寧亞維，付浴男，何建卓，侯琳琳，王志新，肖 香，王世杰，賈英民

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

大腸桿菌是食品中常見的食源性致病菌，常通過污染肉、奶、蔬菜等食品導(dǎo)致人體感染[1-2]，會引起嘔吐、輕度發(fā)燒、腸道感染、腹瀉等[3]。美國疾病預(yù)防控制中心調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，每年因食源性致病菌污染的食品導(dǎo)致約有1/6的美國人患病，至少3 000 人死亡[4]；致病性大腸桿菌每年導(dǎo)致約2 100 病例[1]。因此，控制大腸桿菌在食品中的污染具有重要意義。

苯乳酸即2-羥基-3苯基丙酸，又名β-苯基乳酸和3-苯基乳酸，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種天然有機(jī)酸。該物質(zhì)最先在麥盧卡蜂蜜中發(fā)現(xiàn)[5]，而后陸續(xù)在多種發(fā)酵食品（如面團(tuán)、乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物、泡菜等）中發(fā)現(xiàn)[6-7]。苯乳酸具有廣譜抑菌作用[8]，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、腸球菌以及沙門氏菌等均具有抑菌活性[7,9]。另外，苯乳酸具有無毒、穩(wěn)定性高、親水性好等特點，因此在食品防腐中具有一定的應(yīng)用潛力。Dieuleveux等[10]發(fā)現(xiàn)苯乳酸能明顯抑制牛奶、干酪中單增李斯特菌的生長。Lavermicocca等[11]發(fā)現(xiàn)苯乳酸對面包、焙烤制品中的真菌有很好的抑菌效果。Schnürer等[12]將苯乳酸與乳酸菌代謝產(chǎn)物聯(lián)合使用在面包上，能使霉菌黑曲霉的生長開始延遲7 d。趙珊等[13]發(fā)現(xiàn)6 g/L苯乳酸與5 g/L甘油、5 g/L黃原膠、12 g/L海藻酸鈉制成保鮮劑涂膜低溫保鮮甜櫻桃，可延長其保存期，降低櫻桃的腐爛率、質(zhì)量損失率。此外，將苯乳酸和抗菌素制成粉劑添加到香腸中，香腸在12 ℃下至少可以保存60 d[14]。

近年來，苯乳酸的抑菌機(jī)理研究受到人們關(guān)注。Dieuleveux等[15]通過掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果提出苯乳酸的抑菌靶位為細(xì)胞壁；Ning Yawei等[16]通過研究苯乳酸對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和大腸桿菌的影響，發(fā)現(xiàn)苯乳酸具有細(xì)胞膜和DNA雙重抑菌靶位；Str?m等[17]研究了苯乳酸對絲狀真菌蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)苯乳酸作用位點為苯丙酸脫氫酶；Liu Fang等[18]研究了苯乳酸對陰溝腸桿菌生物膜形成的影響，表明苯乳酸會破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分的滲漏及抑制生物膜形成；Chifiriuc等[19]通過革蘭氏陽性菌和陰性菌細(xì)胞間細(xì)菌通訊的實驗?zāi)Ｐ妥C明了苯乳酸干擾細(xì)胞生物膜形成過程中毒力因子表達(dá)，說明了苯乳酸干擾細(xì)胞間的群體感應(yīng)效應(yīng)介導(dǎo)的生物過程。上述研究均為苯乳酸單獨抑菌研究，而苯乳酸與其他抑菌物質(zhì)聯(lián)用抑菌機(jī)制研究目前鮮有報道。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)食品體系中存在醋酸時苯乳酸的防腐效果增加。醋酸可以作為酸度調(diào)節(jié)劑用于多種食品，如發(fā)酵乳制品、發(fā)酵面制品、多種飲料、蜂蜜酒等（GB 1886.10—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 冰乙酸（又名冰醋酸）》），且多項研究表明其具有抑菌活性，如Nagoba等[20]發(fā)現(xiàn)醋酸對銅綠假單胞菌引起的傷口感染具有治療作用；楊轉(zhuǎn)琴等[21]發(fā)現(xiàn)食醋（總酸質(zhì)量濃度≥3.5 g/100 mL醋酸）對大腸桿菌具有抑制作用；Olaimat等[22]發(fā)現(xiàn)醋酸可有效減少芝麻醬或芝麻醬產(chǎn)品中的金黃色葡萄球菌數(shù)量。因此，將苯乳酸與醋酸復(fù)配用于食品防腐具有較好地應(yīng)用前景。然而，苯乳酸與醋酸的協(xié)同抑菌效應(yīng)及機(jī)理尚不明確。因此，本研究以大腸桿菌為指示菌，從細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、DNA等方面初步探討苯乳酸與醋酸的聯(lián)合抑菌效應(yīng)及機(jī)制，為苯乳酸在食品體系的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coliATCC 44752）由河北科技大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實驗室保藏。

