趙 垚，曹小勇，秦公偉，高 尚，胡選萍，蔣景龍

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000)

白及(Bletillastriata)為蘭科白及屬的多年生宿根草本植物，其花大色艷，且有肥厚肉質(zhì)的可供藥用的塊莖[1]，具有收斂止血、消腫生肌等功效，用于治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥狀。白及不僅藥用價值高，而且具有較高的觀賞價值[2]，是我國現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)[3]和化妝品工業(yè)的重要原材料[4]。白及屬約有6種，主要分布于亞洲的緬甸北部、中國至日本。中國產(chǎn)有4種，分別為華白及(Bletillasinensis)、小白及(Bletillaformosana)、白及(Bletillastriata)和黃花白及(Bletillaochracea)。主產(chǎn)于貴州、四川、湖南等地區(qū)[2]。

蘭科種子極其微小，種皮內(nèi)僅有1個發(fā)育不完全的胚，沒有胚乳和子葉，只有脂滴和少量蛋白質(zhì)，缺乏萌發(fā)過程中所需要的后備營養(yǎng)，自然條件下萌發(fā)率極低。植物激素在蘭科植物組織培養(yǎng)誘導(dǎo)原球莖的過程中起到重要作用，是蘭科植物成苗的關(guān)鍵因素，也是影響種子發(fā)芽的重要因子[5]。目前的研究顯示白及種子可以在液體培養(yǎng)基中萌發(fā)形成原球莖，原球莖通過播種在干凈介質(zhì)上快速形成實生苗。代建麗等[6]以白及蒴果為材料，應(yīng)用涂布法接種白及種子，研究植物激素對種子無菌萌發(fā)的影響，得出6-BA是影響種子萌發(fā)的主要因素，而赤霉素對種子的影響不明顯。張燕等[7]研究表明，1.0 mg/L NAA適合種子萌發(fā)，0.1mg/L 6-BA和NAA組合會降低種子萌發(fā)率。郄亞微[8]在MS、1/2 MS添加6-BA的培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌播種，得出種子最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA，它能有效提高萌發(fā)率，促進(jìn)原球莖的生長；無性繁殖最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。王楷等[9]研究表明，1.0 mg/L 6-BA適合白及種子萌發(fā)。趙漫麗等[10]研究表明，2.0 mg/L 6-BA以下濃度的和1.0 mg/L NAA組合促進(jìn)種子萌發(fā)。但白及種子在液體培養(yǎng)基中添加不同激素對其無菌萌發(fā)的影響，目前尚沒有深入研究報道。本試驗探求不同濃度的6-BA、NAA、ABA、GA3對白及種子萌發(fā)的影響，在不同濃度液體激素培養(yǎng)基中培養(yǎng)白及種子，確定種子在離體萌發(fā)過程中激素對其影響，為白及種子萌發(fā)液體培養(yǎng)基優(yōu)化及其他種類蘭科植物種子萌發(fā)積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白及蒴果采自陜西省漢中市留壩縣(N33°37.516′，E106°54.958′，海拔(972.2±6.2) m)白及栽培基地，采摘后放入牛皮紙袋，5 ℃冷藏待用。

1.2 白及種子在不同培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)

選取未開裂蒴果用體積分?jǐn)?shù)75%酒精處理60 s，體積分?jǐn)?shù)10%的NaClO溶液處理20 min后，用無菌水沖洗3次。無菌條件下剝?nèi)ス?，?/2 MS為基本培養(yǎng)基，將約100粒種子分別接入濃度梯度為0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L的6-BA、NAA、ABA、GA3液體培養(yǎng)基中，1/2 MS液體培養(yǎng)基為空白對照組，每種培養(yǎng)基重復(fù)5瓶。

