楊瑞利，盧娜，張慧，周賽楠，張青，薛長(zhǎng)湖,2，唐慶娟

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

（2.海洋國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266237）

脂質(zhì)代謝紊亂已被認(rèn)為是嚴(yán)重疾病的標(biāo)志[1]。脂代謝紊亂與肥胖，非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD），糖尿病，動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[2]。NAFLD的特征是肝內(nèi)脂肪細(xì)胞過(guò)度沉積[3]，現(xiàn)已成為世界上最常見(jiàn)的慢性肝病，占全球總?cè)丝诘?/4[4]。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，其膳食結(jié)構(gòu)逐漸從以植物性食物為主的飲食轉(zhuǎn)變?yōu)橐詣?dòng)物性食物為主的高熱量高脂肪含量飲食[5]。由于飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD的發(fā)病率逐漸提高，對(duì)人類健康造成了極大的危險(xiǎn)[6]。因此改善脂代謝紊亂和肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積對(duì)預(yù)防和治療NAFLD至關(guān)重要。

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）屬于N-3多不飽和脂肪酸家族中的重要成員，廣泛存在在魚(yú)、蝦、蟹、海藻等海洋生物中，深海魚(yú)油中的DHA尤為豐富。DHA主要有甲酯、乙酯（Ethyl ester，EE）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、磷脂等四種類型，目前市售的DHA主要是乙酯型和甘油三酯型[7]。TG-DHA無(wú)論是對(duì)人體代謝吸收率，生物利用率還是安全性都明顯優(yōu)于EE-DHA[8]。很多文獻(xiàn)都曾報(bào)道富含DHA的深海魚(yú)油具有降脂減肥，調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，抗炎，抗癌等生物活性[9]。Kembra[10]等人的研究表明DHA可以通過(guò)調(diào)控高脂飲食小鼠脂肪酸合成基因及脂肪酸氧化分解相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。LIU[11]等人發(fā)現(xiàn)DHA可以在一定程度上改善長(zhǎng)期高脂飲食導(dǎo)致的非酒精性脂肪肝。但魚(yú)油屬于脂溶性物質(zhì)，難以在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)直接消化吸收。有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)乳化后的魚(yú)油比天然更易吸收，且能顯著增加血漿中的DHA含量[12]。但乳化后的魚(yú)油仍然有令人難以接受的腥味物質(zhì)，這在很大程度上限制了魚(yú)油產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用[13]。目前市面上大多是DHA微膠囊，所用壁材一般為蛋白質(zhì)和明膠，包埋率僅為10%左右，溶于水后仍然有魚(yú)腥味[14]。很多文獻(xiàn)都曾報(bào)道，脂質(zhì)體可以掩蓋魚(yú)油腥味，且消化吸收特性，抗氧化性能等更佳[15-17]。Xiaodan[18]等人的研究表明DHA脂質(zhì)體可以通過(guò)上調(diào)CPT-1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)；下調(diào)FAS的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)來(lái)降低HepG2細(xì)胞甘油三酯沉積。Mengru[19]等人的研究發(fā)現(xiàn)，DHA脂質(zhì)體可以通過(guò)肝臟脂解和膽固醇外排抑制非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂質(zhì)沉積。目前大多數(shù)的研究主要集中在DHA脂質(zhì)體的制備，對(duì)其生物活性的探究相對(duì)較少，尤其是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平上研究DHA脂質(zhì)體對(duì)脂代謝調(diào)控的報(bào)道更是少之又少。大大影響了魚(yú)油精深產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用。

本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以DHA脂乳劑作對(duì)照，綜合探究DHA脂質(zhì)體對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié)作用，為深海魚(yú)油高附加值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

