劉思瑩，凌爽，李雪瑩，劉欣欣，肖洪彬*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病心肌損傷是糖尿病常見的心血管并發(fā)癥，是機(jī)體在糖脂代謝紊亂的基礎(chǔ)上長(zhǎng)期發(fā)展而誘發(fā)的心肌結(jié)構(gòu)和功能的損傷而引發(fā)的微血管病變，也是糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)生率和高病死率的重要原因。

丹參-葛根藥對(duì)是《施今墨對(duì)藥》中益胃止渴健脾降糖中的一對(duì)，葛根甘平，輕揚(yáng)升發(fā)，能解肌退熱，生津止渴，滋潤(rùn)筋脈，擴(kuò)張心腦血管，改善血液循環(huán)，降低血糖；丹參色赤入血，活血化瘀，行血止痛，祛瘀生新，涼血消癰，鎮(zhèn)靜安神，降低血糖。二藥參合，相互促進(jìn)，活血化瘀，祛瘀生新，降低血糖力量增強(qiáng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參、葛根都具有調(diào)節(jié)心血管的功能，在改善糖尿病微血管病變[2]、心肌缺血[3]、心肌損傷[4]方面都具有顯著效果，但對(duì)于二藥在糖尿病血管病和心肌損傷保護(hù)作用的藥效學(xué)和作用機(jī)制研究相對(duì)較少。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上，整合多個(gè)中藥數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)中藥化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)以及疾病的等信息進(jìn)行分析，并構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-基因-疾病”的分子網(wǎng)絡(luò)，闡述其生物學(xué)功能和作用機(jī)制，其研究方法與中藥及中藥復(fù)方的多組分、多靶點(diǎn)、多通路等特點(diǎn)相吻合，也正符合中醫(yī)辨證論治、整體觀、系統(tǒng)觀的醫(yī)療理念相符[5-6]。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法利用“成分-靶點(diǎn)-疾病”的思路對(duì)“丹參-葛根”藥對(duì)治療糖尿病心肌損傷構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)拓?fù)淠Ｐ?，?jīng)過數(shù)據(jù)分析對(duì)“丹參-葛根”藥對(duì)的生物學(xué)功能和作用機(jī)制提供更準(zhǔn)確的信息，希望對(duì)今后的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 丹參-葛根化學(xué)成分和靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP (中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，收集丹參、葛根主要化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)常用的化學(xué)成分篩選方法，以生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18作為 ADME篩選條件[7]。

1.2 疾病靶點(diǎn)的篩選

通過在GeneCards數(shù)據(jù)庫 (http://www.genecards.org) 和OMIM 數(shù) 據(jù) 庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) 進(jìn)行檢索，輸入關(guān)鍵詞diabetic heart injury，DMI和diabetes cardiomyopathy，DCM獲得糖尿病心肌損傷相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥對(duì)和疾病交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將疾病靶點(diǎn)與藥物成分靶點(diǎn)輸入在線Venny 2.1軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖，獲得藥對(duì)與疾病的交集靶點(diǎn)。將篩選得到的交集靶標(biāo)蛋白輸入STRING 10.5平臺(tái)(https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中孤立的蛋白，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)互作圖，分析統(tǒng)計(jì)靶標(biāo)蛋白關(guān)聯(lián)頻次。

1.4 藥對(duì)-疾病-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.2(http:/ /www.cytoscape.org/)[8]軟件。將“丹參-葛根”藥對(duì)化合物和疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建藥對(duì)-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，使藥物分子與交集靶點(diǎn)關(guān)系達(dá)到可視化，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，以靶點(diǎn)度值(Degree)和中心度(betweenness centrality)作為拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析的重要參數(shù)，預(yù)測(cè)藥對(duì)中有效成分和靶標(biāo)蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

1.5 丹參-葛根藥對(duì)治療糖尿病心肌損傷預(yù)測(cè)靶標(biāo)富集分析

利用DAVID(https:/ /david.ncifcrf.gov)在線分析工具將靶點(diǎn)基因symbol轉(zhuǎn)化為基因ID，并進(jìn)行基因本體(GO)富集分析，再利用Kabas3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)在線軟件進(jìn)行生物通路KEGG富集分析，并使用R語言cluster Profiler工具包對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化操作，選擇P<0.01顯示結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 丹參-葛根藥對(duì)有效成分和靶點(diǎn)的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為參數(shù)共收集到了69個(gè)滿足條件的化合物，剔除預(yù)測(cè)不到靶點(diǎn)的化合物共得到41個(gè)有效成分，其中丹參38個(gè)，葛根3個(gè)，見表1。同時(shí)得到的有效靶點(diǎn)共434個(gè)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)共得到65個(gè)有效作用靶點(diǎn)，通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：丹參中化合物紫丹參萜醚B(przewalskin b)，分子編號(hào)MOL007064，在41個(gè)化合物中具有較高的OB值(110.32%)。

