劉萍，唐代，王旭，白云

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

心肌缺血再灌注損傷(I/R)致死率非常高，全球每年有超過600萬人死于I/R[1]。目前治療策略主要是通過經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)動(dòng)脈放支架、采用溶栓或直接血管成形術(shù)恢復(fù)動(dòng)脈血流。但是，除了直接的缺血性損傷，血流的復(fù)灌還會(huì)對(duì)心肌組織造成損傷，這種現(xiàn)象稱為再灌注損傷，其機(jī)制與心肌細(xì)胞的死亡有關(guān)[2]。再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制涉及多種機(jī)制的相互作用，包括血管收縮劑的釋放、非再灌注、深度炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和壞死[3]。

在心臟再灌注過程中，會(huì)釋放多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致心臟局部炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷。許多研究表明，抑制過度炎癥可以減少梗死范圍，改善缺血再灌注損傷引起的心功能障礙[4]。與缺血再灌注損傷相關(guān)的是氧化/還原失衡導(dǎo)致活化氧和活化氮介導(dǎo)的信號(hào)通路的激活。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是早期心肌缺血再灌注損傷的病理變化[5-6]。

心肌梗死導(dǎo)致心臟組織缺血性壞死，這是死亡的主要原因。梗死后，促炎性免疫細(xì)胞，尤其是多形核白細(xì)胞/單核細(xì)胞，被迅速募集到心臟。浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被激活，從而引發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積[7]。

眾所周知，激活NF-κB和MAPK可導(dǎo)致心肌缺血。NF -κB和MAPK通路已被證明參與許多生理功能，包括高血壓、心力衰竭和心肌肥大等。許多研究表明抑制MAPK信號(hào)與激活核因子-紅細(xì)胞2相關(guān)因子2 (Nrf-2)能顯著緩解心臟損傷，Nrf-2同時(shí)可以調(diào)控血紅素加氧酶1(HO-1)。許多研究表明HO-1心肌缺血再灌注中起到至關(guān)重要的作用[8-9]。

心血管疾病是全世界的主要死亡原因，不僅影響高收入國(guó)家，也影響低收入和中等收入國(guó)家。冠心病和缺血性心肌病是最重要的心血管疾病類型。隨著心血管疾病的治療，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有了顯著的進(jìn)步?？剐慕g痛藥物等是心血管疾病的一線治療藥物。與此同時(shí)，一些中藥因其顯著的臨床療效而逐漸進(jìn)入公眾視野。黃芩是亞洲地區(qū)常用的中草藥之一，臨床應(yīng)用歷史悠久，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效。黃芩苷，又稱7-葡萄糖醛酸-5，6-二羥基黃酮，是從黃芩(唇形科)中分離得到的一種黃酮類化合物，在中藥中被廣泛用作治療各種炎癥性疾病。以往的研究表明，黃芩苷具有廣泛而有效的生物活性，包括抗炎、抗病毒和抗腫瘤作用。然而，關(guān)于黃芩苷治療I/R的報(bào)道雖有一些，但是報(bào)道比較淺顯。因此本文重點(diǎn)研究黃芩苷對(duì)心肌缺血再灌注的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

黃芩苷(純度：97%)由上海源葉生物有限公司提供。白細(xì)胞介素-1β(IL-β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自Elabscience。心肌酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。所有抗體購(gòu)自于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 動(dòng)物

雄性SD大鼠(8周齡，200～220 g)由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，并且飼養(yǎng)在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，濕度：55%～70%，溫度：23～25 ℃。所有SD大鼠自由飲水飲食。所有動(dòng)物操作嚴(yán)格按照黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理指南操作。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥及處理

