聶曉霞，王翠香

（石家莊理工職業(yè)學(xué)院健康與公共衛(wèi)生學(xué)院，河北石家莊 050000）

葛根在我國分布廣泛，主要盛產(chǎn)與湖南、廣西及廣東等地，生于路旁、山坡草叢以及疏林中較陰濕處的藤狀植物。黃酮苷是其主要活性成分，具有降低心肌耗氧量、活血化瘀、改善微循環(huán)等作用。葛根素是從葛根的干燥根中提取的一種異黃酮類化合物，屬于植物雌激素類[1,2]。葛根具有解肌退熱、生津止渴及升陽止瀉等功效，現(xiàn)代醫(yī)理學(xué)指出，葛根素提取物具有改善血液循環(huán)、抗氧化應(yīng)激、降糖、保護(hù)神經(jīng)以及抗過敏的作用，已廣泛用于多種疾病[3]。妊娠期糖尿病是妊娠期首次被發(fā)現(xiàn)的糖耐量降低現(xiàn)象，可導(dǎo)致胎膜早破、先兆性子癇以及早產(chǎn)的幾率明顯增加，母嬰的健康受到嚴(yán)重的危害[4,5]。

葛根素提取物可通過抑制樹突狀細(xì)胞的功能使T淋巴細(xì)胞的增體殖與分化能力受力抑制，有效抑制免疫炎癥反應(yīng)，還可對細(xì)胞免疫功能具有促進(jìn)作用，可使主要吞噬碳粒的脾臟、肝臟碳粒攝取功能增強(qiáng)[6]。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于尿酸排泄減少或嘌呤代謝紊亂引起的，葛根素可通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性，減少尿酸的生成[7]。葛根素提取物可抑制XO的活性，可增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基與總抗氧化的能力，抗炎作用較強(qiáng)[8]。

炎癥是機(jī)體常見的一種重要的基本病理過程，是機(jī)體對致炎因子的損傷作用產(chǎn)生的一種反應(yīng)，也是機(jī)體與致病因素斗爭的一種防御性反應(yīng)[9,10]。妊娠期糖尿病的發(fā)病較為復(fù)雜，目前研究顯示，其重要的發(fā)病機(jī)制為抗氧化能力下降[11]。氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致組織或細(xì)胞受損，抗氧化系統(tǒng)失衡。因此尋找一種拮抗氧化應(yīng)激損傷的藥物尤為重要。目前有較少文獻(xiàn)報(bào)道抗氧化劑對妊娠期糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，一般研究為抗氧化劑對妊娠期糖尿病大鼠的抗氧化、抗炎作用。本文將研究葛根素提取物對妊娠期糖尿病模型大鼠氧化應(yīng)激的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康、雌性、清潔級大鼠50只，年齡8～10周，平均年齡（8.5±0.4）周，體重205～230 g，平均體重（216±15）g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物批準(zhǔn)文號（SCXK甘2011-0001），所有大鼠實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性飼養(yǎng)在中科院動(dòng)物飼養(yǎng)中心，且經(jīng)中科院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

ELISA檢測試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根素提取

將葛根粉碎后過10目篩，稱取定量的葛根粉，置于提取罐中，過濾，回流提取1～1.5 h用濃度為95%乙醇或甲醇或其質(zhì)量4倍體積的蒸餾水作溶劑；再次過濾，使用2倍體積的上述溶劑將濾渣回流提取1 h，兩次濾液收集、合并，獲得葛根素粗提液。

1.3.2 葛根素的濃縮及提純

1.3.2.1 濃縮與上柱

將醇提取液置于真空濃縮器中，濃縮溫度為85～90 ℃，真空度控制為-0.1～0.08 MPa，回收乙醇或甲醇。應(yīng)吸附的提取液體積按照其對葛根素的吸附容量計(jì)算出，將提取液泵入取定量活化D101大孔吸附樹脂裝柱中，1～1.5倍樹脂柱體積/h為控制流出液速度，是葛根素吸附于D101吸附樹脂上。

1.3.2.2 洗脫及濃縮

在流完后上柱液，先用蒸餾水洗滌，將鞣質(zhì)水溶性雜質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類洗去，當(dāng)洗脫液近無色時(shí)停止，洗脫使用70%的乙醇溶液，使用12倍樹脂體積的洗脫液，1～1.5倍樹脂柱體積/h為流出速度，即可洗脫被樹脂吸附的85%以上的葛根素。洗脫液置于真空濃縮機(jī)中，維度為85～90 ℃，真空度控制為-0.1～0.08 MPa，濃縮至密度為1.2 h。

