黃丹，陳曦，劉燕

（贛南醫(yī)學院，江西贛州 341000）

基因組攜帶了個體的全部遺傳信息，通過對基因組測序可以幫助人們加深對疾病分子機制的理解，同時基因組測序在診斷與治療方面也發(fā)揮著重要作用。在人類基因組學計劃完成后，基因測序技術發(fā)展迅猛，其在臨床實踐和基礎研究中的應用更加廣泛。二代測序（Second-Generation Sequencing，SGS）技術憑借其高通量、高準確率和低成本的特點，成為當前主流的測序技術。但是隨著研究的深入，二代測序技術的短讀長（＜450 bp）增加了后續(xù)數據分析和基因組拼接的難度，也限制了該技術在未來研究中的應用[1]。近年來出現的第三代測序儀（Next-Generation Sequencing，NGS）——納米孔測序儀（MinION），很好地彌補了這些缺憾。MinION的測序系統(tǒng)可以一次性獲得的最大讀長為882 kb[2]。不同于SGS“邊合成邊測序”的方法，納米孔（Nanopore）測序是采取“邊解鏈邊測序”的方法[3]。MinION進行測序時需要測序芯片Flow Cell，每張芯片上有512個傳感器，每個傳感器上連接4個納米孔，總計2 048個納米孔，并由專門的集成電路控制。MinION的核心部件是由蛋白質構成的小孔，被稱之為“pore”，這個pore被設置在一層電阻率很高的薄膜當中，薄膜的兩側都浸沒在含有離子的溶液中。在薄膜的兩側加上不同的電位，離子就會通過蛋白質小孔，從膜的一側移動到膜的另一側。測序開始后，在文庫制備過程中DNA末端被接上了特殊的Y形接頭，可被納米孔蛋白的DNA聚合酶所捕獲，DNA聚合酶將雙鏈DNA打開并引導其中一條單鏈穿過納米孔。不同堿基在經過通道時，引起不同的電流干擾振幅被傳感器記錄下來，經過算法被電腦記錄為不同的堿基字符[4]。DNA聚合酶被固定在零透光率的管制微池底部，并與單鏈DNA結合；當不同色基標記的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）游離到微孔底部時即刻整合進延伸中的DNA鏈，其與焦磷酸極端連接的色基在激發(fā)激光作用下發(fā)光并被記錄，然后游離到環(huán)境中[5]。

相對于其他測序平臺，MinION具有便攜簡單、超長讀長及實時監(jiān)控測序數據等優(yōu)點，該設備的優(yōu)點使其廣泛應用于各個領域。如表1所示，Nanopore測序在各大領域有著突出的表現，本文將對這一測序技術在臨床相關領域中的應用進行介紹。

表1 Nanopore測序技術的臨床應用

1 臨床病原微生物鑒定

人體許多疾病的發(fā)生與微生物系統(tǒng)的失調或者微生物的入侵有著極其緊密的關系，當前針對臨床病原微生物的Nanopore測序主要包括宏基因組測序（metagenomic Next Generation Sequencing，mNGS）及全基因組測序（Whole-Genome Sequencing，WGS）。

宏基因組測序是對單個樣品中獲得的所有核酸進行測序，通過分析所有微生物核酸信息來深入了解樣本中的微生物組構成，并尋找相關致病微生物。利用無組裝的Nanopore對病毒進行宏基因組測序將有助于全面了解病毒基因組的結構及其變異，并能夠準確地對病毒及寄生蟲的性質和流行情況進行分析[6-7]。MinION被用于呼吸道病原體的快速檢測具有同時檢測出多種病原體并對病原進行分型的能力，但仍有一些技術問題需要解決。如在快速檢測背景下，人的臨床樣本，尤其是咽拭子、血液、尿液等樣本，其宿主核酸含量占比一般較高，病原體核酸含量極低，導致測序數據中宿主相關序列占絕大部分，能否去除樣本中大量的宿主核酸成為宏基因組測序成功與否的關鍵[7-8]?；谠碥湛梢杂行コ?9.99%的宿主DNA， Charalampous等[9]開發(fā)了一種用于細菌性下呼吸道感染（Lower Respiratory Infection，LRI）診斷的宏基因組學方法?；贜anopore測序，病原體檢測的敏感性和特異性均顯著提升，同時可檢測出抗生素抗性基因。而且Nanopore宏基因組學可以快速準確地鑒定細菌LRI，有助于減少廣譜抗生素的使用。