10/70 TG-DHA金槍魚(yú)油，浙江舟山新諾佳生物技術(shù)有限公司；98%大豆磷脂酰膽堿（98% PC），西安艾諾醫(yī)藥科技有限公司；人肝癌HepG2細(xì)胞，上海生工生物工程有限公司；SPF級(jí)6周齡雄性C57BL/6J小鼠，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司（許可證號(hào)：SPXY2019042001）；甘油三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total Cholesterol，TC）試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；脂肪酸合成酶（FAS）、蘋果酸酶（ME）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT-1）、脂蛋白酯酶（LPL）ELISA試劑盒，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；豬膽鹽，索萊寶生物科技有限公司；油酸（OA）、棕櫚酸（PA），美國(guó)Sigma公司；TRIZOL試劑，美國(guó)Invitrogen公司；RNA純化試劑盒，天根生化科技有限公司；5X All-In-One RT裂解反轉(zhuǎn)錄一體試劑盒，abm；EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix，abm；10%低脂飼料（飼料代碼TP23522）、45%高脂飼料（飼料代碼TP23220），南通特洛菲飼料科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Model680型酶標(biāo)儀，美國(guó)BioRAD產(chǎn)品；Agilent7820型氣相色譜儀，美國(guó)Agilent科技公司；19091N-113型HP-INNOWAX石英毛細(xì)管柱，美國(guó)Agilent科技公司；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；IQ5 Realtime PCR儀，美國(guó)Bio-RAD；NIKON/Ni-E電子熒光顯微鏡，南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DHA脂質(zhì)體及DHA脂乳劑的制備

將一定比例的10/70 TG-DHA金槍魚(yú)油和98%大豆磷脂酰膽堿溶解于95%食用酒精中，將其放置在磁力攪拌器上直至大豆磷脂酰膽堿完全溶解。然后在40 ℃，100 r/min條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、減壓濃酸除有機(jī)試劑。室溫冷卻30 min，加超純水洗膜，最后過(guò)200 nm聚碳酸酯膜，得到的白色乳狀液體即為DHA脂質(zhì)體乳狀液。

向適量10/70 TG-DHA金槍魚(yú)油中加入超純水，之后加入0.5%豬膽鹽作為乳化劑，然后不斷振蕩混勻，超聲細(xì)胞破碎儀均質(zhì)2 min，制成均一的牛奶狀乳液，即為DHA脂乳劑[20]。

1.3.2 脂肪酸組分檢測(cè)

前處理（甲酯化）：分別取5 mg脂質(zhì)體/脂乳劑樣品和500 μg十九碳酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品置于甲酯化試管中，用氮?dú)獯蹈稍嚬苤械挠袡C(jī)試劑。向試管中加入2 mL HCl：甲醇（1:5V/V）溶液，充入氮?dú)饬⒓磾Q緊管口，然后將試管置于90 ℃金屬浴中加熱1 h。將其冷卻至室溫，向其中加入2 mL正己烷，充分混勻，室溫靜止直至液體分層。取上層溶液1 μL進(jìn)行氣相色譜分析[21]。

GC分析：載氣為為高純氮?dú)?，進(jìn)樣口采用分流模式（20:1）所用柱子為Supelcowax石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。柱箱初溫170 ℃，以5 ℃/min的速度升溫至240 ℃，平衡時(shí)間為1 min。檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），進(jìn)樣口溫度為260 ℃，檢測(cè)器溫度為260 ℃，氫氣流量30 mL/min，空氣流量400 mL/min，氮?dú)馕泊盗髁浚?5 mL/min[22]。

GC數(shù)據(jù)分析：根據(jù)脂肪酸甲酯混標(biāo)的出峰時(shí)間定性分析樣品中脂肪酸組分。采用面積歸一法，定量計(jì)算樣品脂肪酸組分百分比。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