SD大鼠分組如下(n=10):假手術(shù)(Sham)組、缺血再灌注(I/R)組、I/R+地爾硫卓組(Dil)、I/R+BA(20、40、80 mg/kg) 組。假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行接扎，灌注正常進(jìn)行。假手術(shù)組和I/R組大鼠給予生理鹽水2周。Dil和BA治療組大鼠分別給予Dil(20 mg/kg,灌胃)和BA(20、40、80 mg/kg，灌胃)4周，隨后進(jìn)行缺血再灌注。按照之前報(bào)道[10]手術(shù)過程如下:大鼠按照體質(zhì)量，腹腔注射氨基甲酸乙酯(0.5 mL/100 mg)麻醉大鼠。隨后，大鼠以仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，將大鼠小心鏈接到四導(dǎo)心電圖上，手術(shù)過程中檢測(cè)手術(shù)過程中的變化，并同時(shí)監(jiān)測(cè)心電圖以排除異常的大鼠。小心地分離大鼠的氣管，并小心切開后立即用與呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣(呼吸頻率60次/min，潮氣量8 mL，頻率5∶4)。氣管內(nèi)插管后，小心分離大鼠頸總動(dòng)脈并插入導(dǎo)管，同時(shí)將壓力傳感器連接到生物信息收集系統(tǒng)。仔細(xì)去除SD大鼠的胸毛，然后用碘伏仔細(xì)消毒皮膚。打開左胸暴露心臟，剝?nèi)バ陌业焦跔顒?dòng)脈，穿過離左心耳2 mm的小乙烯管，使結(jié)扎線(4/min線)形成一個(gè)環(huán)來結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。左前降支結(jié)扎30 min，隨后，再灌注120 min。假手術(shù)組流程一樣，只是不接扎。心肌缺血再灌注手術(shù)完成后，實(shí)驗(yàn)者小心地將大鼠的肌肉和皮膚逐層縫合，并在切口處注射少量青霉素或擦拭碘伏以消毒傷口，防止傷口感染。

1.4 缺氧-復(fù)氧(H/R)實(shí)驗(yàn)方案

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)的H9C2細(xì)胞，棄去原來的培養(yǎng)液，加入含有95% N2和5% CO2混合氣體液培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)6 h，模擬缺氧。隨后加入含有有95% O2和5% CO2混合氣體的培養(yǎng)液復(fù)氧。

1.5 細(xì)胞活力測(cè)定

H9C2心肌細(xì)胞接種在96孔板1×105/孔。在H/R方案進(jìn)行之前，細(xì)胞給予不同濃度的BA (1、2、4、8和16 μL)下孵育12 h，然后根據(jù)上述細(xì)胞活力進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)CCK-8檢測(cè)試劑盒說明，加入10 μL的CCK8溶液并在450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。

1.6 心電圖測(cè)量

SD大鼠按體質(zhì)量給予氨基甲酸乙酯(0.5 mL/100 mg)，然后將大鼠固定在實(shí)驗(yàn)板上的背部位置，用皮膚覆蓋頸部和胸部，然后用碘伏消毒，鋪無菌孔巾，將針狀心電圖電極插入大鼠四肢皮膚下，連接心電圖儀，監(jiān)測(cè)并記錄心電圖變化。

1.7 血清與細(xì)胞上清細(xì)胞因子檢測(cè)

根據(jù)ELISA制造商的說明書方法測(cè)定血清、和細(xì)胞上清液中IL-6、IL-β和TNF-α的含量。

1.8 心肌酶檢測(cè)