1.3 培養(yǎng)條件與觀察統(tǒng)計

培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度2500～3000 lx，光照時間12 h/d，靜置培養(yǎng)。用Leica M205C體視顯微鏡連續(xù)觀察，在15、30、50 d拍照記錄白及種子發(fā)育過程，分別取至少20個樣本進(jìn)行測量，重復(fù)3次統(tǒng)計原球莖直徑、葉片長度和萌發(fā)率等。當(dāng)種子內(nèi)的種胚大于種皮直徑，不論胚是否突破種皮，全視為萌發(fā)，計算公式：萌發(fā)率=(萌發(fā)種子數(shù)/有胚種子數(shù))×100%；實驗結(jié)果用Digimizer進(jìn)行數(shù)據(jù)測量，GraphPad Prism 5.01進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析，相同培養(yǎng)天數(shù)不同濃度之間采用Tukey檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，顯著水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 白及種子萌發(fā)及生長過程

白及種子細(xì)小呈紡錘形，種胚呈淡黃色，對照組不加任何激素，培養(yǎng)3 d后種胚轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色，7 d后絕大多數(shù)種胚變綠、突破種皮并在原球莖基部出現(xiàn)少量假根；15 d時統(tǒng)計萌發(fā)率為100%，原球莖呈綠色，平均直徑達(dá)(0.30±0.07) mm，其頂端生長錐逐步發(fā)育形成葉原基，平均長度(0.11±0.08) mm；培養(yǎng)至30 d，原球莖增長迅速，直徑達(dá)(1.17±0.24) mm，但葉片生長較緩，平均長度(0.43±0.31) mm；培養(yǎng)至50 d，原球莖持續(xù)增大，直徑為(1.33±0.20) mm，葉片長(0.63±0.52) mm。

2.2 6-BA對白及種子萌發(fā)及生長的影響

添加不同濃度6-BA后，萌發(fā)率平均可達(dá)98%，培養(yǎng)15 d時僅在高濃度中有少量未萌發(fā)，后期培養(yǎng)中均萌發(fā)，與對照組無顯著差異(見圖1)。在原球莖生長早期(15 d)1.0 mg/L 6-BA開始出現(xiàn)顯著抑制，2.0 mg/L 6-BA中原球莖長勢較差，發(fā)育延緩，葉片平均長度僅(0.04±0.04) mm；培養(yǎng)30 d和50 d，在0.1～1.0 mg/L 6-BA中表現(xiàn)出對原球莖生長的促進(jìn)作用，葉片生長表現(xiàn)出濃度越高越受抑制，高濃度中原球莖和葉片生長緩慢，但從分析來看原球莖直徑和葉片長度與對照組無顯著性差異。

(a) 原球莖生長情況 (b) 葉片生長情況圖1 添加不同濃度6-BA后不同培養(yǎng)時間白及原球莖和葉片生長情況

2.3 NAA對白及種子萌發(fā)及生長的影響

添加不同濃度NAA進(jìn)行培養(yǎng)，萌發(fā)率可達(dá)100%，與對照組無差異。主要出現(xiàn)原球莖綠色消退，由綠變黃甚至接近“白化”現(xiàn)象，濃度越高褪色現(xiàn)象越明顯，但種子萌發(fā)和葉片轉(zhuǎn)綠生長正常。培養(yǎng)15 d時，0.1 mg/L NAA開始出現(xiàn)原球莖綠色變?yōu)辄S綠色現(xiàn)象，2.0 mg/L NAA中原球莖已完全呈半透明狀，且生長狀態(tài)差；培養(yǎng)至30 d時“白化”現(xiàn)象逐漸變?nèi)酰胪该鳡顟B(tài)不明顯；培養(yǎng)50 d時大于0.1 mg/L NAA原球莖生長越受抑制，濃度越高抑制作用越顯著，葉片生長情況類似，高濃度顯著抑制葉片生長(圖2)。