苯乳酸、DiSC3(5) 美國Sigma公司；LIVE/DEAD試劑盒 美國Thermo Fisher Scientific公司；TIANamp Bacteria DNA Kit（細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒）日本Takara Bio公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SZ90激光粒度分析儀 英國Malvern公司；F-7000-FL 2 2 0 熒光分光光度計、S-4 8 0 0-I 掃描電子顯微鏡日本日立公司；Accuri C6 Plus流式細(xì)胞儀 美國Becton Dickinson公司；BX53熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；Evolution 220紫外分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度及聯(lián)合抑菌指數(shù)的測定

采用二倍稀釋法考察了苯乳酸和醋酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。用新鮮的營養(yǎng)肉湯調(diào)整培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌濃度至1×106CFU/mL備用。在96 孔板中加入苯乳酸使其質(zhì)量濃度范圍分別為10～0.039 mg/mL，醋酸質(zhì)量濃度范圍為8～0.016 mg/mL，之后加入100 μL菌液。陽性對照組不加抑菌劑，只加100 μL營養(yǎng)肉湯及100 μL菌液；陰性對照組只加200 μL營養(yǎng)肉湯。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后通過酶標(biāo)儀測定吸光度，以細(xì)菌被抑制的最低抑菌劑質(zhì)量濃度作為MIC。

根據(jù)Liu Fang等[23]的方法測定苯乳酸與醋酸聯(lián)合抑菌指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）。制備質(zhì)量濃度范圍為1/8 MIC～4 MIC的苯乳酸和醋酸二倍稀釋菌液備用。然后，在水平方向?qū)⒈饺樗嶙⑷氲?6 孔板中，在垂直方向上將醋酸注入到96 孔板中。之后，在每個孔中注入100 μL濃度為106CFU/mL大腸桿菌細(xì)菌懸液并使之與抑菌劑混勻，使每個孔中包含兩種質(zhì)量濃度的抑菌劑組合，以不含任何抗菌劑的孔用作陽性對照，并在37 ℃下培養(yǎng)24 h后按式（1）～（3）計算FICI。

1.3.2 時間-殺菌曲線的繪制

在營養(yǎng)肉湯中將大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，用營養(yǎng)肉湯調(diào)節(jié)菌懸液濃度為106CFU/mL，加入不同質(zhì)量濃度的苯乳酸、醋酸，以兩者的終質(zhì)量濃度將實驗分為5 組，即0.3125 mg/mL（1/4 MIC）苯乳酸、1.25 mg/mL（MIC）苯乳酸、0.25 mg/mL（1/2 MIC）醋酸、0.5 mg/mL（MIC）醋酸、0.312 5 mg/mL（1/4 MIC）苯乳酸+0.25 mg/mL（1/2 MIC）醋酸，未做任何處理的為空白對照組。將上述菌懸液于37 ℃培養(yǎng)一定時間后，采用平板計數(shù)法進(jìn)行活菌數(shù)測定。

1.3.3 Zeta電位的測定

參考Sorrentino等[24]的方法，采用激光粒度儀測定苯乳酸、醋酸對大腸桿菌Zeta電位的影響。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌清洗并重懸于無菌超純水中，調(diào)節(jié)菌體濃度為OD600nm＝0.2。將大腸桿菌與不同抑菌劑作用1 h。之后，用Zeta電位儀進(jìn)行電位檢測。超純水處理組用作空白組，pH 3的鹽酸處理用作陽性對照。

