龔潤(rùn)強(qiáng)，王 博，季木蘭，趙 欣，蘇良湖，卜元卿，陳 瑀,3，張圣虎①，邱 慧

(1.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042；2.南京信息工程大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210044；3.貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

自抗生素問(wèn)世以來(lái)，人類對(duì)抗生素的消費(fèi)需求不斷增長(zhǎng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球抗生素的消費(fèi)量在2000年至2015年的16 a間增長(zhǎng)了65%[1]，我國(guó)抗生素年消費(fèi)量超過(guò)1.6×105t，其中約5.4×104t進(jìn)入自然環(huán)境[2]。氨芐西林(ampicillin，AMP)作為β-內(nèi)酰胺類抗生素，由于其抗菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)、毒性低、臨床療效好等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于呼吸道感染、泌尿道感染、腦膜炎、沙門(mén)氏菌感染癥以及心內(nèi)膜炎等感染性疾病的治療。據(jù)統(tǒng)計(jì)，AMP約占美國(guó)抗生素消費(fèi)量的44%[3]。與其他抗生素類似，AMP在生物體內(nèi)并不能完全代謝分解，約60%～80%的AMP以原藥形式排出體外[4]。研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)階段的水處理技術(shù)對(duì)AMP的去除十分有限，美國(guó)17家醫(yī)院的污水處理設(shè)施對(duì)AMP的去除率在40%～54%之間[5]，達(dá)累斯薩拉姆大學(xué)廢水穩(wěn)定塘對(duì)AMP的去除率為54.0%～56.5%[6]。盡管AMP在生物體內(nèi)的半衰期較短(1.2～1.5 h)，但是由于大量頻繁地使用以及污水處理設(shè)施較低的去除率，可能會(huì)導(dǎo)致其在水體中形成持續(xù)存在的“假持久性”狀態(tài)，進(jìn)而影響其對(duì)天然水體中抗性基因的耐藥性[7-8]。目前，天然水體中對(duì)AMP賦存濃度的研究相對(duì)較少[9-10]，但是對(duì)其細(xì)菌耐藥性的研究相對(duì)較多，研究表明，波蘭的普羅德尼克河和拉巴河[11]以及南非豪登市阿皮茲河[12]中大腸桿菌對(duì)AMP的耐藥率最高，不同來(lái)源的大腸桿菌如牛源大腸桿菌、羊源大腸桿菌、飼料源大腸桿菌、飲用水源大腸桿菌對(duì)AMP的耐藥率分別為10.7%、25.0%、51.0%、100%[13]，氣單胞菌[14]、沙門(mén)氏菌[15]對(duì)AMP的耐藥率分別為95.45%、73.39%。環(huán)境中的耐藥基因可通過(guò)遺傳或水平轉(zhuǎn)移在細(xì)菌間進(jìn)行擴(kuò)散，或通過(guò)飲用水和食物鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)移，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成潛在威脅[16]。

南京地處長(zhǎng)江下游平原，是長(zhǎng)江下游重要的中心城市。長(zhǎng)江南京段上起江寧區(qū)和尚港，下至棲霞區(qū)大道河口，自西向東貫穿全市，岸線全長(zhǎng)近200 km，城南、城北主要的生活用水取水口均設(shè)置在長(zhǎng)江兩岸[17]。截至2018年，南京市擁有常住人口843萬(wàn)，長(zhǎng)江為南京市主要的飲用水源地。目前沿江兩岸附近分布有化工企業(yè)、醫(yī)院、城市污水處理設(shè)施等，因此其水質(zhì)安全對(duì)于周邊居民具有潛在影響。2019年11月—2020年1月，筆者通過(guò)對(duì)長(zhǎng)江南京段14個(gè)采樣點(diǎn)表層水樣持續(xù)監(jiān)測(cè)，分析了AMP的時(shí)空分布特征，并對(duì)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及人體健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了初步評(píng)估，以期為新型污染物的環(huán)境管理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS，LC系統(tǒng)為Agilent 1290 Infinity， MS系統(tǒng)為AB SCIEX QTRAP 4500，美國(guó) Agilent 公司)；Oasis HLB 小柱(6 mL，200 mg，美國(guó)Waters公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-300，瑞士BUCHI公司)；固相萃取裝置(24孔，美國(guó)Waters公司)。