根據(jù)試劑盒說明書，并且嚴(yán)格按照說明書流程，檢測(cè)血清CK和LDH水平。

1.9 血清和細(xì)胞上清液中SOD、MDA測(cè)定

根據(jù)試劑盒說明書，并且嚴(yán)格按照說明書流程，檢測(cè)血清和細(xì)胞上清液中SOD、MDA。

1.10 心肌組織學(xué)檢查

將4%多聚甲醛固定的心臟組織包埋于石蠟，制備4 μm切片，按常規(guī)HE染色程序操作。在光學(xué)顯微鏡下觀察心臟病理學(xué)改變。

1.11 蛋白質(zhì)印跡

用RIPA裂解液提取心臟組織和H9C2細(xì)胞的總蛋白，并收集12 000 rpm離心20 min。BCA試劑盒用于定量蛋白含量。各組蛋白樣品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。然后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉封閉2 h。隨后將PVDF膜置于相應(yīng)的一抗(p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-P38、P38、HO-1、Nrf-2、p-P65、P65、Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2)中，在4 ℃孵育過夜。第二天用TBST洗4次，每次8 min。然后將聚偏氟乙烯膜置于二抗，并在室溫下于搖床中培養(yǎng)2 h。取下聚偏氟乙烯膜，用TBST水洗4次，每次8 min。凝膠成像系統(tǒng)用于曝光和掃描條帶，以分析每個(gè)條帶的灰度值。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 BA對(duì)心肌組織病理學(xué)的影響

如圖1所示，假手術(shù)組大鼠心臟結(jié)構(gòu)完整，正常的肌原纖維結(jié)構(gòu)伴有條紋，分支外觀和與相鄰肌原纖維的連續(xù)性。心臟結(jié)扎手術(shù)后的心臟出現(xiàn)大量浸潤(rùn)性炎癥細(xì)胞、心肌細(xì)胞腫脹、變性、心臟壞死和橫紋消失。BA (20、40、80 mg/kg)與Dil(20 mg/kg)顯著改善了上述病理變化。

圖1 BA對(duì)心肌組織病理學(xué)的影響(×200)

2.2 BA對(duì)H9C2細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，將細(xì)胞暴露于缺氧6 h，然后再給氧24 h后24 h通過CCK8分析檢測(cè)細(xì)胞活力。缺氧6 h導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著下降，而BA增加了H9C2細(xì)胞的活力。

注：與正常組比較,##P<0.01;與H/R比較,**P<0.01。圖2 BA對(duì)H9C2細(xì)胞活力的影響

2.3 BA對(duì)心電圖ST段的影響

如圖3所示，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組的ST段明顯升高，結(jié)果表明，BA(20、40、80 mg/kg)與Dil(20 mg/kg)顯著降低ST段。

圖3 BA對(duì)心電圖ST段的影響

2.4 BA對(duì)血清、細(xì)胞上清液中炎性細(xì)胞因子的影響

如表1與表2所示，缺血再灌注組血清與缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-β和TNF-α水平明顯升高。BA或Dil顯著降低血清、細(xì)胞上清液中IL-6、IL-β和TNF-α的水平。

表1 BA對(duì)血清中炎性細(xì)胞因子的影響

表2 BA對(duì)細(xì)胞上清炎性細(xì)胞因子的影響

2.5 BA對(duì)心臟標(biāo)志酶的影響

如表3所示，與假手術(shù)組大鼠相比，I/R組大鼠的CK和LDH水平明顯升高。與I/R組相比，MAF和Dil顯著降低CK和LDH水平。

表3 BA對(duì)心臟標(biāo)志酶的影響

2.6 BA對(duì)血清SOD、MDA的影響

如表4所示，與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠血清SOD顯著降低、MDA顯著升高，BA與Dil顯著降低MDA、升高SOD。

表4 BA對(duì)血清SOD、MDA的影響

2.7 BA對(duì)缺血再灌注大鼠心臟MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影響

如圖4所示，與假手術(shù)組大鼠比較，I/R組大鼠心臟組織中p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65的水平顯著升高，Nrf-2和HO-1的水平顯著降低。BA與Dil能顯著恢復(fù)上述改變。

圖4 BA對(duì)缺血再灌注大鼠心臟MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影響

2.8 BA對(duì)H/R誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影響

如圖5所示，與正常組細(xì)胞比較，H/R組H9C2細(xì)胞中p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65的水平顯著升高，Nrf-2和HO-1的水平顯著降低。BA能顯著恢復(fù)上述改變。

