張峻霄　胡春燕　閆坤　賈亮　劉晨　楚光華　高巧蓮　劉朝陽

[摘要] 目的 研究高危型人乳頭瘤病毒（hr-HPV）單一類型感染和多重感染對宮頸癌中細(xì)胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表達(dá)量的影響。 方法 選擇2010年1月～2016年1月在西北婦女兒童醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的宮頸癌患者118例，收集宮頸癌組織，測定HPV的類型并分為hr-HPV陽性和hr-HPV陰性、hr-HPV多重感染和hr-HPV單一感染。檢測宮頸癌組織中細(xì)胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的表達(dá)量。 結(jié)果 hr-HPV陽性92例、hr-HPV陰性26例，hr-HPV多重感染37例、hr-HPV單一感染55例。hr-HPV陽性宮頸癌組織中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的蛋白含量顯著高于hr-HPV陰性宮頸癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。hr-HPV多重感染宮頸癌組織中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的蛋白含量顯著高于hr-HPV單一感染宮頸癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 hr-HPV多重感染能夠通過增加宮頸癌組織中細(xì)胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表達(dá)量的方式來加速細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌；人乳頭瘤病毒；細(xì)胞周期；增殖；凋亡

[中圖分類號(hào)] R737.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）11（c）-0099-04

Effect of single type and multiple infection of high risk HPV on the expression of cell cycle protein and anti-apoptotic protein in cervical cancer

ZHANG Junxiao1 HU Chunyan1 YAN Kun1 JIA Liang1 LIU Chen1 CHU Guanghua1 GAO Qiaolian2 LIU Zhaoyang2

1.Second Department of Gynaecology， Northwest Women and Children's Hospital， Shaanxi Province， Xi'an 710061， China； 2.Outpatient Service of Department of Gynaecology， Northwest Women and Children's Hospital， Shaanxi Province， Xi′an 710061， China

[Abstract] Objective To study the effect of single type and multiple infection of high risk human papillomavirus （hr-HPV） on the expression of cell cycle protein and anti-apoptotic protein in cervical cancer. Methods 118 cervical cancer patients received surgical resection in Northwest Women and Children's Hospital during January 2010 to January 2016 were enrolled and cervical cancer tissues were collected. HPV types were determined and divided into hr-HPV positive and hr-HPV negative， hr-HPV multiple infection and hr-HPV single infection. The expressions of CyclinB1， CyclinD1， CDK1， CDK6 and anti apoptotic protein Bcl-2， Bcl-xl and Survivin in cervical cancer tissues were detected. Results Hr-HPV positive was 92 cases， hr-HPV negative was 26 cases， hr-HPV multiple infection was 37 cases， hr-HPV single infection was 55 cases. The protein contents of CyclinB1， CyclinD1， CDK1， CDK6， Bcl-2， Bcl-xl and Survivin in hr-HPV positive cervical carcinoma tissues were significantly higher than those in hr-HPV negative cervical carcinoma tissues， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The protein contents of CyclinB1， CyclinD1， CDK1， CDK6， Bcl-2， Bcl-xl and Survivin in multiple hr-HPV infection cervical cancer tissues were significantly higher than those in single infection cervical carcinoma， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Multiple infection of hr-HPV can accelerate the progression of cell cycle and inhibit apoptosis of cell through upregulating the expression of cell cycle proteins and anti-apoptosis protein in cervical carcinoma， thereby promoting cancer cell proliferation.

[Key words] Cervical cancer； Human papilloma virus； Cell cycle； Proliferation； Apoptosis

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是造成宮頸癌及癌前病變最重要的危險(xiǎn)因素。目前已知的HPV 160余種，其中近30種HPV能夠感染肛門及生殖器上皮，且14種屬于高危致癌類型[1-2]。高危型HPV（hr-HPV）感染宮頸上皮細(xì)胞會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表達(dá)異常，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖并增加癌變風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。相關(guān)流行病學(xué)資料顯示，hr-HPV多重感染患者發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過hr-HPV單一類型感染[5-6]。但是，關(guān)于hr-HPV多重感染對宮頸癌病情發(fā)生、發(fā)展過程中細(xì)胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表達(dá)的影響未見明確報(bào)道。本研究主要分析hr-HPV單一類型感染和多重感染對宮頸癌中細(xì)胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表達(dá)量的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年1月～2016年1月在西北婦女兒童醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的宮頸癌患者118例作為研究對象，平均年齡（39.6±5.5）歲，術(shù)后收集宮頸癌組織并保存于-80℃冰箱。宮頸癌組織中，hr-HPV陽性92例、hr-HPV陰性26例，hr-HPV多重感染37例、hr-HPV單一感染55例。hr-HPV陽性患者平均年齡（47.5±5.2）歲，中高分化58例、低未分化34例；hr-HPV陰性患者平均年齡（48.2±4.9）歲，中高分化15例、低未分化11例。hr-HPV多重感染患者平均年齡（47.9±5.5）歲，中高分化23例、低未分化14例；hr-HPV單一感染患者平均年齡（47.1±4.9）歲，中高分化35例、低未分化23例。hr-HPV陽性與陰性患者、hr-HPV多重感染與hr-HPV單一感染患者的年齡、分化程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①無HPV感染治療病史；②手術(shù)切除后經(jīng)病理檢查明確宮頸癌的診斷；③通過醫(yī)院倫理委員會(huì)，納入研究患者具有知情權(quán)，并在入組前簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者；②未取得知情同意的患者；③近1個(gè)月內(nèi)行婦科相關(guān)檢查及治療。