1.3.4 大腸桿菌細(xì)胞膜電勢的測定

苯乳酸與醋酸聯(lián)合處理后大腸桿菌細(xì)胞膜電勢的測定參考Yang Xu等[25]的方法并做適當(dāng)修改。取培養(yǎng)至對數(shù)期生長期的大腸桿菌，用5 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液（pH 7.2～7.4，含10 mmol/L葡萄糖）清洗重懸至OD600nm＝0.2。將溶于二甲基亞砜的DiSC3(5)加入到細(xì)胞懸液中（DiSC3(5)終濃度為1 μmol/L）于30 ℃避光條件下標(biāo)記15 min，之后將氯化鉀添加到細(xì)胞懸液中，使其終濃度為100 mmol/L。然后，將菌懸液與不同質(zhì)量濃度抑菌劑混勻，以不加抑菌劑的組別為空白對照組，用熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長λex＝650 nm、發(fā)射波長λem＝672 nm。

1.3.5 細(xì)胞膜完整性的測定

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌清洗重懸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水中并調(diào)節(jié)至OD600nm＝0.2。將等體積的菌懸液分別與等體積的抑菌劑混合，使抑菌劑達(dá)不同質(zhì)量濃度，并在37 ℃作用1 h；以生理鹽水作陰性對照、體積分?jǐn)?shù)70%異丙醇作陽性對照。之后，將處理的樣品離心、清洗、重懸后在黑暗條件下用2 μmol/L SYTO 9和12 μmol/L碘化丙啶（propidium iodide，PI）標(biāo)記15 min，用Accuri C6 Plus流式細(xì)胞儀對細(xì)胞膜完整性進(jìn)行定量分析，用熒光顯微鏡進(jìn)行定性分析觀察。

1.3.6 細(xì)胞形態(tài)的觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的變化。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌清洗重懸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水中并調(diào)節(jié)至OD600nm＝0.2。將等體積的菌懸液分別與等體積的不同質(zhì)量濃度抑菌劑作用，未經(jīng)抑菌劑處理的為空白對照組，之后收集菌體并用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗兩次，在4 ℃下用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定過夜。樣品經(jīng)0.1 mol/L PBS清洗除去戊二醛，再用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（30%、50%、70%、85%、90%、100%、100%）進(jìn)行梯度逐級脫水，干燥、噴金后用掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)。

1.3.7 大腸桿菌蛋白組成的測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）考察了苯乳酸與醋酸對大腸桿菌蛋白質(zhì)的影響。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌清洗重懸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水中并調(diào)節(jié)至OD600nm＝0.2。將等體積的菌懸液分別與等體積的不同質(zhì)量濃度抑菌劑作用1 h后，4 700×g離心、清洗、收集菌體后按照說明書進(jìn)行預(yù)處理后的4×蛋白上樣緩沖液處理樣品，進(jìn)行菌體蛋白質(zhì)的SDS-PAGE。在濃縮膠部分調(diào)整電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓為120 V，條帶移至膠底后進(jìn)行脫色，凝膠成像儀拍照記錄結(jié)果。

1.3.8 大腸桿菌菌體基因組DNA的測定

采用熒光光譜法考察苯乳酸和醋酸對大腸桿菌基因組DNA的影響。收集對數(shù)生長期的大腸桿菌，采用TIANamp Bacteria DNA Kit并按該試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組，經(jīng)Evolution 220紫外分光光度計測定DNA的質(zhì)量濃度為63 μg/mL，純度OD260nm/OD280nm＝1.88。之后，將終質(zhì)量濃度為7.9 μg/mL的DNA與不同抑菌劑混合作用30 min后使用F-7000-FL 220熒光分光光度計在激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長300～500 nm下測定混合物的熒光光譜。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復(fù)3 次取其平均值。采用Origin 2018軟件通過單因素方差分析法對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析并作圖，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯乳酸和醋酸對大腸桿菌的抑菌活性

苯乳酸、醋酸對大腸桿菌的MIC分別為1.25、0.5 mg/mL，F(xiàn)ICI為0.5，表明苯乳酸和醋酸對大腸桿菌具有協(xié)同抑菌效應(yīng)。根據(jù)微量棋盤法的實驗結(jié)果，選取不同質(zhì)量濃度苯乳酸、醋酸及其聯(lián)用使用，并通過時間-殺菌曲線（圖1）進(jìn)一步考察苯乳酸和乳酸聯(lián)用的抑菌效果。結(jié)果顯示，1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸處理大腸桿菌24 h后，菌落數(shù)與未添加抑菌劑的空白對照組在24 h后幾乎達(dá)到相同的抑菌效果；而1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸組處理大腸桿菌24 h后菌落數(shù)較處理前下降0.76（lg（CFU/mL）），呈現(xiàn)較理想的抑菌效果，與MIC苯乳酸（下降1.11（lg（CFU/mL））、MIC醋酸（下降0.47（lg（CFU/mL））抑菌效果相似。表明1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸單獨使用時24 h內(nèi)不能抑制菌體的生長，而1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸聯(lián)合使用時能達(dá)到單一抑菌劑MIC劑量效果，且兩者聯(lián)用組菌落數(shù)比單一抑菌劑處理組低2（lg（CFU/mL））以上，表明苯乳酸與醋酸對大腸桿菌的抑制具有較好的協(xié)同效應(yīng)[26]。