本實(shí)驗(yàn)選用人肝癌HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)基選用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在含5% CO2，濕度為100%的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。當(dāng)12孔板細(xì)胞密度長(zhǎng)滿70%～80%時(shí)，將其分為四組：空白對(duì)照組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組：含有1 mmol/L游離脂肪酸（油酸（OA）:棕櫚酸（PA）=2:1）混合物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后轉(zhuǎn)移至正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h[23]；DHA脂乳劑組：含有1 mmol/L游離脂肪酸混合物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，使用濃度為40 μg/mL的DHA脂乳劑干預(yù)48 h；DHA脂質(zhì)體組：含有1 mmol/L游離脂肪酸混合物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，使用濃度為40 μg/mL的DHA脂質(zhì)體干預(yù)48 h。

1.3.4 油紅O染色觀察肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積情況

等到各組細(xì)胞消化后，收集細(xì)胞。4%多聚甲醛固定液固定20 min，PBS請(qǐng)2次，雙蒸水漂洗3次后空氣曬干；待切片干燥后，將切片置于油紅工作液中染色1 h；70%乙醇漂洗3次；在光學(xué)顯微鏡下觀察油紅染色后的陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.5 HepG2細(xì)胞TG、TC含量測(cè)定

等到各組細(xì)胞消化后，收集細(xì)胞。試劑盒法檢其TG、TC含量，具體方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.6 Real-Time PCR檢測(cè)脂代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量

等各組細(xì)胞消化后，收集各組細(xì)胞。Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA完整性。通過(guò)測(cè)定溶液吸光值A(chǔ)260 nm/A280 nm比值確定所得RNA的純度，比值1.8～2.0時(shí)用于下一步實(shí)驗(yàn)。按照5X All-In-One RT裂解反轉(zhuǎn)錄一體試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，具體方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。按照EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix試劑盒說(shuō)明書(shū)在冰上配置20 μL反應(yīng)體系，該體系包括2×MasterMix 10 μL，PCR Forward、Reverse Primer各0.6 μL，cDNA溶液4 μL，無(wú)菌水4.8 mL。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，使用IQ5型熒光定量PCR儀進(jìn)行測(cè)定，擴(kuò)增條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，20 s，95 ℃，15 s（45個(gè)循環(huán)）；65 ℃升溫至95 ℃（0.5 ℃/10 s），內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT法計(jì)算[24]。引物由上海生工生物工程有限公司合成；引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.7 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組

30只SPF級(jí)的雄性C57BL/6J小鼠暫養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分為四組，對(duì)照（C）組，模型（M）組，DHA脂乳劑（O-DHA）組，DHA脂質(zhì)體（L-DHA）組，除C組喂養(yǎng)10%低脂飼料，其他組均喂養(yǎng)45%高脂飼料。4周后開(kāi)始灌胃，O-DHA組灌胃DHA脂乳劑，L-DHA組灌胃DHA脂質(zhì)體，C組和M組均灌胃生理鹽水作對(duì)照，灌胃劑量1000 mg/(kg·bw)。飼養(yǎng)環(huán)境為普通環(huán)境，單籠單只，室溫23±2 ℃，濕度55%～58%，12 h/12 h光暗循環(huán)，飼養(yǎng)期間所有動(dòng)物均自由攝食和飲水。12周后，摘眼球取血脫頸椎處死小鼠，取小鼠肝臟、脂肪等組織稱重并于-80 ℃冰箱保存。

1.3.8 小鼠生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

1.3.9 免疫組化測(cè)定蛋白表達(dá)量

取上述脂肪組織切片，全自動(dòng)脫水浸蠟處理，將浸好蠟塊的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋，將修整好的蠟塊用石蠟切片機(jī)切成厚4 μm的切片。石蠟切片脫蠟至水，置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH 6.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。血清封閉，加入一抗，二抗，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，電子熒光顯微鏡下觀察。

蛋白表達(dá)量的測(cè)定使用Image-Pro Plus 6.0軟件選取蛋白陽(yáng)性染色區(qū)域，計(jì)算面密度：面密度=IOD/待測(cè)區(qū)域組織面積（IPP）。

