB-231細胞中不同細胞周期分布；C：500 nmol/L AZD7762處理24 h的MCF-7和MCF-7 shp53細胞中不同細胞周期分布；與DMSO處理組比較，**P<0.01圖3 AZD7762終止S期和G2/M期細胞周期停滯Fig.3 AZD7762 abrogated S and G2/M phase cell cycle arrest

A：條形圖顯示MCF-7或MCF-7 shp53細胞經(jīng)順鉑(100 μmol/L)處理48 h后的存活率，**P<0.01；B：用順鉑(50 μmol/L)孵育48 h后T47D細胞中指示蛋白的表達；C：順鉑與AZD7762聯(lián)合作用72 h(AZD7762∶順鉑=1∶100)對T47D和MDA-MB-231細胞的藥物反應曲線，用Chou-Talalay方程計算CI值；D：T47D和MDA-MB-231細胞集落形成，按說明書處理10 d，結晶紫染色。E：用10 nmol/L對照siRNA、si-Chk1轉染T47D細胞，觀察順鉑(50 μmol/L)、AZD7762(50 nmol/L)和聯(lián)合治療48 h后T47D細胞中所示蛋白的表達；F：si-Chk2或si-Chk1/2治療24 h，然后用順鉑(25 μmol/L)給藥48 h，用CCK8法分析生存率。**P<0.01。圖4 AZD7762使TP53突變型乳腺癌細胞克服順鉑耐藥Fig.4 AZD7762 sensitized TP53 mutant breast cancer cells to cisplatin

2.5 順鉑聯(lián)合AZD7762誘導TP53突變型乳腺癌細胞有絲分裂改變

在TP53突變細胞中，功能性Chk1對于S和G2細胞周期檢查點至關重要。因此，我們研究了DNA損傷和凋亡是否與有絲分裂改變誘導的細胞死亡有關。用細胞周期指示劑PI、DNA損傷標記物γH2AX和有絲分裂標記物磷酸組蛋白H3共染色。AZD7762和順鉑聯(lián)合作用顯著增加了γH2AX染色，而順鉑或AZD7762單藥作用可導致細胞發(fā)生輕度或中度的DNA損傷(圖5A和圖5B)。AZD7762誘導的γH2AX陽性細胞主要處于S期和G2/M期。AZD7762和順鉑聯(lián)合治療增加了γH2AX陽性G2/M細胞群，表明AZD7762消除了G2/M期阻滯(圖5C)。此外，大多數(shù)G2/M期細胞呈γH2AX陽性(圖5D)。這些數(shù)據(jù)表明AZD7762作為Chk1抑制劑可通過消除G2/M檢查點阻滯使細胞對順鉑敏感，使含有高水平DNA雙鏈斷裂的細胞進入有絲分裂，導致有絲分裂的改變。

A：將T47D細胞與順鉑(50 μmol/L)、AZD7762(50 nmol/L)共孵育48 h，H2AX和PI染色后流式細胞儀檢測；B：T47D細胞中γH2AX陽性群體的百分比；C：在T47D中量化γH2AX陽性G2/M期細胞；D：T47D細胞轉染10 nmol/L對照siRNA，si-Chk1，si-Chk2或si-Chk1/2持續(xù)24 h，用順鉑(50 μmol/L)給藥48 h，H2AX和PI染色后流式細胞術檢測，對γH2AX陽性G2/M期細胞進行定量分析；**P<0.01。圖5 順鉑聯(lián)合AZD7762誘導TP53突變型乳腺癌細胞有絲分裂改變Fig.5 Cisplatin plus AZD7762 induced mitotic mutation in TP53 mutant breast cancer cell

3 討論

TNBC是最致命的乳腺癌亞型，預后最差，現(xiàn)有的治療策略對其沒有特定的分子靶點[14]。因此，開發(fā)TNBC的靶向治療方法是乳腺癌研究的重中之重。本研究發(fā)現(xiàn)TNBC的TP53突變可能是Chk1抑制藥物AZD7762單藥作用或與順鉑聯(lián)合作用的有效靶點。AZD7762與順鉑聯(lián)合應用不僅協(xié)同降低了細胞活力，而且加重了DNA損傷，證實了細胞周期檢查點的損傷和DNA損傷的累積作用。

TP53在各種壓力下被激活，通過誘導DNA修復、細胞周期停滯和凋亡來抑制細胞轉化。TP53突變型腫瘤細胞依賴Chk1/2阻滯S期和G2/M期細胞周期。Cdc25A磷酸酶是Chk1的關鍵靶點，在DNA損傷的情況下可以磷酸化，導致Cdc25A蛋白水解和細胞周期停滯[15-16]。當Chk1抑制阻斷S和G2/M檢查點時，p53缺陷的癌細胞發(fā)生有絲分裂改變和凋亡。最近的研究報道了不同的Chk1/Chk2抑制劑作為單一療法，或聯(lián)合化療(放療)治療各種類型癌癥的療效[7，17-19]。Gadhikar等[20]發(fā)現(xiàn)Chk1/2抑制劑可逆轉TP53突變型頭頸癌細胞的順鉑耐藥。與這些研究結果一致，我們證實Chk1在TP53突變型乳腺癌細胞的存活中起著決定性的作用。AZD7762降低細胞活力的方式具有劑量和時間依賴性，且敏感性與細胞的TP53突變狀態(tài)相關。Chk1磷酸化CDC25A和CDC25C導致其失活/降解，阻止它們激活細胞周期蛋白依賴激酶。綜上所述，我們的研究表明順鉑和AZD7762相互作用誘導TP53突變型乳腺癌細胞死亡。DNA損傷的增加是評價細胞對聯(lián)合治療反應的替代指標。

目前的數(shù)據(jù)有力地支持了Chk1抑制劑藥物AZD7762和順鉑聯(lián)合治療TP53突變型乳腺癌的臨床前評估。未來的研究將集中在這一策略的動物實驗上，確定最佳的聯(lián)合方案，以及期待在乳腺癌患者中進一步開展Ⅰ期臨床試驗。