2.2 與糖尿病心肌損傷相關(guān)疾病靶點(diǎn)篩選

通過 Genecard、OMIM數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲得糖尿病心肌損傷相關(guān)的疾病靶點(diǎn)580個(gè)。將580個(gè)疾病靶點(diǎn)與65個(gè)藥對(duì)成分靶點(diǎn)通過Venny 2.1軟件取交集后得到疾病-藥物成分共同靶點(diǎn)29個(gè)，見圖1。

圖1 疾病-藥對(duì)交集靶點(diǎn)關(guān)系圖

2.3 藥對(duì)-疾病交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶標(biāo)蛋白在STRING 10.5平臺(tái)(https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置置信度大于0.4，隱藏孤立蛋白后，共得到28個(gè)節(jié)點(diǎn)，107條線，平均節(jié)點(diǎn)度值(degree)為7.38，見圖2。節(jié)點(diǎn)表示靶標(biāo)蛋白，每條邊表示靶標(biāo)蛋白之間的作用關(guān)系。從作用關(guān)系圖可看出有13個(gè)靶點(diǎn)大于平均度值，成為連結(jié)網(wǎng)絡(luò)其他節(jié)點(diǎn)的樞紐，主要有IL-6、VEGFA、CASP3、FOS、CASP8、CASP9、ESR1、MCL1、NFKBIA、PPARG、GSK3B、ICAM1、PRKCA，說明這些蛋白質(zhì)在PPI中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。

圖2 丹參-葛根治療糖尿病心肌損傷的靶點(diǎn)蛋白質(zhì)交互作用圖

2.4 藥對(duì)化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“丹參-葛根”藥對(duì)-疾病-核心靶點(diǎn)之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖3，共包括70個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括41個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和29個(gè)核心靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，組成454條靶點(diǎn)聯(lián)系；其中，藍(lán)色橢圓表示化合物，紅色橢圓表示“藥對(duì)-疾病”作用靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)連線與度值成正比例關(guān)系。度中心性(degree centrality，DC)參數(shù)是評(píng)價(jià)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要核心指標(biāo)，其數(shù)值越大，說明節(jié)點(diǎn)越接近網(wǎng)絡(luò)的中心[9]。核心靶點(diǎn)中度值較高的有 PTGS1(28)、CHRM3(25)、CHRM2(20)等，表明丹參-葛根藥對(duì)化合物可能通過高度值的靶點(diǎn)起到發(fā)揮治療糖尿病心肌損傷的作用。

圖3 丹參-葛根活性成分-DMI交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 預(yù)測(cè)靶標(biāo)的GO和KEGG富集分析

應(yīng)用DAVID在線軟件對(duì)丹參-葛根藥對(duì)治療DMI的交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能富集分析，得到前20條目富集結(jié)果，見圖4。靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的分子功能主要有蛋白質(zhì)異二聚活性、類固醇激素受體活性、內(nèi)肽酶活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、類固醇結(jié)合、配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合-轉(zhuǎn)錄因子活性、半胱氨酸型肽酶活性、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、核受體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。

圖4 丹參-葛根治療 DMI作用靶點(diǎn)Go富集分析結(jié)果

利用Kabas3.0將交集靶點(diǎn)做富集通路分析，取前20條主要通路及富集的基因，將得到的通路富集分析結(jié)果使用R語言clusterProfiler工具包繪制氣泡圖，選擇P<0.01顯示結(jié)果，見圖5。在顯示的生物通路中主要涉及凋亡信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、內(nèi)分泌IL-17信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、催乳素信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、Toll樣受體信號(hào)通路、胰島素抵抗、HIF-1信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路等。