圖1 苯乳酸和醋酸對大腸桿菌的時間-殺菌曲線Fig.1 Time-killing curves of E.coli treated by phenyllactic acid and/or acetic acid

2.2 苯乳酸和醋酸對大腸桿菌Zeta電位的影響

圖2 苯乳酸和醋酸對大腸桿菌Zeta電位的影響Fig.2 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on zeta potential of E.coil

Zeta電位是對顆粒之間相互排斥或吸引力強(qiáng)度的度量[27]，可反映出細(xì)菌表面凈電荷分布情況。從圖2可以看出，空白組Zeta電位為負(fù)，可能是由于細(xì)胞壁成分上羧基、羥基、氨基、磷酸鹽等陰離子作用導(dǎo)致的[27-28]。經(jīng)測得，MIC苯乳酸、MIC醋酸、1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸的pH值分別為2.99、3.43、3.28，故選用pH 3的鹽酸作為陽性對照組觀察是否是酸的作用引起Zeta電位變化。經(jīng)過MIC苯乳酸、MIC醋酸、1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸、鹽酸（pH 3）處理后，Zeta電位分別為3.20、1.71、1.16、1.27 mV，各處理組和空白組相比Zeta電位變化顯著（P＜0.05），而處理組之間的Zeta電位沒有顯著差異（P＞0.05），表明苯乳酸、醋酸處理導(dǎo)致大腸桿菌Zeta電位的變化可能是由于溶液pH值影響細(xì)菌表面的官能團(tuán)的電離，從而影響細(xì)菌表面電荷的分布情況。因此推測，苯乳酸與醋酸可以改變菌體細(xì)胞的表面電荷特性。

2.3 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌膜電勢的影響

圖3 苯乳酸和醋酸對大腸桿菌膜電勢的影響Fig.3 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on membrane potential of E.coil

為了明確苯乳酸與醋酸對大腸桿菌跨膜電勢的影響，采用膜電位敏感性熒光探針DiSC3(5)考察了苯乳酸與醋酸對大腸桿菌膜電勢的影響。從圖3可以看出，每個實驗組均導(dǎo)致了DiSC3(5)熒光強(qiáng)度的增加，經(jīng)過1/4 MIC苯乳酸、MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸、MIC醋酸、1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸處理后，DiSC3(5)熒光強(qiáng)度分別增加至151.8、160.9、187.2、199.9、176.6，表明無論是苯乳酸還是醋酸均能消散大腸桿菌膜電勢，且醋酸對大腸桿菌膜電勢的消散能力強(qiáng)于苯乳酸。此外，1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸對大腸桿菌膜消散能力強(qiáng)于MIC苯乳酸，說明1/4 MIC苯乳酸和1/2 MIC醋酸聯(lián)用后能增強(qiáng)苯乳酸對大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)膜的破壞作用從而發(fā)揮抑菌作用。與Lavermicocca等[11]發(fā)現(xiàn)苯乳酸在與有機(jī)酸共存時其抑菌活性增強(qiáng)的結(jié)果一致。

2.4 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響

圖4 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌細(xì)胞膜完整性影響的流式細(xì)胞圖Fig.4 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on cell membrane integrity of E.coil determined by flow cytometry