試劑：甲醇和乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸和氨水(分析純，國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)；磷酸和磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)；抗生素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自百靈威科技有限公司，純度w大于99%。用甲醇將AMP標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 000 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后取標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制20 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，存儲(chǔ)在-20 ℃冰箱中待用。

1.2 樣品采集

分別于2019年11月、12月及2020年1月在長(zhǎng)江南京段14個(gè)斷面(S1～S14)(圖1)采樣，用有機(jī)玻璃采集器采集表層水樣，采集深度為0.1～1.0 m，每個(gè)斷面上采集3個(gè)平行樣，混合后取1 L。將采集到的水樣置于用去離子水潤(rùn)洗3次的棕色玻璃瓶中，在低溫避光下保存，且在24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用0.45 μm孔徑玻璃纖維濾膜過(guò)濾后儲(chǔ)存在4 ℃冰箱內(nèi)，在3 d內(nèi)完成水樣的預(yù)處理。

1.3 樣品預(yù)處理

參照文獻(xiàn)[18]，取1.0 L經(jīng)0.45 μm孔徑玻璃纖維濾膜過(guò)濾后的水樣，加入5 mL 100 g·L-1EDTA·Na2溶液，再用磷酸水溶液(體積比為50%)調(diào)節(jié)水樣pH值至3.0左右；依次向HLB小柱內(nèi)加入6 mL甲醇、3 mL超純水和6 mL磷酸二氫鈉水溶液使小柱活化，調(diào)節(jié)小柱溶液流速為4 mL·min-1，活化完成后以相同流速富集水樣；抽干水樣后向采樣瓶中加入10 mL超純水，抽真空干燥30 min后，依次用6 mL甲醇和6 mL氨水甲醇(體積比為2%)洗脫；洗脫液在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用甲醇復(fù)溶至1 mL，使用UPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器分析條件

液相色譜條件：測(cè)定采用規(guī)格為150 mm×2.1 mm×3.5 μm的ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，柱溫設(shè)定為30 ℃，樣品進(jìn)樣體積為5 μL，流速為0.3 mL·min-1。AMP測(cè)定流動(dòng)相為0.2%(體積比)甲酸水溶液和乙腈，5 min時(shí)將流動(dòng)相甲酸水溶液/乙腈體積比從99/1調(diào)整到90/10，25 min時(shí)調(diào)整到50/50，26 min時(shí)調(diào)整到99/1，洗脫至30 min結(jié)束。

質(zhì)譜條件：采用離子電噴霧正離子(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；設(shè)定離子源溫度為550 ℃，噴霧電壓為5 500 V，噴霧氣、氣簾氣和輔助加熱氣的壓力分別為60.0、35.0和65.0 kPa。

1.5 質(zhì)量控制

采用外標(biāo)法對(duì)樣品的質(zhì)量濃度進(jìn)行定量分析，在100 mL去離子水中加入2 μg·L-1的混合標(biāo)樣進(jìn)行測(cè)定，回收率為60.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.7%。以信噪比S/N≥3和S/N≥10計(jì)算儀器的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.005和 0.018 μg·L-1。

1.6 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

1.6.1生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

風(fēng)險(xiǎn)熵值(risk quotient，QR)可以用來(lái)對(duì)水體中抗生素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估[19]，根據(jù)歐洲風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)指導(dǎo)文件(European Commission Technical Guidance Document，TGD)中風(fēng)險(xiǎn)熵值法對(duì)長(zhǎng)江南京段水源水中抗生素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估[20]，風(fēng)險(xiǎn)熵值(QR)計(jì)算公式為

QR=CME/CPNE。

(1)

式(1)中，CME為實(shí)際測(cè)定濃度，ng·L-1；CPNE為無(wú)效應(yīng)濃度，ng·L-1。CPNE值是慢性毒性數(shù)據(jù)(最低觀察毒性效應(yīng)濃度，NOEC)或急性毒性數(shù)據(jù)(半數(shù)致死濃度LC50或半數(shù)有效濃度EC50)與評(píng)估因子(AF)的比值。由于同種抗生素對(duì)不同物種的毒性效應(yīng)不同，選用最敏感物種的CPNE進(jìn)行評(píng)估。