1.3.2.3 萃取、提純

濃縮液置于萃取器中，加入等體積的正丁醇，反復(fù)4次，再次進(jìn)行真空減壓濃縮至干，獲得葛根素粗提取物；將提取物再次用有機(jī)溶劑溶解，進(jìn)行重結(jié)晶，獲得高濃度產(chǎn)品。

1.3.2.4 樣品的含量測定

精密稱取樣品相當(dāng)于葛根素提取物10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得供試品溶液，分別點(diǎn)樣1 μL于高效硅膠板上，上行展開。在255 nm處測定，其含量為20.23%。取葛根藥材，精密稱定1 g，按供試品溶液制備方法制成樣品，依法測定。

1.3.3 妊娠期糖尿病模型建立

將雌性大鼠與雄性大鼠按照1:1合籠過夜，次日使用陰道涂片鏡觀察精子確定為孕鼠，一周后50 mg/kg鏈脲佐菌素經(jīng)腹腔注射，三天后檢測空腹血糖在13.0 mmol/L以上，確認(rèn)為造模成功。

1.3.4 分組及葛根素提取物干預(yù)

建模成功，將大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、葛根素低劑量組、葛根素中劑量組及葛根素高劑量組，各10只。模型組大鼠給予生理鹽水；二甲雙胍組給予200 mg/kg；葛根素低劑量組給予葛根素提取物80 mg/kg；葛根素中劑量組給予葛根素提取物120 mg/kg；葛根素高劑量組給予葛根素提取物160 mg/kg。

1.3.5 空腹血糖（FPG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平檢測

采用血糖儀檢測FPG水平；采用全自動(dòng)生化分析儀檢測HDL-C及LDL-C水平。

1.3.6 丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、白介素-6（IL-6）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平檢測

采用ELISA檢測，緩沖液稀釋50 mM碳酸鹽包MDA、NO、SOD、IL-6、CRP及TNF-α抗原，之后添加到聚苯乙烯的反應(yīng)板孔中，放置24 h溫度4 ℃，次日洗滌劑洗滌3次后，拋干。在各孔中加入稀釋液稀釋的待測標(biāo)本0.1 mL，同時(shí)加入陽性和陰性的對照標(biāo)本，42 ℃放置60 min，將液體移除洗滌3次后，拋干。在各孔中加入MDA、NO、SOD、IL-6、CRP及TNF-α的酶標(biāo)抗體0.1 mL，43 ℃放置60 min。液體移去，洗滌3次，拋干。在各個(gè)空中加入0.1 mol/L的Na2HPO4，0.05 mol/L的枸櫞酸滴液混勻，再加入0.1 mL鄰苯二胺，遮光處理20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 mL，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測405，分析MDA、NO、SOD、IL-6、CRP及TNF-α水平。

1.3.7 Western blot檢測醌氧化還原酶1（NQO1）、血紅素氧合酶-1（HO-1）及核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor E2 related factor 2）Nrf2蛋白

將所采集到的所有標(biāo)本，進(jìn)行研磨，然后加入蛋白緩沖液，常規(guī)蛋白提取，BCA法定量分析。50 μg蛋白樣品上樣后SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)到PVDF膜，在TBST中將5%的脫脂奶粉避光封閉1 h，洗滌后加入（稀釋比為1:1000）的NQO1、HO-1及Nrf2單克隆抗體稀釋溶液，在4 ℃的環(huán)境中保存過夜，洗滌后加入（稀釋比為1:5000）的NQO1、HO-1及Nrf2單克隆抗體稀釋溶液，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入發(fā)光液ECL，使軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白是GAPDH。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）描述，三組數(shù)據(jù)比較采用F值檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 葛根中葛根素及總黃酮含量測定

黃酮類物質(zhì)在大自然中分布非常廣泛，其主要存在與植物的葉子以及果實(shí)中，葛根不僅能當(dāng)成營養(yǎng)非常豐富的食物使用，還是中醫(yī)藥材。本文研究顯示，葛根中葛根素含量為20.23%，總黃酮量為12.64%。

表1 葛根中葛根素及總黃酮含量測定Table 1 Determination of puerarin and total flavonoids in Pueraria lobata