1.3.10 肝臟脂代謝相關(guān)酶活力測(cè)定

取各組小鼠肝臟溶于生理鹽水中，勻漿、離心取上清液。試劑盒法檢測(cè)各組小鼠脂肪合成酶（FAS）、蘋果酸梅（ME）、脂蛋白酯酶（LPL）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT-1）等肝臟脂代謝相關(guān)酶活力，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，結(jié)果以ˉx±SD表示；所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以p＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 DHA脂質(zhì)體和DHA脂乳劑中脂肪組分檢測(cè)

由表2可以看出，與DHA脂乳劑相比，DHA脂質(zhì)體中的C16:0、C17:0、C18:0、C18:1、C18 2n-6等顯著增多（p＜0.05）。而C20 4n-6，EPA，C23:0，C24:0，DHA等顯著減少（p＜0.05）。但兩種魚(yú)油的總飽和脂肪酸與總不飽和脂肪酸并無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。氣相色譜法檢測(cè)到TG-DHA脂乳劑中的DHA含量高達(dá)76.87%，而TG-DHA脂質(zhì)體中的DHA含量為73.74%，因此在灌胃時(shí)根據(jù)兩種形式魚(yú)油中的DHA含量控制了實(shí)驗(yàn)小鼠的灌胃劑量，保證O-DHA組與L-DHA組小鼠攝入DHA量一致。

表2 兩種形式DHA脂肪酸組分檢測(cè)Table 2 Determination of fatty acid components in two forms of DHA

2.2 DHA脂質(zhì)體對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響

最新研究表明，NAFLD的發(fā)生和發(fā)展是由肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗等多種因素造成的[25,26]。其中脂質(zhì)蓄積是NAFLD形成的危險(xiǎn)誘因[27]。Lu[28]等人的研究表明，DHA-PC可顯著降低游離脂肪酸可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞TG、TC含量的升高，降低HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積。由圖1a/b可見(jiàn)，與空白（C）組相比，模型（M）組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)TC（增約4.75倍），TG（增約16.41倍）含量顯著增加（p＜0.05）。油紅O染色是觀察肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的經(jīng)典方法之一，由圖1c可見(jiàn)，與C組相比，M組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集顯著增多。與M組比較，L-DHA組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)TC、TG含量均顯著降低（p＜0.05），分別降低了62.91%和48.73%。且與O-DHA組相比，L-DHA顯著降低了細(xì)胞內(nèi)的TC含量（降低約49.56%）（p＜0.05）。相比于DHA脂乳劑，DHA脂質(zhì)體改善細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用更加顯著。

圖1 DHA脂質(zhì)體對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響Fig.1 DHA liposomes on lipid deposition in HepG2 cells

2.3 DHA脂質(zhì)體對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因的影響

FAS是細(xì)胞內(nèi)催化脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，SREBP-1是脂質(zhì)代謝重要的核轉(zhuǎn)錄因子。Kembra[29]等人發(fā)現(xiàn)n-3 PUFA可通過(guò)降低FAS，PPAR-α等與脂肪酸合成相關(guān)的mRNA表達(dá)改善游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂代謝紊亂。各組細(xì)胞中脂代謝關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示，與C組比較，M組細(xì)胞FAS（增加約7.32倍），SREBP-1（增加約13.22倍）的mRNA表達(dá)水平顯著升高（p＜0.05）（見(jiàn)2a/b）。與M組相比，L-DHA組FAS（48.62%），SREBP-1（38.53%）的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（p＜0.05）。且與O-DHA組比較，L-DHA組FAS（39.76%），SREBP-1（33.77%）的mRNA表達(dá)水平也均顯著降低（p＜0.05）。表明相比于DHA脂乳劑，DHA脂質(zhì)體對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂代謝紊亂的改善作用更加顯著。

圖2 DHA脂質(zhì)體對(duì)HepG2細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因的影響Fig.2 DHA liposomes on lipid metabolism related genes in HepG2 cells