(a) 原球莖生長情況 (b) 葉片生長情況圖2 添加不同濃度NAA后不同培養(yǎng)時間白及原球莖和葉片生長情況

2.4 ABA對白及種子萌發(fā)及生長的影響

添加ABA后均表現(xiàn)出對白及種子萌發(fā)和原球莖生長的抑制作用，濃度越大抑制萌發(fā)及生長越明顯，但原球莖轉(zhuǎn)綠未受抑制。培養(yǎng)至15 d時，0.1 mg/L ABA中萌發(fā)率為100%，原球莖變綠，但生長受抑制，0.5 mg/L ABA開始出現(xiàn)顯著抑制萌發(fā)及生長現(xiàn)象，原球莖呈淺黃色，萌發(fā)率為75%，高濃度中萌發(fā)率僅40%(圖3)；培養(yǎng)至30 d時，與對照組相比添加ABA后白及種子發(fā)育情況較差，0.5 mg/L ABA原球莖呈綠色，但其生長受抑制，1.0 mg/L ABA中原球莖呈淺綠色，2.0 mg/L ABA中為淺黃色，后期發(fā)育逐漸變綠。培養(yǎng)后期不論是原球莖直徑還是葉片長度均表現(xiàn)出0.1 mg/L ABA與對照組差異不顯著，其余濃度越高抑制作用越明顯(見圖4)。不同濃度的ABA對白及種子的萌發(fā)及原球莖生長變化統(tǒng)計見表1。

(a) 對照組 (b) 0.1 mg/L ABA (c) 0.5 mg/L ABA圖3 培養(yǎng)15 d白及生長情況

(a) 原球莖生長情況 (b) 葉片生長情況圖4 添加不同濃度ABA后不同培養(yǎng)時間白及原球莖和葉片生長情況

表1 添加不同濃度ABA后不同培養(yǎng)天數(shù)白及萌發(fā)率和原球莖生長情況

2.5 GA3對白及種子萌發(fā)及生長的影響

添加不同濃度GA3后，平均萌發(fā)率95%，與對照組無明顯差異，主要表現(xiàn)出對原球莖和葉的伸長作用，但個體之間差異較大(見圖5、圖6)。原球莖直徑在不同培養(yǎng)時間，僅低濃度0.1 mg/L GA3中原球莖與對照組無顯著差異，其余濃度表現(xiàn)出差異顯著性(圖5(a))，原球莖明顯伸長，呈淺綠色。培養(yǎng)至30 d時，對照組原球莖平均長度(0.90±0.29) mm，0.5 mg/L GA3中原球莖平均長度可達(dá)(1.78±0.78) mm，且伸長部分呈透明狀，隨著濃度升高，伸長現(xiàn)象越明顯；50 d時原球莖平均長度(3.23±1.38) mm，但高濃度2.0 mg/L GA3中白及伸長不明顯且生長受抑制(圖5(b))。

(a) 原球莖直徑生長情況 (b) 原球莖長度生長情況圖5 添加不同濃度GA3后不同培養(yǎng)時間白及原球莖生長情況

圖6 添加不同濃度GA3后不同培養(yǎng)時間白及葉片生長情況

白及種子在添加不同濃度6-BA、NAA、ABA、GA3上萌發(fā)生長結(jié)果與空白對照組相比，僅添加ABA后表現(xiàn)出萌發(fā)率的差異，高濃度中萌發(fā)率僅為40%，顯著抑制了種子萌發(fā),其他3種植物激素中萌發(fā)率無顯著差異。添加4種植物生長調(diào)節(jié)劑均表現(xiàn)出高濃度原球莖生長受抑制。添加6-BA后原球莖直徑和葉片生長與對照組無顯著差異(圖7(b))；添加NAA后在白及種子萌發(fā)早期使原球莖綠色褪變?yōu)辄S綠色甚至出現(xiàn)半透明狀(圖7(c))，后期這種現(xiàn)象逐漸變?nèi)?；在ABA環(huán)境下的白及種子萌發(fā)延緩，濃度越高萌發(fā)受抑制越明顯，但并不抑制原球莖轉(zhuǎn)綠生長(圖7(d))；添加GA3后白及種子生長過程中出現(xiàn)了顯著促進(jìn)原球莖和葉的伸長(圖7(e))，但在所有培養(yǎng)中僅添加GA3后表現(xiàn)出個體之間差異大。