1.2 試劑與儀器

HPV檢測試劑盒及DNA提取液購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，宮頸管刷、宮頸脫落細(xì)胞取樣器購自天津伊諾新康醫(yī)療器械科技有限公司，引物、探針合成由上海生物工程技術(shù)有限公司提供，Perfect Real Time試劑購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒以及BCA蛋白定量試劑盒購于南京建成生物公司。

1.3 HPV分型檢測

取宮頸癌組織，采用PCR-RDB法進(jìn)行HPV分型檢測，經(jīng)生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行靶核酸的擴(kuò)增，第一步通過莖環(huán)引物來合成互補(bǔ)DNA，再通過RNA的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對10 ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反應(yīng)，在PCR管加入10 μL的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，總的RNA濃度調(diào)整到2 ng/μL，最后加入5 μL的逆轉(zhuǎn)錄引物，在冰上混勻之后反應(yīng)5 min，接著進(jìn)行梯度變性反應(yīng)，溫度時(shí)間遞減；第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為2×的 PCR Taqman Universal的混合液以及Taqman RNA的特異性引物，通過逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反應(yīng)，cDNA共5 μL加入到RNA去酶的水中，將體積擴(kuò)增至20 μL，通過循環(huán)反應(yīng)94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減的擴(kuò)張40個(gè)循環(huán)之后，以積分吸光度差值來確定hr-HPV和低危型HPV。

1.4 蛋白表達(dá)量檢測方法

取宮頸癌組織，加入蛋白裂解液RIPA后充分勻漿，將勻漿液放置在4℃離心機(jī)中以12000×g的離心力離心20 min，離心后棄去沉淀、保留上清，而后采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定上清液中細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）B1、CyclinD1、細(xì)胞周期蛋白相關(guān)激酶（CDK）1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的含量，采用BCA試劑盒測定上清液中總蛋白的含量，計(jì)算每毫克總蛋白樣本中所含目的蛋白的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hr-HPV感染對宮頸癌組織中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響

hr-HPV陽性宮頸癌組織中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6蛋白含量顯著高于hr-HPV陰性宮頸癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 hr-HPV感染對宮頸癌組織中抗凋亡蛋白表達(dá)的影響

hr-HPV陽性宮頸癌組織中Bcl-2、Bcl-xl、Survivin蛋白含量顯著高于hr-HPV陰性宮頸癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.3 hr-HPV單一和多重感染對宮頸癌組織中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響

hr-HPV多重感染宮頸癌組織中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6蛋白含量顯著高于hr-HPV單一感染宮頸癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.4 hr-HPV單一和多重感染對宮頸癌組織中抗凋亡蛋白表達(dá)的影響

hr-HPV多重感染宮頸癌組織中Bcl-2、Bcl-xl、Survivin蛋白含量顯著高于hr-HPV單一感染宮頸癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

HPV易感于黏膜鱗狀上皮及表皮組織，自從1976年發(fā)現(xiàn)HPV可能通過性傳播致癌以來，宮頸癌與HPV之間的相關(guān)性研究成為了腫瘤病毒學(xué)的熱門課題。低危型HPV通常存在于宮頸良性或低度病變的病灶，而hr-HPV可誘發(fā)全身多部位癌變[7-8]。宮頸癌組織中hr-HPV的感染率顯著高于宮頸良性病變組織[9-11]。在感染HPV初期，宮頸上皮組織未出現(xiàn)增生或異常增生等形態(tài)學(xué)的改變[8]；病毒的DNA整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組可引起多種基因表達(dá)，鱗狀上皮細(xì)胞逐步出現(xiàn)核增大、核異性、空泡變等改變，進(jìn)而增加組織異常增生、癌變等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[12-14]。

宮頸組織中hr-HPV的持續(xù)感染會(huì)將病毒的遺傳物質(zhì)整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組，進(jìn)而造成宿主細(xì)胞中多種基因表達(dá)的改變[15-16]。我們通過分析hr-HPV感染對宮頸癌組織中細(xì)胞周期蛋白以及抗凋亡蛋白表達(dá)量的影響發(fā)現(xiàn)，hr-HPV陽性宮頸癌組織中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的蛋白含量顯著高于hr-HPV陰性宮頸癌組織。這就說明hr-HPV感染能夠通過增加細(xì)胞周期蛋白以及抗凋亡蛋白表達(dá)的方式來誘導(dǎo)宮頸癌組織中的細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)病情的發(fā)展。

CyclinB1、CyclinD1分別能夠與CDK1、CDK6形成復(fù)合體并縮短細(xì)胞周期G2/M期的轉(zhuǎn)換時(shí)間、加速細(xì)胞周期進(jìn)程[17-18]；Bcl-2和Bcl-xl能夠調(diào)節(jié)線粒體膜上轉(zhuǎn)換孔的開放和閉合狀態(tài)，減少細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而抑制下游caspase級聯(lián)凋亡通路的激活[19]；Survivin能夠直接抑制多種caspase分子的激活并拮抗細(xì)胞凋亡過程[20]。我們通過分析hr-HPV多重感染和單一類型感染對上述細(xì)胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表達(dá)量的影響可知，hr-HPV多重感染宮頸癌組織中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的蛋白含量顯著高于hr-HPV單一感染宮頸癌組織。這就說明hr-HPV多重感染能夠增加宮頸癌組織中細(xì)胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的表達(dá)量，進(jìn)而加速細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，hr-HPV多重感染能夠通過增加宮頸癌組織中細(xì)胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表達(dá)量的方式來加速細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。

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（收稿日期：2016-08-16 本文編輯：李亞聰）