2.4 DHA脂質(zhì)體對(duì)高脂飲食小鼠體質(zhì)量的影響

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明DHA脂質(zhì)體改善游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用更加顯著。長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的能量攝入大于能量消耗，多余的能量會(huì)以脂肪的形式貯存在體內(nèi)，最終導(dǎo)致脂代謝紊亂[30]。接著我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究DHA脂質(zhì)體對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié)作用。各組小鼠1～12周體質(zhì)量如圖3a所示，在第72～84 d，M組小鼠體重顯著高于C組和L-DHA組。BMI作為身體質(zhì)量指數(shù)，通過(guò)用來(lái)衡量機(jī)體胖瘦程度以及是否健康的一個(gè)指標(biāo)[31]。如圖3b所示，與C組相比，M組小鼠BMI（增約18.22%）顯著升高（p＜0.05），而DHA脂乳劑和DHA脂質(zhì)體的攝入，顯著降低了高脂飲食導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)小鼠BMI升高（p＜0.05），分別降低約11.10%和10.40%。從圖3a飼養(yǎng)期間實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化來(lái)看，相比于DHA脂乳劑，DHA脂質(zhì)體降低高脂飲食小鼠體質(zhì)量的作用更加明顯。

圖3 DHA脂質(zhì)體對(duì)高脂飲食小鼠體質(zhì)量的影響Fig.3 DHA liposomes on body weight of high fat diet mice(n=10)

2.5 DHA脂質(zhì)體對(duì)高脂飲食小鼠內(nèi)臟脂肪堆積的影響

長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致脂代謝紊亂，造成體重增加，脂肪堆積[32]。由圖4可見(jiàn)，高脂飲食飼養(yǎng)的M組（其中附睪脂肪增約34.43%，腎周脂肪增約68.50%小鼠的內(nèi)臟脂肪含量顯著高于正常組（p＜0.05）。與M組相比，DHA脂乳劑和DHA脂質(zhì)體的攝入均降低了高脂飲食小鼠內(nèi)臟脂肪含量，其中DHA脂質(zhì)體顯著降低了高脂飲食小鼠附睪脂肪含量14.26%（p＜0.05）。

圖4 DHA脂質(zhì)體對(duì)高脂飲食小鼠內(nèi)臟脂肪堆積的影響Fig.4 DHA liposomes on visceral fat accumulation in mice fed with high-fat diet

2.6 DHA脂質(zhì)體對(duì)高脂飲食小鼠脂代謝相關(guān)蛋白的影響

前期我們檢測(cè)了各組實(shí)驗(yàn)小鼠脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DHA脂質(zhì)體和DHA脂乳劑均可以下調(diào)高脂飲食小鼠FAS的mRNA表達(dá)，上調(diào)CPT-1的mRNA表達(dá)。因此我們又檢測(cè)了這兩種酶的蛋白表達(dá)。

免疫組織化學(xué)染色法通常用來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)量，如圖5a/b所示,與C組相比，M組小鼠FAS蛋白大量表達(dá)，增加了約87.57%。而DHA脂質(zhì)體和DHA脂乳劑的攝入均顯著降低了FAS的蛋白表達(dá)量（p＜0.05），分別降低了74.29%和47.10%。由圖5a/c可見(jiàn)，與C組相比，CPT-1在M組小鼠體內(nèi)蛋白表達(dá)量減少（減少約35.39%）（p＞0.05），而DHA脂質(zhì)體的攝入顯著增加了CPT-1（增加約1.7倍）蛋白表達(dá)（p＜0.05）。

圖5 DHA脂質(zhì)體對(duì)高脂飲食小鼠脂代謝相關(guān)蛋白的影響Fig.5 DHA liposomes on lipid metabolism related proteins in mice fed with high-fat diet (n=10)