1.6.2健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

為評(píng)估長(zhǎng)江南京段水源水中抗生素對(duì)人體健康的風(fēng)險(xiǎn)，根據(jù)人體對(duì)抗生素的日均可接受量(acceptable daily intake，IAD)，計(jì)算抗生素對(duì)人體健康的風(fēng)險(xiǎn)熵值(QRH)。計(jì)算公式為

QRH=CME/LDWE。

(2)

式(2)中，QRH為單一抗生素的健康風(fēng)險(xiǎn)熵；CME為抗生素的測(cè)定濃度，μg·L-1；LDWE為飲用水當(dāng)量值，μg·L-1。

飲用水當(dāng)量值計(jì)算公式為

LDWE=IAD×WB×QH/(IDW×BA×EFO) 。

(3)

式(3)中，IAD為日均可接受攝入量，μg·kg-1·d-1；WB為人均體重，kg；QH為最高風(fēng)險(xiǎn)，按1計(jì)算；IDW為每日飲水量，L·d-1；BA為胃腸吸收率，按1計(jì)算；EFO為暴露頻率，350 d·a-1。不同年齡段人群WB及IDW取值見(jiàn)表1[21]。

表1 成人及兒童平均體重(WB)以及每日飲水量(IDW)Table 1 Average body weight and daily water intake for adults and children

根據(jù)HERNANDO等[22]提出的抗生素對(duì)人體健康和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)熵(QR)的分類標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)QR<0.01時(shí)，無(wú)風(fēng)險(xiǎn)；當(dāng)0.01≤QR< 0.1時(shí)，屬于低風(fēng)險(xiǎn)；當(dāng)0.1≤QR< 1時(shí)，屬于中等風(fēng)險(xiǎn)；當(dāng)QR≥ 1時(shí)，屬于高風(fēng)險(xiǎn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 時(shí)空分布特征

分別于2019年11月、12月以及2020年1月在長(zhǎng)江南京段14個(gè)采樣點(diǎn)采集了表層水樣，AMP的濃度分布見(jiàn)圖2。

在連續(xù)3個(gè)月的檢測(cè)中，AMP的濃度范圍為ND～42.44 ng·L-1(ND為未檢出，下同)，總體平均濃度為19.67 ng·L-1，檢出率為57.5%，與何欣等[9]報(bào)道的大連周邊近岸水中AMP的濃度范圍(ND～29.22 ng·L-1)相近，遠(yuǎn)低于王瑞杰等[10]報(bào)道的2018年寧波月湖中AMP最大濃度(328.0 ng·L-1)。2019年11月AMP的濃度范圍為ND～28.44 ng·L-1，平均濃度為2.03 ng·L-1；2019年12月AMP的濃度范圍為ND～42.34 ng·L-1，平均濃度為33.55 ng·L-1；2020年1月AMP的濃度范圍為ND～42.44 ng·L-1，平均濃度為24.04 ng·L-1。其中12月AMP的檢出率最高，達(dá)100%；11月的檢出率最低，為7.14%。

從各監(jiān)測(cè)點(diǎn)來(lái)看，2019年12月和2020年1月均在S13點(diǎn)位監(jiān)測(cè)到AMP峰值，分別為42.34和42.44 ng·L-1，表明該區(qū)域AMP的使用量較大。在連續(xù)3個(gè)月中，S14點(diǎn)位AMP檢出率為100%，表明該區(qū)域在冬季AMP的使用較為普遍；其中S5、S6、S8、S9、S10、S12和S13點(diǎn)位AMP的檢出率均為66.7%，余下點(diǎn)位AMP的檢出率為33.3%。此外，各點(diǎn)位3個(gè)月累計(jì)AMP檢出濃度最高值出現(xiàn)在S14點(diǎn)位(103.14 ng·L-1)，其次為S13點(diǎn)位(84.78 ng·L-1)，最低為S1點(diǎn)位(30.38 ng·L-1)。