采用流式細(xì)胞儀（圖4）及熒光顯微鏡（圖5）考察了苯乳酸與醋酸對大腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響，采用PI和SYTO 9標(biāo)記細(xì)胞。SYTO 9熒光探針可以標(biāo)記所有細(xì)菌，PI探針僅能標(biāo)記細(xì)胞膜受損細(xì)菌。未做任何處理的細(xì)胞僅有0.9%被PI沾染（圖4A），熒光顯微鏡結(jié)果同樣只觀察到綠色細(xì)胞，未觀察到紅色細(xì)胞（圖5A）；MIC苯乳酸、MIC醋酸處理大腸桿菌1 h后，PI沾染率分別為15.5%、3.9%（圖4C、E），且從熒光顯微鏡結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞都發(fā)出綠色熒光（圖5C、E），表明苯乳酸、醋酸對大腸桿菌的細(xì)胞膜損傷率極低；此外，單一組分的1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸處理的大腸桿菌PI沾染率分別為8.8%、1.6%，而1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸處理組大腸桿菌的PI沾染率為12.8%，明顯高于二者單獨使用（圖4B、D、F）；圖5B、D、F同樣顯示1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸處理組發(fā)出紅色熒光的細(xì)胞多于1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸處理組，表明苯乳酸和醋酸聯(lián)用對細(xì)胞膜具有協(xié)同破壞性。同時發(fā)現(xiàn)，盡管苯乳酸與醋酸聯(lián)用可以破壞大腸桿菌細(xì)胞膜，但是PI沾染率低于13%，表明兩種有機(jī)酸聯(lián)用破壞了大腸桿菌細(xì)胞膜滲透性而對完整性的損傷較小。關(guān)于苯乳酸對細(xì)胞膜的損傷研究，Liu Fang等[18]利用熒光探針cFDA和PI觀察到10 mg/100 mL苯乳酸對陰溝腸桿菌細(xì)胞膜完整性造成了嚴(yán)重?fù)p害。本研究中發(fā)現(xiàn)苯乳酸對大腸桿菌細(xì)胞膜完整性損傷較小，一方面可能由于所用指示菌的差異性；另一方面可能是苯乳酸所用質(zhì)量濃度差異導(dǎo)致，本研究中苯乳酸MIC僅為1.25 mg/mL，為Liu Fang等所使用的質(zhì)量濃度的1/8。

圖5 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌細(xì)胞膜完整性影響的熒光顯微鏡圖Fig.5 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on cell membrane integrity of E.coil observed by fluorescence microscopy

2.5 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響

圖6 掃描電子顯微鏡觀察苯乳酸與醋酸對大腸桿菌超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on cell ultrastructure of E.coil observed by scanning electron microscopy

從圖6可以看出，空白對照組大腸桿菌細(xì)胞顯示規(guī)則的桿狀形態(tài)，細(xì)胞大小分布均勻；MIC苯乳酸、MIC醋酸處理大腸桿菌后，菌體均發(fā)生凹陷等變形現(xiàn)象，個別菌體出現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，細(xì)胞發(fā)生黏連現(xiàn)象（圖6C、E）。1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸以及1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸處理大腸桿菌后，大腸桿菌菌體表面變粗糙，出現(xiàn)輕微變形（圖6B、D、F）。結(jié)果表明苯乳酸與醋酸聯(lián)用對大腸桿菌的細(xì)胞壁和膜完整性無明顯損傷，這與Dieuleveux等[15]報道的苯乳酸對單細(xì)胞增生李斯特菌產(chǎn)生損傷結(jié)果不同，即苯乳酸可以破壞單細(xì)胞增生李斯特菌的細(xì)胞壁，使其失去剛性，細(xì)胞崩解。上述結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)及熒光顯微鏡結(jié)果一致，因此推測苯乳酸和醋酸對大腸桿菌的破壞作用可能由于抑菌劑能透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞而對細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生作用從而導(dǎo)致菌體變形、局部破裂而產(chǎn)生抑菌作用。

2.6 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌蛋白質(zhì)的影響

圖7 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌蛋白質(zhì)影響的SDS-PAGE圖Fig.7 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on protein profile of E.coil evaluated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