2.7 DHA脂質(zhì)體對(duì)高脂飲食小鼠脂代謝相關(guān)酶活力的影響

肝臟是人體內(nèi)脂肪合成的重要場(chǎng)所。脂肪酸合成酶是脂肪酸合成過(guò)程中的限速酶，蘋果酸酶是催化蘋果酸生成丙酮酸的酶，這兩種都是促進(jìn)脂肪酸合成的酶[33]。由圖6a/b可見(jiàn)，與C組相比，M組小鼠FAS（58.50%）、ME（11.92%）酶活性顯著升高（p＜0.05），而DHA脂質(zhì)體和DHA脂乳劑的攝入均顯著降低了高脂飲食導(dǎo)致的FAS（DHA脂質(zhì)體降低約30.33%，DHA脂乳劑降低約24.28%）、ME（DHA脂質(zhì)體降低約11.79%，DHA脂乳劑降低約9.24%）酶活力的升高（p＜0.05）。肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶是脂肪酸β-氧化過(guò)程中的限速酶。脂蛋白酯酶是促進(jìn)脂肪酸分解成甘油三酯的酶[34]。由圖6c/d可見(jiàn)，與C組相比，高脂飲食會(huì)抑制M組實(shí)驗(yàn)小鼠CPT-1（2.58%）、LPL（0.43%）酶活力，而DHA脂質(zhì)體和DHA脂乳劑的攝入均促進(jìn)了這兩種酶的活力（p＜0.05）。其中DHA脂質(zhì)體升高高脂飲食小鼠肝臟內(nèi)CPT-1，LPL的濃度分別約10.08%，15.12%，DHA脂乳劑升高高脂飲食小鼠肝臟內(nèi)CPT-1，LPL的濃度約18.95%，7.02%。Liu X，Joseph等人也發(fā)現(xiàn)DHA可以通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠肝臟中脂肪酸合成和氧化分解相關(guān)酶活力，從而調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)脂代謝[35,36]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DHA脂質(zhì)體和DHA脂乳劑均可以通過(guò)抑制脂肪酸酸合成相關(guān)酶活力，升高脂肪酸分解和β氧化相關(guān)酶活力，改善高脂飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂。

圖6 DHA脂質(zhì)體對(duì)高脂飲食小鼠脂代謝相關(guān)酶活性的影響Fig.6 DHA liposomes on activities of lipid metabolism related enzymes in mice fed with high-fat diet (n=10)

3 結(jié)論

本研究首先利用游離脂肪酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積，觀察DHA脂質(zhì)體和DHA脂乳劑對(duì)HepG2細(xì)胞的改善作用。結(jié)果表明DHA脂質(zhì)體和DHA脂乳劑均對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積具有一定的改善作用，其中DHA脂質(zhì)體的作用效果更加明顯，DHA脂質(zhì)體顯著降低了HepG2細(xì)胞TG，TC含量以及FAS，SREBP-1的mRNA表達(dá)。其次采用高脂飼料建立高脂飲食小鼠模型，觀察DHA脂質(zhì)體和DHA脂乳劑對(duì)高脂飲食小鼠脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一樣，DHA脂質(zhì)體對(duì)高脂飲食小鼠脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用更佳。DHA脂質(zhì)體顯著降低了高脂飲食小鼠體質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪堆積。顯著降低了FAS的蛋白表達(dá)，增加了CPT-1的蛋白表達(dá)，這與我們之前的基因檢測(cè)結(jié)果一致。另外DHA脂質(zhì)體顯著抑制了高脂飲食小鼠FAS，ME等脂肪酸合成相關(guān)酶活力，顯著促進(jìn)了CPT-1，LPL等脂肪酸氧化分解相關(guān)酶活力。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)綜合探究，比較DHA脂質(zhì)體和DHA脂乳劑對(duì)脂代謝紊亂的調(diào)劑作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于DHA脂乳劑，DHA脂質(zhì)體改善脂代謝紊亂的作用更加顯著。本研究有望促進(jìn)魚(yú)油精深產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。