圖5 BA對(duì)H/R誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影響

3 討論

目前，對(duì)心血管疾病的干預(yù)有很多，如對(duì)冠心病的溶栓和冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)。盡管死亡率顯著下降，但與這些治療相關(guān)的缺血再灌注損傷使結(jié)果不太令人滿意。因此，在研究中，需要預(yù)防和治療缺血再灌注心臟疾病。在本實(shí)驗(yàn)中，BA顯著改善了I/R組大鼠ST抬高，減少了CK-MB和LDH水平，改善了心肌病理變化，并恢復(fù)了炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的通路。

目前治療心肌缺血的藥物有幾種:一是鈣通道阻滯劑，如硝苯地平、地爾硫卓等;第二，抗氧化劑自由基發(fā)生劑，如維生素C等;第三類是能量混合物磷酸肌酸;第四，抗白細(xì)胞聚集，如烏司他丁。其中，第一類鈣離子阻滯劑是治療心肌缺血最常用的藥物，也是治療心肌缺血應(yīng)用最廣泛的藥物。其他研究者也報(bào)道了地爾硫卓對(duì)心肌缺血再灌注損傷的治療作用[11-13]，這是我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中選擇地爾硫卓作為陽性藥物的基礎(chǔ)。

據(jù)報(bào)道，MAPK通路是細(xì)胞存活和凋亡所必需的信號(hào)通路[15-17]。在這方面，我們假設(shè)BA對(duì)心肌缺血再灌注的保護(hù)作用與MAPK信號(hào)通路有關(guān)。正如預(yù)期的那樣，本研究結(jié)果顯示BA顯著降低了I/R大鼠和H/R的H9C2細(xì)胞中ERK 1/2、JNK和p38磷酸化的水平。作為MAPK的下游分子，NF-κB在心肌缺血炎癥和凋亡進(jìn)程的調(diào)節(jié)中起著重要作用[18-19]。NF-κB的激活是由IκBα的磷酸化和降解誘導(dǎo)的[20]。NF-κB調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、氧化應(yīng)激和凋亡反應(yīng)[21]。有證據(jù)表明MAPK/NF-κB通路參與體內(nèi)和體外心肌缺血再灌注損傷[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，與假手術(shù)組比較，在I/R模型中p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65的水平顯著增加。與I/R相比，BA與Dil顯著降低p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65水平。H9C2細(xì)胞在H/R刺激后，p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65水顯著升高，BA顯著降低p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65水平。

I/R可引起細(xì)胞因子如IL-6、IL-β和TNF-α。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞分泌，巨噬細(xì)胞可通過增加其他促炎細(xì)胞因子的釋放和影響中性粒細(xì)胞募集來促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。IL-6作為炎癥中的一種重要細(xì)胞因子，在缺血再灌注引起的炎癥中起著重要作用。IL-β可以誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)的釋放，增加細(xì)胞粘附因子的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BA和Dil顯著降低了大鼠血清IL-6、IL-β和TNF-α的水平。H/R刺激H9C2細(xì)胞后，血清IL-6、IL-β和TNF-α的水平顯著升高，BA能降低細(xì)胞上清IL-6、IL-β和TNF-α的水平。

研究表明，抑制MAPK激活可以激活Nrf-2，然后上調(diào)HO-1[23]。活化的Nfr-2從Keap 1(Nrf-2的抑制劑)中釋放出來，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在細(xì)胞核中與抗氧化反應(yīng)元件(ARES)結(jié)合，加速HO-1的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，HO-1是第二階段抗氧化酶之一，在I/R中起關(guān)鍵作用[24]。本結(jié)果證實(shí)，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠的Nrf-2、HO-1和SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高。與I/R組相比，BA和Dil能提高Nrf-2、HO-1和SOD水平，降低MDA的水平。H/R刺激后H9C2細(xì)胞后細(xì)胞Nrf-2、HO-1和SOD水平顯著降低、MDA顯著升高，BA能顯著逆轉(zhuǎn)上述改變。

綜上所述，BA對(duì)I/R有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制與調(diào)控MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB信號(hào)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激與炎癥相關(guān)。