蛋白質(zhì)是參與生命活動的大分子物質(zhì)，與新陳代謝、電子傳遞等各種生理活動密切相關(guān)。擾亂或阻斷蛋白質(zhì)的合成從而達(dá)到抑菌作用是抑菌物質(zhì)的作用方式之一[29-31]。因此，通過SDS-PAGE考察苯乳酸與醋酸處理對大腸桿菌蛋白質(zhì)的影響。如圖7所示，僅在分子質(zhì)量43 kDa處，泳道2～7相對于泳道1處發(fā)生條帶減弱消失的現(xiàn)象，其他條帶均無明顯變化，說明苯乳酸、醋酸及二者聯(lián)用對蛋白質(zhì)表達(dá)無明顯影響。Str?m等[17]通過雙向電泳研究了苯乳酸對絲狀真菌蛋白質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)20 mmol/L苯乳酸作用于絲狀真菌Aspergillus nidulans時，苯乳酸改變了蛋白質(zhì)的表達(dá)，并推測作用位點是苯丙酸脫氫酶。苯乳酸對大腸桿菌和絲狀真菌的蛋白表達(dá)影響不一樣可能是由于苯乳酸質(zhì)量濃度差異或者細(xì)菌、真菌的基因表達(dá)不同。

2.7 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌基因組DNA的影響

圖8 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌DNA影響的熒光光譜圖Fig.8 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on genomic DNA of E.coil

DNA是生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，DNA的損傷會影響遺傳信息的表達(dá)，導(dǎo)致代謝合成過程的紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此采用了熒光光譜法考察DNA與抑菌劑的相互作用。從圖8可以看出，經(jīng)苯乳酸、醋酸處理后，大腸桿菌DNA熒光發(fā)生猝滅，且隨著質(zhì)量濃度的增加猝滅程度加重，即抑菌劑作用后，大腸桿菌的DNA含量降低，表明苯乳酸、醋酸破壞DNA結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA泄漏或者干擾DNA的正常合成代謝從而抑制大腸桿菌。Liu Fang等[18]通過紫外吸收測試，發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度（1 mg/mL）的苯乳酸僅引起小分子物質(zhì)如ATP的泄漏，高質(zhì)量濃度苯乳酸引起小分子物質(zhì)泄漏的同時還會導(dǎo)致大分子物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)的泄漏。此外，有機(jī)酸還可通過干擾甚至阻斷DNA的合成，插入DNA雙螺旋中的凹槽，影響復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)等以發(fā)揮抑菌作用[32-33]。

3 討 論

苯乳酸作為一種天然抑菌劑，由于其無毒、抑菌譜廣而受到人們的關(guān)注，且抑菌劑聯(lián)用可有效提高抗菌活性，減少抑菌劑的使用。前期研究[11]發(fā)現(xiàn)乳酸、醋酸存在下，可使苯乳酸抑真菌活性分別提高30%、18%。苯乳酸與苯甲酸鈉、山梨酸鉀聯(lián)用對大腸桿菌具有協(xié)同抑菌作用，且苯乳酸使用劑量能降低75%[34]。乳酸鈉和Nisin聯(lián)合使用能顯著增強(qiáng)乳酸鈉對布氏曲霉的抑菌作用[35]。本實驗中苯乳酸與醋酸聯(lián)用對大腸桿菌具有協(xié)同抑菌作用，1/2 MIC苯乳酸和1/4 MIC醋酸即可達(dá)到單一抑菌劑質(zhì)量濃度為MIC時的抑菌效果，苯乳酸和醋酸的使用量分別降低了50%和75%。此外，苯乳酸、醋酸在食品可同時發(fā)揮抑菌、酸度調(diào)節(jié)劑的作用，因此在食品體系中具有潛在應(yīng)用價值。

目前，關(guān)于苯乳酸的單一抑菌機(jī)理報道較多，主要集中在細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、DNA等作用靶位[15-18]。本研究發(fā)現(xiàn)苯乳酸、醋酸作用于大腸桿菌，均可改變其細(xì)胞Zeta電位、細(xì)胞膜電勢，但對細(xì)胞膜完整性損傷較少，表明苯乳酸和醋酸主要通過改變細(xì)胞膜滲透性但不明顯改變其完整性而發(fā)揮抑菌作用，苯乳酸和醋酸對蛋白質(zhì)沒有明顯影響，可能是抑菌物質(zhì)的質(zhì)量濃度還沒達(dá)到引起大分子物質(zhì)泄漏的水平。

綜上所述，推測苯乳酸和醋酸對大腸桿菌的抑菌作用通過透過大腸桿菌細(xì)胞膜，輕微破壞大腸桿菌細(xì)胞膜完整性，影響Zeta電位、膜電勢，進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)與DNA發(fā)揮作用，擾亂其正常生理代謝從而導(dǎo)致大腸桿菌的死亡達(dá)到抑菌目的。