全基因組測序是指在無參考序列情況下，憑借生物信息學分析方法直接對物種序列進行拼接、組裝，最終獲得該物種的基因組圖譜。全基因組測序有助于人們深入了解物種的基因組成及分子進化，但是相鄰區(qū)域之間重復序列的干擾是組裝過程中的一大阻礙。Moss等[10]提出一套測序流程（Lathe）：結合長讀長序列組裝和短讀長序列糾錯，可以從復雜的微生物群落中組裝完整的基因組。使用Nanopore測序共獲得了30.3 GB數據，這些數據包含了全部12種細菌。12個細菌中共有7個組裝成完整基因組，另外3個基因組被組裝成4個或更少的片段，組裝程度最差的細菌基因組包含單個片段中83%的基因組。以上結果表明：Nanopore測序組裝結果比二代測序更具有連續(xù)性。雖然與其他測序和組裝方法相比，核苷酸的準確性有所下降，但該方法提高了組裝的連續(xù)性，在研究生物功能尤其是重復原件的作用等方面具有廣闊的應用前景。

2 臨床病原微生物耐藥診斷

病原體通過基因突變而獲得對抗生素的耐藥性，對臨床治療造成了極大的影響。當前，臨床上主要采取抗菌藥物敏感性試驗（Antimicrobial Susceptibility Testing，AST）進行微生物耐藥診斷。但是AST標準方法存在一些缺陷：（1）AST結果通常需要在臨床完成采樣后48～72 h生成，這對患者及時接受抗生素治療是一大阻礙；（2）現在投入臨床使用的自動AST面板所包含的抗生素數量有限，無法識別新發(fā)現且具有治療意義的耐藥菌；（3）標準的AST報告不包括耐藥機制的鑒定，如超廣譜β-內酰胺酶（Extended-Spectrum β-lactamase，ESBL） 等[11]。Tamma等[12]使用Nanopore對40例臨床肺炎克雷伯菌復雜菌株進行測序及組裝，基因型測序分析結果和AST結果一致性高達92%。從培養(yǎng)分離株到獲得完整的抗生素耐藥（Antimicrobial Resistance，AMR）基因僅用時8 h，在14 h時可以檢測到更多的耐藥基因，如氟喹諾酮類、氨基糖苷類和多合蛋白（mcr-1及其變體）。Wang等[13]利用Nanopore對肺炎患者的臨床微生物進行測序，并全程指導臨床抗生素治療，使患者獲得及時有效的治療。同時，Tafess等[14]利用Nanopore測序對臨床結核病人的雙歧桿菌耐藥基因進行分析，結果顯示：與表型藥物敏感性試驗（phenotypic Drug Susceptibility Test，pDST）相 比，Nanopore測序分析的平均臨床敏感性和臨床特異性分別高達94.8%和98.0%，而整個測序耗時僅為15 h，并且可以比pDST至少提前17～18 d提供治療指導。Nanopore測序不僅可以靶向檢測耐藥基因的突變，還能給臨床用藥提供及時的指導意見，同時也能為患者的愈后情況提供預估標準[15-17]。測序平臺的高通量、高輸出、高效率對于實時監(jiān)測提供了巨大的臨床價值。