(a) 對照組 (b) 6-BA (c) NAA (d) ABA (e) GA3。 圖7 培養(yǎng)30 d對照組和4種植物生長調(diào)節(jié)劑(1.0 mg/L)中白及生長情況

3 結(jié)論與討論

白及作為蘭科植物中的一員，自然條件下萌發(fā)困難，其成熟的種子呈橄欖形，種皮為單層細(xì)胞組成[11]。種子的萌發(fā)和休眠受多種因素控制，包括植物激素[12]和一些化感物質(zhì)[13]，如蘭科植物天麻種子需要有共生菌的參與才能萌發(fā)。Dimalla[14]表明在外源細(xì)胞分裂素存在下，通過更有效地利用脂質(zhì)，可以促進(jìn)蘭花種子的萌發(fā)。外源細(xì)胞分裂素處理增加了許多蘭花的共生萌發(fā)，de Pauw[15]發(fā)現(xiàn)在低濃度BA的存在下，白杓蘭(Cypripediumcandidum)的發(fā)芽率增加，而更高的濃度則不會增加發(fā)芽率。Miyoshi等[16-17]、Stewart等[18]報道的幾種陸地蘭花添加外源細(xì)胞分裂素后萌發(fā)水平都有所提高，他們發(fā)現(xiàn)低細(xì)胞分裂素水平比高細(xì)胞分裂素水平更能促進(jìn)蘭花種子萌發(fā)。這與我們的試驗結(jié)果一致，添加6-BA后在0.1 mg/L～1.0 mg/L中表現(xiàn)出對原球莖生長的促進(jìn)作用，而高濃度2.0 mg/L中原球莖生長受抑制。郄亞微[8]的實驗表明6-BA促進(jìn)白及種子的萌發(fā)，而此次試驗結(jié)果顯示大于1.0 mg/L 6-BA抑制白及原球莖生長，且濃度越高葉片生長受阻，這可能是由于白及種子生長環(huán)境不同、發(fā)育模式不同，從而影響了對種子萌發(fā)的作用。生長素特別是在脅迫條件下能夠刺激乙烯發(fā)生，進(jìn)而刺激許多植物種子萌發(fā)[19]，Miyoshi等[16]報道了在不同濃度的BA和NAA的作用下，蝦脊蘭(Calanthediscolor)的萌發(fā)率相似，但是當(dāng)在高濃度的NAA中培養(yǎng)時，更能促進(jìn)原球莖的發(fā)育。Pedroza-Manrique[20]報道了在生長素存在下，粉花凹唇蘭(Comarettiafalcata)的萌發(fā)減少。而本次試驗結(jié)果表明高濃度2.0 mg/L NAA抑制白及原球莖的生長，濃度越高抑制作用越顯著，添加NAA主要是對原球莖綠色消褪產(chǎn)生影響。

LEE等[21]在研究三棱蝦脊蘭(Calanthetricarinata)內(nèi)源性脫落酸濃度和非共生種子萌發(fā)的發(fā)育變化中發(fā)現(xiàn)，蘭花種子中高濃度的內(nèi)源ABA可能在阻止胚胎生長和防止種子發(fā)芽中起關(guān)鍵作用。其次，在研究南瓜、黃瓜等其他植株中同樣發(fā)現(xiàn)ABA能夠抑制葉綠素的形成[22-23]，脫落酸(ABA)比茉莉酸甲酯(MJ)更有效地抑制生長和葉綠素的產(chǎn)生[24]，脫落酸抑制葉綠體膜系統(tǒng)的發(fā)育，抑制葉綠素的合成[25]。本次試驗我們同樣發(fā)現(xiàn)ABA的確會抑制白及種子的萌發(fā)和原球莖的生長，但并不會抑制原球莖變綠生長，在添加ABA后，白及種子生長延緩，但種子萌發(fā)后原球莖轉(zhuǎn)綠生長并不受抑制，可能意味著其光合作用未受影響，葉綠素合成也未受阻，只是延遲了白及的萌發(fā)和生長。