2.2 污染來(lái)源分析

抗生素在環(huán)境中的含量和分布特征主要與其使用量、使用模式、使用地區(qū)和環(huán)境因子等因素有關(guān)[23]。長(zhǎng)江南京段建有南京長(zhǎng)江大橋等設(shè)施場(chǎng)所，可以供市民休閑娛樂(lè)和觀光旅游，生活污水、醫(yī)院廢水以及家用抗生素的不合理廢棄等可能是長(zhǎng)江南京段水體中抗生素的輸入來(lái)源。AMP是臨床上常用的廣譜抗生素，長(zhǎng)江南京段水體中AMP的平均質(zhì)量濃度為19.67 ng·L-1，最高達(dá)42.44 ng·L-1。AMP在牛奶[24]、雞、鴨等肉類食品的不同組織中[25]均有檢出。11月采樣檢測(cè)中只有S14點(diǎn)位有檢出，檢出率為7.14%，12月14個(gè)采樣點(diǎn)位全部檢出，檢出率為100%，可能是南京市冬季天氣變化使感染性疾病患者增多，而AMP具有天然青霉素的抗菌譜性，對(duì)于肺炎有特別好的療效，是治療感染性疾病常用的藥物之一[26]，AMP的使用量增加導(dǎo)致長(zhǎng)江南京段水源水中各采樣點(diǎn)抗生素檢出率增加；同時(shí)11月、12月和1月的水樣中S14點(diǎn)位均檢測(cè)出AMP，質(zhì)量濃度分別為28.44、36.00和38.70 ng·L-1，一方面可能與該區(qū)域醫(yī)院、家庭的AMP使用量較大有關(guān)；另一方面，檢出濃度的增加可能與上游水體中AMP濃度有關(guān)。

2.3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

2.3.1生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

采用單一風(fēng)險(xiǎn)熵值法評(píng)估AMP。根據(jù)文獻(xiàn)[27]，AMP毒理數(shù)據(jù)評(píng)估因子(AF)為100，CPNE為75 ng·L-1。由圖3可知，長(zhǎng)江南京段AMP的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)熵(QR)范圍為0.40～0.57，表明AMP對(duì)長(zhǎng)江南京段的生態(tài)環(huán)境具有中度風(fēng)險(xiǎn)；其中S13的QR最高，為0.57，如果長(zhǎng)期處于該水平，可能會(huì)誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生抗生素抗性基因，而抗生素抗性基因已成為新興環(huán)境污染物[28]，勢(shì)必會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成危害。因此有必要采取措施控制AMP進(jìn)入長(zhǎng)江南京段，從而保護(hù)長(zhǎng)江生態(tài)系統(tǒng)的安全。

2.3.2健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

評(píng)估長(zhǎng)江南京段水體中AMP的人體健康風(fēng)險(xiǎn)水平，因考慮最大風(fēng)險(xiǎn)而選取各采樣點(diǎn)各月份檢測(cè)濃度最大值來(lái)計(jì)算人體健康風(fēng)險(xiǎn)熵。AMP是半合成青霉素，抗菌譜相同，參考青霉素IAD值0.03 mg·kg-1·d-1[29]。由圖4可知，長(zhǎng)江南京段AMP對(duì)人體健康風(fēng)險(xiǎn)熵(QRH)的范圍為3.2×10-5～5.1×10-5，均小于0.01，無(wú)健康風(fēng)險(xiǎn)，且QRH整體上呈現(xiàn)出成人大于兒童，同一年齡段中男性比女性稍高的趨勢(shì)。雖然該結(jié)果表明長(zhǎng)江南京段中AMP對(duì)人體健康無(wú)直接風(fēng)險(xiǎn)，但是有研究表明，通過(guò)飲水而進(jìn)入人體(尤其是兒童)的抗生素，是造成肥胖的因素之一[30]。因此水體中殘留的痕量抗生素對(duì)人體健康的長(zhǎng)期影響不容忽視。

3 結(jié)論

(1)長(zhǎng)江南京段水體中，AMP在2019年11月、2019年12月和2020年1月3個(gè)月中檢出濃度范圍分別為ND～28.44、26.04～42.34 和ND～42.44 ng·L-1，檢出率分別為7.14%、100%、66.67%，平均濃度為34.20 ng·L-1，處于低污染水平。

(2)2019年12月和2020年1月AMP檢出濃度和檢出率總體上高于11月。

(3)根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，長(zhǎng)江南京段AMP的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)熵QR范圍為0.40～0.57，處于中度風(fēng)險(xiǎn)水平；AMP的健康風(fēng)險(xiǎn)熵(QRH)范圍為3.2×10-5～5.1×10-5，對(duì)人體無(wú)健康風(fēng)險(xiǎn)，但是QRH整體上呈現(xiàn)出成人大于兒童，且同一年齡段中有男性比女性高的趨勢(shì)。