2.2 四組大鼠FPG、HDL-C及LDL-C水平比較

HDL-C能夠協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇而代謝為膽汁酸，對身體有利[12]。LDL-C是導(dǎo)致心肌梗死的危險(xiǎn)因子，能夠損害血管內(nèi)皮。妊娠期糖尿病不僅要控制血糖，還要抑制自由基損傷，調(diào)節(jié)血脂。葛根素提取物具有明顯的抗氧化、抗炎、抗凋亡以及降血脂等多種作用，是傳統(tǒng)中藥葛根中的主要有效成分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素高劑量組FPG為6.72 mmol/L、HDL-C為0.72 mmol/L及LDL-C為0.67 mmol/L較模型組、葛根素低劑量組、葛根素中劑量組FPG 13.67 mmol/L、HDL-C 0.63 mmol/L、LDL-C 1.01 mmol/L明顯改善。劉奇云等相關(guān)研究[13]，葛根素低劑量為70 mg/kg，中劑量為120 mg/kg，高劑量為170 mg/kg，低劑量組與本文相比較高，中劑量組與本文相同，高劑量組比本文高；葛根素提取物干預(yù)后，葛根素中計(jì)量組FPG為7.05 mmol/L，葛根素提取物可提高胰島素受體細(xì)胞敏感性、降血糖及增強(qiáng)免疫力等作用，本文研究結(jié)果與其保持一致。

表2 四組大鼠FPG、HDL-C及LDL-C水平比較Table 2 Comparison of FPG, HDL-C and LDL-C levels in rats between groups (x±s)

表3 四組大鼠MDA、NO及SOD水平比較Table 3 Comparison of MDA, NO and SOD levels in rats between groups (x±s)

表4 四組大鼠IL-6、CRP及TNF-α水平比較Table 4 Comparison of IL-6, CRP and TNF-α levels in rats between groups（x±s）

2.3 四組大鼠MDA、NO及SOD水平比較

MDA是間接反應(yīng)氧自由基的存在及對細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)，其水平能夠反映組織損傷的程度[14]。NO可參與機(jī)體的病理、生理調(diào)節(jié)，氧化應(yīng)激條件下，NO過表達(dá)，是肝血管受損，破壞血管內(nèi)外動(dòng)態(tài)平衡。本文中，葛根素高劑量組MDA為5.21 nmol/mg、NO為72.13 μmol/L及SOD為12.53 U/mg較模型組、葛根素低劑量組、葛根素中劑量組明顯改善。SOD是抗氧化酶防御體系中的關(guān)鍵酶，具有保護(hù)細(xì)胞不收自由基的損害[15]。葛根素提取物與可善微循環(huán)，擴(kuò)張外周血管、活血化瘀作用相關(guān)。李會(huì)柏等相關(guān)研究結(jié)果顯示[16]，妊娠期糖尿病大鼠葛根素干預(yù)后MDA為5.67 nmol/mg、SOD為10.9 U/mg；葛根素提取物對妊娠期糖尿病模型大鼠具有保護(hù)作用，有效抑制肝組織病變、降低大鼠血糖、改善肝功能。葛根素提取物可圍繞提高抗氧化活性與改善其溶解性方面，具有抗炎的作用。其中葛根素中劑量組為最佳濃度。

2.4 四組大鼠IL-6、CRP及TNF-α水平比較

IL-6是一種多功能的炎性因子，可刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞分化與增殖，在免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮重要的作用，具有誘導(dǎo)急性期反應(yīng)分子并刺激肝細(xì)胞。CRP主要由肝臟產(chǎn)生，是一種炎癥急性期的反應(yīng)蛋白，其在正常機(jī)體中相對較少，參與局部或全身的炎癥反應(yīng)。TNF-α是一種促炎因子，刺激中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞活化，引起炎癥反應(yīng)，是啟動(dòng)炎性因子級聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子。本文研究結(jié)果顯示，葛根素高劑量組IL-6為128.19 ng/L、CRP為4.06 mg/L及TNF-α為10.13 μg/μL水平低于模型組、葛根素低劑量組、葛根素中劑量組，具有差異。冷超[17]等相關(guān)研究，使用葛根素劑量為250 mg/kg，與本文相比所使用劑量較高，葛根素干預(yù)后，妊娠期糖尿病大鼠CRP為7.03 mg/L、TNF-α為14.16 ng/mL。葛根素提取物可激活大量的吞噬細(xì)胞，使T淋巴細(xì)胞的分化與增殖能力受到限制，提高吞噬細(xì)胞的吞噬功能，抑制免疫炎癥反應(yīng)[18]。葛根素主要是表現(xiàn)在對促炎因子的抑制與對抗炎因子的促進(jìn)方面，起到發(fā)揮抗炎作用。

3 結(jié)論

葛根素提取物可降低空腹血糖，通過增強(qiáng)SOD的活性，提高胰島素受體細(xì)胞敏感性、降血糖及增強(qiáng)免疫，改善肝功能等作用。同時(shí)，葛根素提取物具有降低炎癥反應(yīng)的作用，可影響妊娠期糖尿病模型大鼠白介素系統(tǒng)，抑制免疫炎癥反應(yīng)。