3 腫瘤診治中的應用

隨著分子技術的進步，將腫瘤進行分子分型已經成為臨床診斷、治療指導及預后評估的重要手段。例如，針對中樞神經系統(tǒng)腫瘤，世界衛(wèi)生組織明確要求進行分子檢測并進行分子分型，如1p/19q共缺失或異檸檬酸脫氫酶（IDH）突變[18]。目前，基因組測序主要局限于耗時過長，對于臨床早期診斷是一大障礙。Euskirchen等[19]利用Nanopore測序對28例腦腫瘤樣本進行全基因組測序，測序結果顯示：與NGS相比，Nanopore測序準確性較差，但是在采樣當天即可出具同樣起到診斷作用的測序報告。同時其研究結果表明，Nanopore測序對表觀遺傳修飾和單核苷酸變異（single nucleotide variants，SNV）進行當天診斷是可行的。Minervini等[20]利用納米孔MinION技術的深度測序對BCR-ABL1陽性白血病進行突變分析，將測序結果與Sanger法測序結果進行對比，發(fā)現其結果的一致性達到92%。此外，納米孔測序還檢測出兩例Sanger測序為陰性的低水平突變樣本。Nanopore測序技術不僅準確檢測到了耐藥患者存在BCR-ABL1融合突變，還突顯出識別潛在的低水平變體和區(qū)分“復合突變體”的優(yōu)勢。此外，研究人員巧妙地利用crispr-cas9靶向切割的原理將目的片段進行靶向捕獲，按照Minervini的方法對目的序列進行富集，在低通量的情況下得到目的序列。相對傳統(tǒng)的融合基因檢測特異性需要針對已知融合類型的檢出，該方法可以不需要知道融合基因中具體的融合伴侶進行融合基因檢測，并且可以發(fā)現未知融合，這對于腫瘤融合基因檢測技術是巨大的進步。

4 遺傳性疾病的診斷與檢測

遺傳病是指由遺傳物質發(fā)生改變而引起或者是由致病基因所控制的疾病，具有先天性、終生性和家族性，且具有病種多、發(fā)病率高等特點?；蚪M變異主要分為SNV、插入缺失（Indel）、結構變異（Structural Variants，SVs）三大類。其中SVs通常指基因組上大的序列變化和位置關系變化，包括長度在50 bp以上的長片段序列插入或者刪除、串聯重復、染色體倒位、染色體內部或染色體之間的序列易位、染色體變異以及形勢更為復雜的嵌合性變異。結構變異的檢測技術有多種，其中以短讀長測序為基礎的WES（Whole Exome Sequencing，全外顯子組測序）/WGS檢出率有限（不足50%），這是由于短讀長測序技術無法可靠地鑒定重復區(qū)域或難以覆蓋到高GC含量的區(qū)域，而Nanopore測序具有超長讀長（目前最長為2.4 MB）、無GC偏好性、直接檢測甲基化等優(yōu)勢，能夠跨越重復序列從而克服短讀長測序在鑒定遺傳病SVs中所面臨的挑戰(zhàn)。目前，利用納米孔長讀長測序解析遺傳病的結構變異已有很多案例，如Miao等[21]采用Nanopore測序技術在一例WES陰性的患者中精準鑒定出SVs。發(fā)現先證者G6PC基因的外顯子1和2的缺失，雜合性缺失導致患病，不僅對患者進行了確診，還明確了結構變異的來源。Zhang等[22]使用Nanopore測序找到平衡易位準確斷點，用于第三代試管嬰兒進行胚胎篩選，確定胚胎是否是倒位、平衡易位攜帶者，從而為胚胎植入前遺傳學診斷（Preimplantation Genetic Giagnosis，PGD）提供了重要參考。Deng等[23]和Ishiura等[24]則利用Nanopore長讀長測序技術，解析出了短讀長無法獲得的家族性皮質肌陣攣性震顫伴癲癇患者重復序列以及神經元核內包涵體?。∟euronal Intranuclear Inclusion Disease，NIID）的變異位點。相對于目前的IS-PCR、MLPA+巢式PCR、短讀長測序等復雜且繁瑣的檢測方法，Nanopore長讀長測序作為現有基因診斷技術的有效補充技術，能夠一次性完成結構變異檢測，同時檢測倒位和點突變等變異，適用于染色體平衡易位的斷裂點診斷、有假基因的單基因遺傳病診斷、有復雜重復序列的單基因遺傳病診斷、有復雜的基因組結構變異的單基因遺傳病以及甲基化相關的遺傳病診斷。

5 結語

以Nanopore測序技術為代表的三代測序平臺在精準性上比二代測序平臺低，在實際應用中的推廣依然存在著一定的阻力，同時由于是新興技術，各類試劑的更迭及分析方法的更新對研究人員有著更高要求；然而其在臨床微生物病原學檢測、感染相關病原體的診斷、腫瘤學研究以及遺傳性疾病的檢測等方面都有著不俗表現，這也為相關的學科研究提供了新的思路與技術，Nanopore測序也將在更多的領域呈現更大的臨床與研究價值。