盡管GA常常會促進(jìn)許多植物的種子發(fā)芽，但發(fā)現(xiàn)對蘭科的影響結(jié)果卻不盡相同。Kauth等[26]表明BA、TDZ和KT常促進(jìn)蘭科種子萌發(fā)，GA也促進(jìn)許多植物的種子萌發(fā)，但在蘭花種子萌發(fā)中的應(yīng)用還不是很成功[27]，GA3濃度可能過高，不能促進(jìn)種子萌發(fā)，但對促進(jìn)幼苗發(fā)育是最佳的。Miyoshi等[16]的結(jié)果表明，GA3不能促進(jìn)C.discolor的種子萌發(fā)，但確實促進(jìn)了蝴蝶蘭的幼苗發(fā)育[28]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)GA3不影響白及種子萌發(fā)，但對白及原球莖和葉片的伸長有明顯促進(jìn)作用，但個體之間差異較大。

Johnson[29]利用離體培養(yǎng)對佛羅里達(dá)的瀕危蘭科植物紫蘭種子萌發(fā)和籽苗早期發(fā)育進(jìn)行研究，包括GA3、ABA、赤霉素合成抑制劑多效唑(paclobutrazol)和矮壯素(chlormequat)對種子萌發(fā)及早期籽苗發(fā)育影響，結(jié)果顯示赤霉素和脫落酸對種子萌發(fā)及早期籽苗發(fā)育都顯示抑制效果，脫落酸的抑制效果是可預(yù)見的，而赤霉素則令人意外，因為赤霉素通常有促進(jìn)種子萌發(fā)、降低種子休眠作用，本研究也同樣發(fā)現(xiàn)高濃度GA3抑制白及生長。Pedroza-Manrique等[20]采用MS基本培養(yǎng)基，測試了IAA、KT和GA33種生長物質(zhì)對蘭科植物C.falcata的種子萌發(fā)作用，其中IAA顯著降低了種子的萌發(fā)，在KT和GA3的組合中，對種子萌發(fā)率和幼苗發(fā)育具有協(xié)同作用。李雨晴[30]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA對白及種子發(fā)芽的促進(jìn)作用比NAA強(qiáng)；生長素和細(xì)胞分裂素在種子萌發(fā)過程中起著非常重要的作用，尤其是細(xì)胞分裂素的作用更為明顯[31-32]。本試驗中同樣發(fā)現(xiàn)，6-BA對白及種子原球莖的生長促進(jìn)作用較NAA更為明顯。此外，郭順星，郭順星等[33]表明白及種子在純水中或滅菌樹葉上能正常萌發(fā)，與本試驗結(jié)果類似，證明白及種胚具有萌發(fā)所需的貯存物質(zhì)。

本次試驗結(jié)果表明采用1/2 MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)白及種子，首先種胚吸水膨大突破種皮，原球莖轉(zhuǎn)為綠色隨之長葉，未出現(xiàn)明顯真根，這與其在固體培養(yǎng)基質(zhì)中的發(fā)育模式不同，在后期培養(yǎng)過程中極少個體出現(xiàn)真根，此現(xiàn)象可能是其未完全浸在水中，貼壁接觸到較多空氣所致。綜上所述，白及種子在適宜溫度、適宜光照等條件下，不添加外源激素均可正常萌發(fā)。其他植物生長物質(zhì)或組合對其萌發(fā)的影響還需進(jìn)一步進(jìn)行驗證。