圖5 丹參-葛根治療DMI作用靶點(diǎn)KEGG富集氣泡圖

3 討論

丹參、葛根在糖尿病及其并發(fā)癥的治療中均屬高頻使用單味藥。相關(guān)研究表明，治療糖尿病心血管并發(fā)癥最常用的中藥中，丹參、葛根排在了前10位[10]。而該藥對(duì)的組合應(yīng)用在現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二者具有降低血糖、調(diào)節(jié)糖代謝的作用[11-12]。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討和分析了丹參-葛根藥對(duì)治療糖尿病心肌損傷的分子機(jī)制。篩選了丹參-葛根藥對(duì)共41個(gè)特征化學(xué)成分，主要作用65個(gè)靶點(diǎn)，其中29個(gè)靶點(diǎn)為藥對(duì)與疾病交集靶點(diǎn)。PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示了核心靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)連接度越大，表明該藥對(duì)通過該靶點(diǎn)治療DMI的可能性越大。其中IL-6(度值19)、VGEFA(度值18)、Caspase3(度值17)、FOS(度值14)、ESR1(度值12)、Caspase8(度值12)、Caspase9(度值12)等靶蛋白在網(wǎng)絡(luò)中連接基因數(shù)遠(yuǎn)高于其他，說明這些關(guān)鍵靶點(diǎn)又是相互作用協(xié)同起到治療糖尿病心肌損傷的作用。 Caspase3、Caspase7、Caspase8、Caspase9屬于Caspases家族成員中促凋亡因子，是一組具有相似氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)和酶特異性的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡信號(hào)的刺激下caspase參與了糖尿病胰島β細(xì)胞的凋亡[13]。IL-6參與炎癥反應(yīng)，降低IL-6的水平可以減輕糖尿病患者血管病變，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[14]。王明樂等[15]采用丹參注射液對(duì)2型糖尿病下肢血管病變患者進(jìn)行干預(yù)，血清炎癥因子IL-6、C反應(yīng)蛋白(CRP)的炎癥指標(biāo)明顯降低,表明丹參注射液對(duì)炎癥因子的干預(yù)效果顯著。靶點(diǎn)基因通路富集分析主要集中在凋亡信號(hào)通路(9個(gè)靶點(diǎn)參與)、PI3K-Akt信號(hào)通路(8個(gè)靶點(diǎn)參與)、TNF信號(hào)通路(7個(gè)靶點(diǎn)參與)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(6個(gè)靶點(diǎn)參與)、IL-17信號(hào)通路(6個(gè)靶點(diǎn)參與)等信號(hào)通路。BULANI等[16]研究表明，糖尿病心肌病與心肌細(xì)胞凋亡有密切相關(guān)，高糖環(huán)境會(huì)增加心肌細(xì)胞的凋亡。張玲等[17]研究葛根素能夠改善DM模型大鼠的血糖并調(diào)控Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Caspase3、Cyt-C蛋白表達(dá)，從而使心肌細(xì)胞凋亡率下降。孫曉慧等人[18]研究表明Sirt1 通過負(fù)調(diào)控 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與糖尿病心肌損傷，參與早期糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。袁媛等[19]證實(shí)了葛根素對(duì)體內(nèi)外AGEs的形成具有明顯的抑制作用。白介素17(IL-17)在心臟間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用。Zhang Y等[20]通過敲除IL-17消除了高糖誘導(dǎo)的AK081284的上調(diào)，從而抑制了心臟成纖維細(xì)胞(CFs)中膠原和TGFβ1的產(chǎn)生。證明了 IL-17 / AK081284 /TGFβ1信號(hào)通路介導(dǎo)高葡萄糖誘導(dǎo)的膠原蛋白產(chǎn)生。IL-17的缺失能夠減輕心肌纖維化并改善糖尿病小鼠的心臟功能。該研究表明IL-17抑制對(duì)與纖維化有關(guān)的糖尿病性心肌病的治療潛力。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的平臺(tái)分析和預(yù)測(cè)結(jié)果和已有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果基本一致，說明通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法能夠在分子層面為藥物對(duì)疾病的作用機(jī)制提供一些潛在依據(jù)和線索，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示了丹參-葛根藥對(duì)治療DMI 的多成分、多靶點(diǎn)和多通路的協(xié)同作用的特點(diǎn)，為進(jìn)一步深入研究該藥對(duì)組合配伍或藥物單體化合物特有的藥理作用以及治療糖尿病心肌損傷的作用機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。